结果和讨论
LD缺乏有条件地阻断自噬
为了研究LDs和自噬之间的功能关系，我们分析了携带基因缺失的酵母菌株DGA1公司和LRO1型油轮(Δdga1型Δlro1号机组; ΔTG）或英寸区域1和区域2(Δ是1Δ是2; ΔSE）分别用于合成TGs或SE，以及所有四个基因缺失的菌株（ΔSE是1Δ是2Δdga1型Δlro1号机组; ΔLD），完全没有LDs，并将其与野生型（wt）和自噬缺陷型Δ进行比较第7天应变，应变(Yang等人，1996年;Tanida等人，1999年;Oelkers等人，2000年,2002;Sandager等人，2002年;Sorger和Daum，2002年). 细胞在合成培养基中培养，该培养基要求细胞从头合成FA，以避免外部FA对细胞脂质稳态的任何影响。首先，我们通过改变wt，Δ来诱导自噬第7天表达基因组整合2xGFP的ΔTG、ΔSE和ΔLD细胞-自动液位计8报告氮饥饿（饥饿）并使用GFP-Atg8分析监测自噬通量(Shintani和Klonsky，2004年). 而自噬在Δ中被完全阻断第7天我们观察到，与wt细胞相比，ΔSE或ΔTG细胞中的自噬通量分别相似或部分减少(、饥饿）。有趣的是，缺乏LD的细胞显示出几乎完全受损的自噬通量，这表明与最近的研究一致，LD的存在是自噬所必需的(、饥饿；Li等人，2015年;Shpilka等人，2015年). 然而，当我们通过雷帕霉素治疗药理学上抑制雷帕霉素复合物靶点1（TORC1）触发自噬时，ΔTG、ΔSE和ΔLD细胞诱导wt样自噬通量(雷帕霉素）。当我们分析wt、ΔLD和Δ第7天表达质粒编码的细胞溶质Rosella（cytRosella；pHfluorin-mCherry）的细胞，报告自噬介导的细胞液周转(Rosado等人，2008年). 在饥饿期间，LD缺乏细胞在cytRosella向液泡的自噬依赖性转移中有缺陷，但在雷帕霉素治疗后没有缺陷(图S1 A). 总的来说，这些数据表明自噬机制在ΔLD细胞中功能完整，但条件依赖于饥饿期间LD的存在。
LD缺乏会有条件地损害自噬。（A） wt自噬通量，Δ第7天、ΔTG、ΔSE和ΔLD细胞表达2个GFP-ATG8饥饿或雷帕霉素治疗期间。数据为平均值±SD(n个= 4). （B） 按A中的方法处理细胞，并在1小时后通过荧光显微镜成像。每个细胞的Atg8点（左图）和AP（右图）的平均数量显示为平均值±SD（≥150个细胞；n个= 3). （C） wt和ΔLD细胞共存2个GFP-自动液位计8并进行了基因组标记第13节-m樱桃色在成像前将其置于饥饿状态1小时。箭头表示与ERES相关的Atg8点（Sec13-mCherry）。数据为平均值±标准差（≥150个细胞；n个= 3). 虚线表示单元格边界。（D） 饥饿期间指示菌株的存活率。棒材，1µm。t吨在A和B中的测试：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。
这些条件效应不是TORC1差异调节的结果，因为所有受试菌株在内源性Atg13的TORC1依赖性磷酸化模式中表现出相同的变化，表明Atg1激酶复合物激活和自噬诱导，以响应饥饿或雷帕霉素治疗（图S1 B；Kamada等人，2000年).
为了探讨饥饿和雷帕霉素治疗期间LD缺乏细胞自噬通量条件缺陷的基础，我们用荧光显微镜监测自噬。在自噬诱导1小时后，我们在两种条件下平均检测到一个点状和一个环状AP，每个wt细胞标记2xGFP-Atg8(). 雷帕霉素治疗1小时后，ΔTG、ΔSE和ΔLD细胞显示Atg8 puncta和AP的wt水平，证实未受影响的自噬流量(雷帕霉素）。相反，在饥饿期间，我们观察到ΔTG细胞中AP的数量与wt和ΔSE细胞相比略有减少，这与这些细胞中自噬流量的影响相似(、饥饿）。值得注意的是，在缺乏LDs的情况下，AP的生物生成在饥饿期间严重受损：ΔLD细胞显示AP显著减少，Atg8点增加(、饥饿）。有趣的是，我们在ΔLD细胞中检测到这些Atg8点与ERES的定量空间关联，特别是以Sec13-mCherry标记的ERES，这与生物发生的起始相一致，但在饥饿诱导的自噬期间抑制了AP的扩展和成熟(;Graef等人，2013年;铃木等人，2013).
