Large-scale proteomics analysis of the human kinome

doi:10.1074/mcp.M800588-MCP200

.2009年7月；8(7):1751-64.

doi:10.1074/mcp。M800588-MCP200。 Epub 2009年4月15日。

人类激肽组的大规模蛋白质组学分析

费利克斯·S·奥伯曼¹, 弗洛里安侏儒, 杰斯珀·V·奥尔森, 雷娜特·霍恩伯格, 佐尔坦·格雷夫, 吉尔吉斯·凯里, 马蒂亚斯·曼, 亨利克·达布

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人类激肽组的大规模蛋白质组学分析

费利克斯·S·奥珀曼等。分子细胞蛋白质组学. 2009年7月.

.2009年7月；8(7):1751-64.

doi:10.1074/mcp。M800588-MCP200。 Epub 2009年4月15日。

作者

费利克斯·S·奥珀曼¹, 弗洛里安侏儒, 杰斯珀·V·奥尔森, 雷娜特·霍恩伯格, 佐尔坦·格雷夫, 吉尔吉斯·凯里, 马蒂亚斯·曼, 亨利克·达布

附属

¹德国马丁斯里德马克斯·普朗克生物化学研究所分子生物学系。

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摘要

人类蛋白激酶超家族成员是参与真核细胞信号转导途径活性控制的主要调节酶。由于蛋白激酶位于基于磷酸化的信号传递节点，对其细胞表达和位点特异性磷酸化的综合分析可以为信号网络的结构和功能提供重要的见解。然而，在全球蛋白质组研究中，蛋白激酶的低细胞丰度常常导致较小的肽物种被其他细胞蛋白质的大量过剩肽所阻断。这些分析局限性为质谱分析之前蛋白激酶的基因体广泛富集提供了理论依据。在这里，我们使用细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC），通过定量质谱法比较三种激酶选择性亲和树脂的结合特性。评估的预分馏工具将吡啶[2,3-d]嘧啶基激酶抑制剂作为固定化捕获配体，并保留了相当多的人类激酶亚群。基于这些结果，使用显示宽选择性激酶配体VI16832的亲和树脂来量化三种不同的SILAC编码的癌细胞系中170多种蛋白激酶的相对表达。这些实验证明了在紧凑的实验格式中比较基因体轮廓的可行性。有趣的是，与贴壁癌细胞HCT116和MDA-MB-435S相比，我们在MV4-11白血病细胞中发现了高水平的细胞质酪氨酸激酶和低水平的受体酪氨酸激酶。VI16832树脂被进一步用于预分馏激酶，用于靶向磷酸蛋白质组学分析，该分析揭示了200多种蛋白激酶上约1200个不同的磷酸化位点。这一迄今为止最大规模的跨激酶体的位点特异性磷酸化调查极大地拓展了蛋白激酶调节功能性后续研究的基础。总之，这里描述的简单实验程序使激酶选择性蛋白质组学的不同实现具有相当大的潜力，可用于未来的信号转导和激酶药物靶点分析。

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数字

**图1。**
**通过定量化学蛋白质组学比较抑制剂树脂。** A类，吡啶[2,3的化学结构-d日]嘧啶类抑制剂用作蛋白激酶富集的亲和捕获试剂。氨基（标记为箭头)用于固定在Sepharose珠上。BSILAC方案和工作流程，用于对MV4–11细胞提取物中不同抑制剂树脂富集的细胞蛋白进行比较定量MS分析。C类，来自激酶抑制剂树脂或对照树脂的洗脱组分的等分(*Ctrl键*)用SDS-PAGE和银染法分析了不含固定化配体的ECH-Sepharose。

**图2。**
**富含三种不同吡啶[2,3的蛋白激酶的定量分析-d日]嘧啶配体。** A类基于SILAC的独特肽定量质谱测定了与亲和树脂结合的相对蛋白激酶。对于三对树脂的比较，两个独立实验的平均比率以对数标度（log₂)用于所有蛋白激酶。B、MV4–11细胞裂解物和洗脱蛋白的等分样品，从与指示的抑制剂树脂或对照培养物的孵育中获得(*Ctrl键*)用SDS-PAGE分离小球，并用识别激酶CDC2、CK1α、FAK、Fes、HCK、PLK1和Syk的抗体进行免疫印迹。为了进行比较，显示了根据定量MS分析得出的相对激酶结合比率。C类，由于SILAC编码，HCK肽被检测为三联体的MS光谱。交换SILAC标记后，在重复实验中相对离子强度发生相应变化。来自不同亲和力纯化的肽种类标记为箭头，并且显示了两个实验的所得比率。D类，日志₂两个独立实验的散射杂交比较显示了激酶与不同树脂结合的转化率。皮尔逊相关系数（R²)接近1表明在生物复制中测量的激酶比率总体上高度一致。

**图3。**
**富含固定化激酶抑制剂的非蛋白激酶的基因本体分析。**从MV4–11细胞提取物中富集抑制剂亲和力后，用至少一种独特肽鉴定的非蛋白激酶与整个IPI条目列表进行了比较。GO分子函数项明显过度表示(第页<0.001）。比率表示被注释到所列GO分子功能项的抑制物富集蛋白质或所有IPI条目的数量除以带有注释GO分子函数项的所有蛋白质的相应数量。

**图4。**
**不同癌细胞系的比较激酶表达分析。** A类，方案说明了基于SILAC的化学蛋白质组学工作流，用于定量比较三种癌细胞系中VI16832相互作用的亚蛋白质组。B，将蛋白激酶和其他核苷酸结合蛋白的量化比率转换为相对表达水平，在三种细胞系中的任何一种细胞系的最高表达设置为1。基于这些值，生成了一张热图，以可视化分析的癌细胞系的相对表达水平。C类根据Manning，总结了七个主要激酶组以及非典型激酶和其他激酶的相对表达值等。（2）对MV4-11、HCT116和435S细胞进行比较。此外，酪氨酸激酶的成员(*TK公司*)在细胞系比较中，组又分为细胞质酪氨酸激酶和受体酪氨酸激酶。D类用识别激酶Axl、DDR1、FAK、Fer、Fes、JAK1、Met、PAK4、PYK2和Syk的抗体对MV4–11、HCT116和435S细胞的总细胞裂解物进行免疫印迹。为了进行比较，显示了根据基于SILAC的VI16832树脂结合蛋白激酶定量的结合比率。

**图5。**
**人类激肽组的磷酸化位点图谱。** A类经VI16832亲和层析富集后鉴定的蛋白激酶衍生的磷酸肽标记在人类激酶组的树状图中（2）。颜色指出在哪些分析过的细胞系中发现了磷酸肽。经Cell Signaling Technology，Inc.许可，对kinome树插图进行了改编。B蛋白激酶上已识别磷酸化位点的细胞系分布，这些磷酸化位点可以自信地定位于特定的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸（I类位点；第页> 0.95). 显示了所有磷酸化位点组合的数量(*pSTY型*)分别用于磷酸丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸(*pS公司*,*pT型*、和第页).

**图6。**
**在蛋白激酶的激酶激活环区域确定磷酸化位点。**具有至少一个确定的磷酸化位点的磷酸肽（I类*粗体红色*)至少在细胞线上（标记为**X（X）**)在中显示并突出显示*黄色的*其他III类磷酸化位点如所示*浅红色*在缺乏位点决定信息的情况下发现相同磷酸化序列和数量的细胞系由*X（X）*中强调了定义激活片段边界的保守三肽基序DFG和APE绿松石和绿色分别是。如果表达的激酶组的不同成员之间共享激活段磷酸肽，则在*圆括号*.

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