低氧诱导因子（HIF）1由一个异二聚体转录调节因子家族组成，该家族控制一系列涉及血管生成、氧转运和葡萄糖代谢的基因的表达（参考文献。1–三). 每个HIF复合物都包含一个α-亚单位和常见的二聚伴侣HIF-β也被称为芳香烃受体核转运体。鉴于两个HIF-α和HIF-β需要形成HIF异二聚体-α是关键的调节亚单位，其转录活性对HIF复合物功能必不可少(1).
HIF的活性-α控制在蛋白质稳定性水平(1,2,4,5)和转录刺激(三,6,7). HIF的降解-α由泛素蛋白酶体系统介导(5,8)并且需要在保守的氧依赖降解域中脯氨酰残基的羟基化(8,9)是由氧、铁和氧戊二酸依赖的脯氨酰羟化酶进行的过程(10–15). 羟基化氧依赖性降解域招募von Hippel-Lindau蛋白(11,12,16)，一种肿瘤抑制蛋白，作为E3泛素连接酶复合物的一部分(17,18). 除HIF外-α稳定，HIF-α活动受其反式激活域NAD和CAD的功能刺激调节，NAD和CA由负调控区分隔(6,7). p300/CBP的募集在HIF的功能激活中起着重要作用-α(19). HIF之间的相互作用-αCAD和p300/CBP的CH1结构域涉及疏水界面(20–22)因此被天冬酰胺残基（Asn）的羟基化破坏803)在HIF-1的CAD中α在常压条件下(23,24). CAD的羟基化取决于负调控区对抑制因子HIF（FIH）的募集(24,25)，一种天冬酰胺羟化酶，用作HIF活性抑制剂(26,27).
除缺氧外，多种致癌途径包括生长因子信号传导或抑癌基因的遗传丢失，如甚高频和PTEN公司，上调HIF活性(28,29). 特别是，ERK1/2（也称为p44/p42），是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的两种激酶，与HIF激活有关(30–32). ERK1/2由膜酪氨酸激酶触发的细胞外增殖信号激活，并通过Ras-Raf-MEK途径通过可被特定激酶抑制剂抑制的级联磷酸化事件转导(33). ERK1/2是丝氨酸/苏氨酸激酶，通过磷酸化核底物调节基因表达(33). 增强的MAPK信号是肿瘤中的常见事件，组成性活性MAPK信号转导哺乳动物细胞(34). 因此，MAPK信号上调HIF活性可能在转化以及依赖血管生成和葡萄糖代谢变化的肿瘤生长和转移过程中发挥重要作用(35). 在这项研究中，我们检测了MAPK信号传导影响HIF活性的分子基础。我们的数据表明，MAPK信号可能通过促进HIF-p300/CBP复合物的形成和调节p300/CPP的反式激活活性来影响HIF活性。
实验程序
质粒
表达G4.H1的质粒α530–826，第4页第1页α530–778，G4.H1α744–826和G4.H1α前面描述了786–826(24). pFR-Luc是一种荧光素酶报告载体，其中荧光素酶基因受最小E1B启动子和上游四个GAL4结合位点（Clontech）的控制。pCMV公司-β-p300，pRSV-β-CBP、pCMV-G4.p300、pCMV。β-加仑和pSV。β-这个女孩是安东尼奥·佐丹奴博士（天普大学）慷慨的礼物。pRL-CMV来自普罗米加（威斯康星州麦迪逊）。pGEX公司。上半年α530–826页，GEX。上半年α530-658和pGEX。上半年α通过将相应的PCR片段插入生态pGEX4T的RI位点（Amersham Biosciences）。pGEX公司。上半年α757–826由Gregg Semenza博士（马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学）提供(25). pGEXp300TD（aa 1572–2370）由Pier Lorenzo Puri博士（索尔克研究所）提供。pCMV病毒。MEK1是关坤良博士（密歇根大学）慷慨赠送的礼物(36).