为了测试LD生物发生和自噬缺陷的生理后果，我们监测了wt，Δ第7天、ΔTG、ΔSE、ΔLD和Δ第7天饥饿期间的ΔLD细胞。ΔLD细胞对饥饿高度敏感，类似于Δ第7天或Δ第7天ΔLD细胞将LD生物发生与自噬调节和营养应激存活联系起来(;Tsukada和Ohsumi，1993年).
总之，我们的数据表明，LD是AP生物生成、自噬通量和饥饿期间细胞存活所必需的。然而，低密度脂蛋白缺乏细胞具有功能性自噬机制，能够介导完全的、药物诱导的自噬反应，质疑低密度脂素作为AP生物发生的膜源的一般作用，并表明低密度脂素有自噬调节功能。
饥饿时FA合成损害LD缺乏细胞的自噬
wt细胞在对数期含有大量LD，并在饥饿期间以葡萄糖、TG和SE合成以及自噬依赖的方式诱导LD生物生成(和S1 C），后者与之前将自噬机制与LD生物发生联系起来的研究一致(Shibata等人，2010年). 由于LDs起源于内质网，我们假设LD缺乏可能会干扰内质网的稳态。为了验证这一概念，我们首先研究了未折叠蛋白反应（UPR）信号作为内质网应激的一种度量。我们发现几乎四倍诱导的UPR信号，特别是在ΔLD细胞相对于wt细胞中使用合成报告物4个UPRE-GFP，与之前的研究一致(;Jonikas等人，2009年;Petschnigg等人，2009年;Olzmann和Kopito，2011年). 然而，UPR信号并不干扰自噬调节。在缺乏未折叠蛋白传感器的情况下，wt和ΔLD细胞在饥饿期间的自噬流量或细胞存活率不受影响爱尔兰共和国1或其下游目标HAC1类以及在表达红外线1,红外线1C类（图S1、D–F；Patil和Walter，2001年;Papa等人，2003年;沃尔特和罗恩，2011年). 接下来，我们通过荧光显微镜监测内质网形态，作为内质网稳态的敏感读数。尽管存在慢性UPR信号，但在对数期缺乏LDs的情况下，我们无法检测到ER-靶向GFP标记的ER的形态学差异(). 然而，饥饿1小时后，LD缺乏细胞中管状和片状皮质内质网的互联网络坍塌为一个简化的扩张和连续的小管网络(、饥饿、箭头），让人联想到过量的外部饱和脂肪酸引起的内质网结构改变(Pineau等人，2009年). 由于在我们的测试条件下，细胞依赖于内部FA，因此我们推断，新合成的FA超过LD缺乏细胞的储存能力可能会导致内质网形态的改变。事实上，在饥饿期间，FA合成酶特异性抑制剂天蓝蛋白对新生FA合成的化学抑制(Vance等人，1972年)，ΔLD细胞保持wt样ER形态(). 因此，LD通过缓冲从头合成FA，对维持内质网稳态至关重要。值得注意的是，当我们用雷帕霉素处理wt和ΔLD细胞时，我们没有观察到内质网的结构变化（图S1 G），这表明内质网稳态受损可能与自噬缺陷偶然相关。
抑制从头合成FA可改善饥饿期间LD缺乏细胞的自噬、内质网形态和细胞存活率。（A） BODIPY493/503染色LD的数量（wt），Δ第7天对数期的ΔTG、ΔSE和ΔLD细胞，以及6小时后的饥饿±葡萄糖（Glu）（每株150个细胞），通过荧光显微镜进行分析，如图S1 C.（B）重量，Δ第7天、ΔTG、ΔSE和ΔLD细胞表达4个UPRE-GFP通过全细胞提取和使用α-GFP和α-Pgk1抗体的Western blot分析生长至对数期。GFP信号归一化为Pgk1，并在对数期（设为1）表达与wt细胞的相对（rel.）。数据为平均值±SD(n个= 4). （C） 表达GFP-HDEL（ER靶向GFP）的wt和ΔLD细胞在对数期或饥饿1h±蓝蛋白（10µg/ml）后成像。图像显示了同一Z堆栈的单个皮层和中间部分。饥饿期间ΔLD细胞的扩张小管内质网塌陷（箭头所示）的细胞数量为平均值±SD（≥150个细胞；n个= 3). 棒材，5µm。（D） 表达wt和ΔLD细胞的自噬通量2个GFP-ATG8饥饿时±蓝蛋白（10µg/ml）。数据为平均值±SD(n个= 5). （E） 按照D所述处理细胞，并按照数据为平均值±SD（≥150个单元格；n个= 3). 虚线表示单元格边界。棒材，1µm。（F） 与D中一样处理的指示菌株在饥饿期间的存活率。t吨在B、D和E中的测试：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。
为了测试无缓冲的FA合成是否会导致自噬缺陷，我们比较了在饥饿期间存在或不存在肠毒素的情况下，wt和ΔLD细胞的自噬反应。抑制FA合成轻度降低wt细胞的自噬流量(). 然而，我们观察到，与未经处理的LD缺乏细胞相比，在饥饿6小时后，与未处理的（重量的15%）和处理的重量细胞（重量的48%）相比，经处理的细胞自噬通量有适度但具有统计学意义的改善(). 重要的是，细胞学分析显示，抑制FA合成后，LD缺乏细胞中AP的生物发生明显改善：我们发现Atg8点的数量与wt相似，并且显著增加了ΔLD细胞中AP形成，表明未缓冲FA合成与这两种畸变有关(). 在饥饿期间，FA合成受阻也会以自噬依赖的方式将LD缺乏细胞的存活时间延长至2天(和S1 H）。综上所述，这些数据表明，LD作为从头合成FA的缓冲物发挥着关键作用，以维持内质网内环境稳定、完整的自噬和营养应激抵抗。
LD缺陷细胞中PL组成的改变与自噬缺陷有关
抑制FA合成后自噬的部分改善表明，缺乏LD时的额外生理变化可能会干扰自噬调节。因此，我们转向分析主要PL在整个wt、ΔLD和Δ中的膜组成第7天质谱法测定对数期细胞。有趣的是，当Δ中出现自噬阻滞时第7天与wt细胞相比，LD缺乏细胞中的磷脂酰肌醇（PI）相对含量在统计学上显著增加，磷脂酸（PA）和磷脂酰甘油（PG）含量减少(，+肌醇）。PA、PI和PI衍生物是调节细胞过程（包括PL合成和自噬）的信号脂质，其相对水平与肌醇的可用性相关(Henry等人，2012年;Dall'Armi等人，2013年). 因此，为了测试PL组成和自噬之间可能的调控联系，我们首先分析了wt、ΔLD和Δ的PL组成第7天细胞在无肌醇培养基中生长至对数期。我们观察到，在这些条件下，所有菌株的PI含量都如预期的那样普遍下降，此外，与wt和Δ相比，LD缺乏细胞中的PI或PA含量分别减少或无显著差异第7天不含肌醇的细胞(，−肌醇）。因此，我们确定了代谢条件，使我们能够缓解LD缺乏引起的PL组成差异。值得注意的是，在没有肌醇的情况下生长的细胞或用雷帕霉素处理的细胞导致了wt和ΔLD细胞中PL成分的类似重塑(和S2甲).
在缺乏LD的细胞中恢复改变的PL成分可以提高自噬和饥饿时的细胞存活率。（A） 重量、ΔLD、Δ第7天, Δopi1（opi1）和Δopi1（opi1）将ΔLD细胞培养至对数期±肌醇（2 mg/l），并按照材料和方法中的描述通过质谱分析PLs。PC、PE、PI、PS、PA和PG的相对（相对）分布显示为平均值±SD(n个≥ 3). （B） 表达wt和ΔLD细胞的自噬通量2个GFP-ATG8饥饿期间（饥饿），存在指示的肌醇浓度。数据为平均值±SD(n个= 3). （C） wt和ΔLD细胞表达2个GFP-ATG8生长到对数期，并转移到饥饿±肌醇（2mg/l）。按照中所述对细胞进行成像和分析。虚线表示单元格边界。棒材，1µm。（D） 饥饿期间按C处理的指示菌株的存活率。（E） wt、ΔLD或Δ的增长第7天在含有指定浓度±肌醇（2 mg/l）油酸（O）或棕榈酸（P）的平板上的菌株。t吨在A、B和C中的测试：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P＜0.001。
当我们监测wt和ΔLD细胞中的自噬通量时，我们发现wt细胞中的自噬通量增加，并且显著改善了LD缺乏细胞相对于wt细胞的自吞噬通量，以应对含有降低肌醇浓度的饥饿介质(). 重要的是，细胞学分析表明，虽然异常的Atg8点形成是以不依赖肌醇的方式发生的，但在缺乏肌醇的情况下，ΔLD细胞中AP的生物发生显著恢复(). 在饥饿期间，降低肌醇浓度还以自噬依赖方式延长LD缺乏细胞的存活时间(和S2 B）。因此，这些数据表明，在没有肌醇的情况下，细胞更容易自噬，并且当PL组成的差异减轻时，LD缺陷细胞在AP生物发生、自噬通量和细胞存活方面得到特别改善。
由于从头合成FA会干扰LD缺乏细胞的自噬，因此我们测试了肌醇水平是否通过FA抵抗的变化来调节自噬。ΔLD细胞对高浓度的外部FA油酸或棕榈油酸敏感，并表现出轻度的肌醇营养缺陷型(;Sandager等人，2002年;Petschnigg等人，2009年;Gaspar等人，2011年). 有趣的是，缺乏肌醇进一步增加了ΔLD细胞对外部FA的敏感性，这表明外部肌醇与FA缓冲有关，并且缺乏肌醇对自噬的积极影响与FA抵抗不同(). 这些数据增加了通过增加PI合成来缓冲过量FA的可能性，并可能为LD缺乏细胞的轻度肌醇营养不良提供了理论依据。与wt细胞相比，LD缺乏细胞的Ino1水平始终升高，这表明即使在存在外源性肌醇的情况下，肌醇合成也会升高（图S1 I）。此外，饥饿6小时后，所有菌株的PI水平均增加，这是诱导FA合成和LD生物生成的条件（图S2 C）。
总之，我们的数据支持一种模型，即LD缺乏细胞使用外源性肌醇来增加PI合成，以缓冲过量的FA合成并提高FA抗性。然而，其结果是，PL成分的这些变化干扰了LD缺乏细胞的自噬调节和营养应激抵抗。
在缺乏肌醇的情况下提高FA抗性可治愈饥饿时ΔLD细胞的自噬
到目前为止，我们确定了新生FA合成和可能改变PL组成的因素，这些因素会损害LD缺乏细胞调节自噬的能力。此外，ΔLD细胞还遭受慢性内质网应激和饥饿诱导的内质网变形。我们假设，人工增加LD缺乏细胞的FA缓冲能力可以改善内质网稳态和自噬调节。Opi1是PL生物合成基因的中心转录抑制剂，其缺失导致内质网膜扩张，能够缓解未折叠蛋白应激(Carman和Henry，2007年;Schuck等人，2009年). Opi1的活性由依赖PA水平的核腔或内质网膜的差异定位调节(Loewen等人，2004年;Hofbauer等人，2014年). 与ΔLD细胞中PA水平降低一致，50%的LD缺陷细胞显示出基因组修饰的弥漫核信号OPI1号机组-3xGFP，而在含有肌醇的培养基中生长时，wt细胞群中的GFP小于25%(). 有趣的是，在缺乏肌醇的情况下，在LD缺陷细胞中，Opi1定位于细胞核ER膜，与wt细胞无法区分，这些条件可以恢复PA水平(). 接下来，我们测试了解偶联PL生物合成是否由OPI1号机组缺失可以扩大内质网，提高LD缺乏细胞对FA的抗性。与LD无关，Δopi1（opi1）和Δopi1（opi1）ΔLD细胞显示ER扩增，其特征是在对数期胞质溶胶中的外周ER延伸(，箭头；Schuck等人，2009年). 引人注目的是，与我们的假设一致，删除了OPI1号机组在低密度脂蛋白缺乏细胞中提高了对外部脂肪酸的抵抗力()，在对数期将慢性UPR信号降低至wt水平()部分抑制了饥饿时皮质ER向扩张小管的塌陷()，表明Δopi1（opi1）ΔLD细胞与ΔLD-细胞的比较。
删除OPI1号机组在饥饿期间缓冲FA并改善LD缺乏细胞的内质网应激和形态。（A） 荧光显微镜分析Opi1-3xGFP在对数期±肌醇（2 mg/l）wt和ΔLD细胞中的定位。显示了在+肌醇培养基中生长期间代表性细胞的单个焦平面。核ER（nER）或弥漫核Opi1定位的细胞数量（≥100个细胞；n个= 3). （B） 在含有指定浓度±肌醇（2 mg/l）的油酸盐（O）或棕榈酸盐（P）的平板上生长指定菌株。（C） 重量，Δ红外线1，ΔLD，Δopi1（opi1）和Δopi1（opi1）ΔLD细胞表达4个UPRE-GFP在日志阶段。按照中所述对细胞进行分析.（D）wt，ΔLD，Δopi1（opi1）和Δopi1（opi1）表达GFP-HDEL（ER-GFP）的ΔLD细胞生长到对数期，饥饿±肌醇（2mg/l）1h，并按箭头和箭头分别表示内质网延伸或扩张的小管。棒材，5µm。t吨在A和C中的测试：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；ns，不显著。
为了测试在缺乏Opi1的情况下内质网稳态的改善是否影响LD缺乏细胞的自噬，我们监测了wt、ΔLD、Δopi1（opi1）和Δopi1（opi1）饥饿期间的ΔLD细胞。事实上，我们观察到自噬通量有适度但显著的改善()，AP生物成因(，+肌醇）和细胞存活opi1（opi1）ΔLD细胞与ΔLD-细胞的比较(，+肌醇）。有趣的是，ΔLD和Δopi1（opi1）当我们在蓝绿色素存在下饥饿细胞时，ΔLD细胞表现出相同的中间自噬通量（图S2 D）OPI1号机组在相同的途径中进行功能性的缺失和肠胀气处理，并表明OPI1号机组主要通过FA缓冲LD缺乏细胞来改善自噬。我们推断，除了FA抵抗外，还必须纠正LD缺乏细胞中的其他变化，以允许完整的自噬。因此，我们分析了Δ的PL组成opi1（opi1）和Δopi1（opi1）ΔLD细胞和发现与wt细胞相比有显著变化，包括PI强烈增加和PA含量减少(，+肌醇）。这些数据增加了PI和PA水平改变干扰Δ中自噬调节的可能性opi1（opi1）ΔLD电池。PI和PA在Δ中的水平opi1（opi1）和Δopi1（opi1）在没有肌醇的情况下，ΔLD细胞恢复到wt样水平(，−肌醇）使我们能够测试它们对FA抗性、ER形态和自噬的影响。ΔLD和Δopi1（opi1）ΔLD细胞在不含肌醇的情况下对外源性FA的敏感性增加，但在删除OPI1号机组在LD缺陷细胞中(). 有趣的是，无肌醇培养基中的饥饿完全阻止了皮层ER在ΔLD和Δ中的崩溃opi1（opi1）ΔLD细胞尽管增加了FA敏感性，但肌醇代谢（可能通过PL成分）与ER形态相关(，−肌醇）。我们测试了FA抗性和PL组成的同时改善是否足以恢复LD缺乏细胞的自噬。令人惊讶的是，与这个概念一致，肌醇的缺失和OPI1号机组导致LD缺乏细胞的额外改善，恢复自噬流量和Δ中AP的生物生成opi1（opi1）ΔLD电池达到与Δ相同的水平opi1（opi1）从而在饥饿期间产生LD依赖的自噬反应(，−肌醇）。根据以下结论OPI1号机组在无肌醇的培养基中，当天蓝蛋白使细胞饥饿时，ΔLD细胞表现出wt样的自噬通量(). 有趣的是，天蓝蛋白治疗还可以阻止ΔLD和Δ中观察到的异常Atg8点的形成opi1（opi1）无肌醇饥饿时ΔLD细胞对细胞存活影响较小(; 和图S2 E），表明即使在Δ中FA电阻提高时，点状构造对过量FA也非常敏感opi1（opi1）ΔLD电池。
增加FA抗性和恢复PL成分可治愈LD缺乏细胞中AP的生物生成和自噬通量。（A和B）自噬通量（wt）、ΔLD、Δopi1（opi1）和Δopi1（opi1）ΔLD细胞表达2个GFP-ATG8在存在（A）或不存在（B）肌醇（2 mg/l）的饥饿（饥饿）期间。数据为平均值±SD(n个= 4). （C） 饥饿期间指示菌株的存活率±肌醇（2 mg/l）。（D） 自噬通量（wt，ΔLD，Δ）opi1（opi1）和Δopi1（opi1）ΔLD细胞在无肌醇培养基中生长，并在天蓝蛋白（10µg/ml）存在下饥饿。数据为平均值±SD(n个= 4). （E–G）重量，ΔLD，Δopi1（opi1）和Δopi1（opi1）ΔLD细胞表达2个GFP-ATG8按照A、B和D中所述进行处理，并按照中所述进行成像和分析.Bar，1µm。数据为平均值±SD（150个细胞/条件，n个= 3).t吨在A、B、D、F和G中的测试：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。
总之，这些发现表明，在没有LD的情况下，AP的生物发生和自噬通量可以完全治愈，因此提供了明确的证据，证明LD作为自噬的膜源是可有可无的。我们的数据支持一个模型，在该模型中，LD履行维持内质网稳态所需的两个基本功能，即完整的自噬调节，以及营养应激抵抗-缓冲过量的FA和维持PL组成（图S2 F）。有趣的是，我们提供的证据表明，这两种功能可能存在关联，即当LD存储容量超过时，FA通过增加PI水平来缓冲，从而提高细胞的FA电阻。由于我们分析了缺乏外源性FA的低密度脂蛋白缺乏细胞，我们的研究揭示了细胞在不同时损害自噬调节和营养应激抵抗的情况下，明显无法调节从头合成FA的水平以维持生长。我们的观察结果表明，控制FA合成的调节电路在本质上取决于LD维持细胞功能的FA缓冲容量(Tehlivets等人，2007年).
自噬缺陷和慢性内质网应激是神经退行性疾病、肥胖和糖尿病的常见特征(Ozcan等人，2004年;尼克松，2013年;Hetz和Mollereau，2014年). 对肥胖小鼠肝脏ER的分析先前揭示了PL组成的改变，特别是磷脂酰胆碱（PC）/磷脂酰乙醇胺（PE）比率的改变（未分析PI），导致慢性ER应激(Fu等人，2011年). 有趣的是，饥饿时这些肝细胞在AP生物生成中也受到损害(Yang等人，2010年). 因此，这些数据和我们的数据提出了一种令人兴奋的可能性，即当LD存储容量超过时，PL组成的改变可能是自噬调节缺陷的一般基本原理。还需要做更多的工作来阐明PA、PI或PI衍生物的变化如何影响自噬，以及在AP形成过程中如何干扰自噬机制(Petiot等人，2000年;Moreau等人，2012年;Li等人，2014年;Vicinaza等人，2015年). 然而，我们的研究揭示了代谢和基因改变的原理，这些改变结合起来可以完全弥补LD缺乏。因此，这些途径可能是上述病理学治疗干预的合适靶点。
自噬领域的核心问题之一是AP形成的膜来自何处。我们的数据明确表明，不需要LD作为膜源。然而，如果存在大量无毒的外部FA，LD可能会促进FA或脂质对AP的生物生成(杜邦等人，2014年;Shpilka等人，2015年). 一个主要的挑战仍然是确定细胞如何调节多个膜源对不同代谢条件的响应。
材料和方法
菌株和培养基
本研究中使用的所有菌株都是w303的衍生物，并在表S1如前所述，基因缺失是通过使用基于PCR的靶向同源重组的标记盒替换完整ORF而产生的(Longtine等人，1998年). 双突变体ΔTAG（Δdga1型::TRP1号机组Δlro1号机组::HIS3型)和ΔSE（Δ是1::TRP1型Δ是2::HIS3型)通过携带单缺失和产孢的单倍体菌株杂交产生。四重突变体ΔLD（Δdga1型::TRP1号机组Δlro1号机组::HIS3型Δ是1::TRP1号机组Δ是2::HIS3型)通过两个双突变体ΔTAG和ΔSE的杂交，然后进行孢子形成、四分体分离和分析获得。
菌株在合成完全培养基中生长（0.7%[wt/vol]酵母氮碱[BD]或0.7%[wt/vol]无肌醇[Formedium]的酵母氮碱，辅以指定浓度的肌醇[Sigma-Aldrich]；2%[wt/vol]α-d日-葡萄糖[Sigma-Aldrich]）。在饥饿实验中，细胞生长到早期对数阶段，并转移到SD-N培养基中（0.17%[wt/vol]酵母氮基，不含aa和硫酸铵[BD]，或0.17%[wt/vol]酵母菌氮基，无aa、硫酸铵和肌醇[Formedium]，辅以指示浓度的肌醇；2%[wt/vol]α-d日-葡萄糖[Sigma-Aldrich]）。如有指示，向培养基中添加二甲基亚砜中的雷帕霉素（400 ng/ml）、衣霉素（1µg/ml；均为钙生物化学）或蓝菌素（10µg/ml；Sigma-Aldrich）。
对于增长分析，106在YPD平板上发现细胞（1%[wt/vol]酵母提取物[Serva]、2%[wt/vol]蛋白胨[Merck]和2%[wt/vol]α-d日-葡萄糖[Sigma-Aldrich]），并在30°C下生长2 d。用于FA电阻测试，106在含有0.6%（体积/体积）乙醇/泰洛沙波尔（体积比5:1）和指示浓度的油酸盐或棕榈酸盐（均为Sigma-Aldrich）的合成完整培养基平板上发现细胞，并如前所述在30°C下培养2 d(Garbarino等人，2009年).
质粒pRS306-pr自动液位计8-2台EGFP-ATG8，pRS305-DsRed-HDEL公司和pRS305-yEGFP-HDEL公司之前描述过（加利福尼亚大学戴维斯分校J.Nunnari的礼物；Graef等人，2013年;Lackner等人，2013年). pRS315-pHfluorin-mCherry是根据Rosado等人（2008年）通过整合ADH1启动子（-717至-1 bp；引物正向：5′-GGCGAGTGAATTGTATAGACTCACTATAGGGCGATTGATCCTTTGTTCCGGG-3′；引物反向：5′-GTTCTTCCTTTACTCATGTATATGTATGTATG-3′）融合到从pRS315-phfluorin-ATG8（pSW12）扩增的pHfluorin；奥地利因斯布鲁克医科大学D.Teis的礼物；Müller等人，2015年; 引物正向：5′-CATACATCAACTATCTCATACATACAATGAAAGAGAGAGAACAC-3′；引物反向：5′-TAACCAGCACGTACCTTTTGTATAGTCATCATCCATGCATGTTAATC-3′）和从pFA6a-mCherry（J.Nunnari馈赠；引物正向：5′-GATACACATGCATGGAACTACAGAACAAGGACGTTTTTA-3′；引物逆向：5′-CAAGCTCGGAATTAAACCTCCACTAAGGAGAACACATC-3’）中通过“缝隙修复”扩增出的mCherrry体内同源重组(Oldenburg等人，1997年)BamHI-和HindIII-线性pRS315。如前所述，使用引物oMJ007和oMJ014对4xUPRE-GFP报告子进行基因组整合，从pKT007中扩增出一个PCR产物，该PCR产物包含驱动GFP的4xUPRE重复序列，然后是URA3公司标记，两侧有与URA3公司地点（来自加利福尼亚大学J.Weissman的礼物，加利福尼亚州旧金山；Jonikas等人，2009年).
全细胞提取、western blot分析和量化
0.2 OD对应的单元格600通过碱性全细胞提取（0.255 M NaOH和1%[vol/vol]β-巯基乙醇）收集并裂解单元。蛋白质提取物通过SDS-PAGE和免疫印迹分析（α-Atg13，兔多克隆，来自密歇根州安阿伯市密歇根大学D.Klonsky的礼物；α-GFP，小鼠单克隆；Covance；α-HA，小鼠单抗；Covanse；和α-Pgk1，小鼠单株；Abcam），并使用与IRDye（800CW；Li-COR生物科学）。使用奥德赛红外成像系统（Li-COR Biosciences）进行量化。
荧光显微镜
使用平面Apochro IR 60×1.27 NA物镜（Nikon）、Spectra X LED光源（Lumencor）和采集软件NIS元素AR（Nikon。使用触发式Z压电系统（尼康）和orca闪光灯4.0相机（哈马松）收集3D光学显微镜数据。使用NIS-elements AR处理3D数据；成像数据的反褶积是通过NIS-元件AR中的3D反褶缩3D-Fast进行的(,,、和)或Huygens Professional 15.10（科学体成像；;;; 图S1、A、C和G）。使用Photoshop（Adobe）软件对亮度进行线性调整。
质谱脂质分析
质谱分析基本上按照描述进行，并对整个酵母细胞中磷脂的分析进行了一些优化(Connerth等人，2012年). 在存在主要PL的内部标准的情况下，从整个酵母细胞中提取脂质（PC 17:0–14:1、PE 17:0-14:1，PI 17:0-14:1、磷脂酰丝氨酸[PS]17:0-14:1、PG 17:0-15:1、PA 17:0-13:1，均来自Avanti Polar Lipids）。提取根据布莱和戴尔（1959），进行了修改。简言之，0.5 OD600-将单位细胞重悬于250µl水中，并在玻璃瓶中与1 ml氯仿/甲醇/25%HCl（40:80:0.6[vol/vol]）和脂质标准品混合。向小瓶中添加300µl玻璃珠，并通过严格混合处理细胞30 min。在添加250µl氯仿和250µl水后，再次混合样品1 min，并通过离心（800×g，2 min）诱导相分离。小心地将下氯仿相转移到第二个小瓶中，并与400µl水混合（洗涤步骤）。旋转30秒后，通过离心诱导相分离，并小心地将低氯仿相转移到干净的玻璃瓶中。第一阶段分离后的上水相与300µl三氯甲烷混合，并重复萃取。相分离后，在第一次洗涤步骤后，将下部氯仿相与上部水相混合。在旋转30 s后，通过离心诱导相分离，并小心地将低级氯仿相转移到玻璃瓶中，与第一次提取的氯仿相一起。在37°C下用温和的氩气流蒸发溶剂。在以下设置下，将脂质溶解在甲醇中的10 mM醋酸铵中，并在配备纳米熔喷装置（TriVersa NanoMate；Advion）的QTRAP 6500三重四极质谱仪（SCIEX）上进行分析：（QT 6500）气幕气体，20；碰撞气体，中等；接口加热器温度，90°C；入口电位，10；模式：高质量；步长，0.1 D；凝结时间，0 ms；扫描速度，200 D/s；暂停5ms；CEM，2300；同步，LC同步；扫描模式，轮廓（NanoMate）样本输液量，12µl；样品后抽吸的空气体积，1µl；芯片前气隙，启用；吸气延迟，0s；预穿孔，带芯轴；喷雾感应，启用；温度，12°C；气压，0.4 psi；电离电压，1.15 kV；极性，正极；通风顶部空间，启用；预湿，1×；交付后体积，0.5µl；触点闭合延迟，1s；音量定时延迟，0 s；吸入深度，1mm；预穿孔深度，9mm；和输出触点闭合，Rel 1–2.5s持续时间。四极子Q1和Q3以单位分辨率运行。通过在50 eV碰撞能量（CE）下扫描质荷比184的前体，在正离子模式下进行PC分析。PE、PI、PS、PG、PA和CDP-DAG测量是通过在25、30、20、30、25和40 eV的CE下扫描141、277、185、189、115和403 D的中性损耗在正离子模型下进行的。质谱由LipidView软件1.2版（SCIEX）进行处理，以识别和量化脂质。根据内标物和内源性脂质之间的反应差异，对脂质量（皮摩尔）进行校正。
统计分析
错误条表示图图例中所示的SD。数据在Excel（Microsoft）中处理。使用双尾、非配对的t吨测试；*，P<0.05；**，P<0.01；和***，P<0.001。图中仅显示了具有统计意义的比较。
在线补充材料
图S1提供了LD缺乏细胞自噬通量条件缺陷的进一步证据，数据显示Atg13的去磷酸化未发生改变，主要数据为有证据表明，UPR信号不影响自噬流量或饥饿存活率，雷帕霉素治疗wt和LD缺乏细胞期间内质网形态不变，有证据表明饥饿期间抑制FA合成后LD缺乏的细胞存活率依赖自噬增加。图S2提供了对PL组成、饥饿存活率、肌醇和蓝蛋白治疗依赖性的自噬通量分析的附加分析，以及LDs在内质网稳态和自噬调节中的作用模型。表S1列出了所有酿酒酵母本研究中使用的菌株。在线补充材料可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.201508102/DC1.