特殊化学品
染料木素和去铁胺（Dfx）购自Sigma。PD98059（PDx）购自BioMol（Plymouth，PA）。二甲基草酰甘氨酸（DOG）由Peter Ratcliffe博士（牛津大学）提供(12). Genistein、Dfx和PDx最初在Me中溶解2SO，并按照每个实验中所示的最终浓度使用。
细胞系、细胞培养和转染
B1细胞系的建立如前所述(5). 所有细胞均保持在37°C的增湿培养箱中，在5%CO的环境中2B1细胞和亲代Hep3B细胞在最小基本培养基中培养，而HeLa细胞在Dulbecco改良的Eagle's培养基中，均添加10%胎牛血清、青霉素（100单位/ml）和链霉素（100μg/ml）（Invitrogen）。按照制造商提供的低血清方案，使用LipofectAMINE Plus试剂（Invitrogen）进行瞬时转染。每个实验都描述了转染中使用的DNA量。转染后24小时，将细胞胰蛋白酶化，混合，并平均分为12孔板进行荧光素酶分析，或分为60 mm板进行Western blot分析。需要时，0.5μ表达质粒的gβ-半乳糖苷酶联合转染以使转染效率正常化。
低氧治疗
用0.47%O的混合气体冲洗细胞2，5%一氧化碳2，和平衡N2在前面描述的密封室中(5). 或者，在一些实验中，细胞直接在缺氧工作站中培养（体内2)在O处2每个实验中规定的张力。
荧光素酶分析
按照制造商的程序，使用从Promega（威斯康星州麦迪逊）购买的荧光素酶分析系统制备并分析所有细胞提取物。发光在TD20/20光度计（Promega）中测量，结果用相对光单位表示。蛋白质浓度通过Bio-Rad方法测定。β-半乳糖苷酶分析出于正常化原因，使用β-Promega的半乳糖苷酶检测系统。
GST融合蛋白的表达、纯化和体外下拉测定
将表达所示GST融合蛋白的质粒转化为BL21活性细胞（Stratagene，La Jolla，CA），并通过添加异丙基-1-硫代诱导表达-β-D-半乳糖-吡喃苷（Promega）至0.1 mM。用于纯化和在体外下拉分析通常与前面描述的相同(37). 简单地说，细胞在裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl、250 mM NaCl、1%Triton 100、5 mM EDTA、50 mM NaF、0.1 mM蛋白酶抑制剂Na）中进行裂解三VO（旁白）4，1 mM苯甲基磺酰氟，1×混合物，pH 7.5）。GST和融合蛋白首先在裂解缓冲液中与3%牛奶孵育，用裂解缓冲液洗涤，然后在4°C的滚筒上与细胞裂解物孵育1小时，然后用裂解缓冲溶液洗涤三次。
体外激酶检测
体外按照Pei的描述进行了激酶分析，但做了一些小修改(38). 简单地说，纯化的GST、GST融合蛋白和商业化获得的髓鞘碱性蛋白（Sigma）在30°C下与活化的重组MAPK（BioMol）在5μ的Ci[γ-32P] MAPK缓冲液中的ATP（Amersham Biosciences）（25 mM Hepes，10 mM MgCl2，1 mM二硫苏糖醇，pH 7.5）。通过添加等体积的2×Laemmli样品缓冲液并在95°C下加热3分钟，停止反应。通过4–20%连续梯度SDS-PAGE（Bio-Rad）分离后，用考马斯蓝R250（Sigma）对凝胶进行染色，去污，并在放射自显影前干燥。
抗体、免疫沉淀和Western Blot分析
抗HIF-1单克隆抗体α（目录号610959）和抗p300单克隆抗体（NM11）购自Pharmingen。单克隆抗GAL4 DNA结合域抗体购自Clontech（目录号5399-1）。纯化的酪氨酸磷酸化多克隆抗体、总MAPK和辣根过氧化物酶偶联驴抗兔多克隆抗体购自Promega。辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG（Fc片段）购自Sigma。如前所述进行免疫沉淀，并进行了轻微修改(37,39). 简单地说，细胞在添加75μM PDx（如果需要）。细胞裂解物首先与非特异性正常小鼠血清和杀蛋白A阳性孵育金黄色葡萄球菌细胞（罗氏诊断）。将预先筛选的裂解物与2μg单克隆抗体在冰上放置30分钟，然后与固定化蛋白A（Pierce）在4°C下摇晃45分钟。对于Western blot分析，如果未指定，则在4–20%梯度SDS-PAGE（Bio-Rad）上分离样品，然后将其电转移到聚偏二氟乙烯膜上。TBST中5%的牛奶堵塞了膜(24)，与特异性抗体孵育，在TBST中洗涤，并与辣根过氧化物酶标记的第二抗体孵育。最终使用ECL Plus系统（Amersham Biosciences）开发膜。
结果
MAPK信号转导增强基础和低氧刺激HIF-1活性
此前，我们报道了携带低氧反应荧光素酶报告基因的肝癌衍生B1细胞系的建立，并表明该细胞系对低氧和羟化酶抑制剂（低氧模拟物）有反应，包括过渡金属、铁螯合物和氧戊二酸类似物(5). 据观察，酪氨酸激酶抑制剂金雀异黄素降低了HIF-1和HIF-1的蛋白水平α和HIF-1β并抑制DNA结合复合物的形成(40). 此前，我们还发现，在B1细胞中，染料木素抑制HIF-1活性和基因表达，以应对缺氧刺激(30). 然而，PDx，一种选择性MEK抑制剂(41)，抑制缺氧刺激基因表达，但对HIF-1几乎没有影响α水平和DNA结合复合物的形成(30). 在此，我们进一步研究了MAPK信号在HIF-1基础和诱导活性中的作用α在B1细胞中。MAPK信号通路，两种激酶抑制剂genistein的靶向位点(GSN公司)和PDx，实验系统示意图如所示用染料木黄酮处理B1细胞显示出对基础和缺氧诱导的HIF-1活性的剂量依赖性抑制作用(). 使用低氧模拟Dfx（铁螯合剂）和DOG（酮戊二酸类似物）（未显示）也观察到类似的抑制作用。我们进一步研究了PDx对HIF-1的基础水平和受刺激的反式激活活性的影响。表明PDx在常氧和低氧条件下均抑制B1细胞中荧光素酶的表达，进一步证实MAPK信号不仅增强低氧刺激的HIF-1活性，还增强其基础活性。在对照实验中，PDx对pRL-CMV的荧光素酶活性没有影响（未显示）。这些结果表明，MAPK信号在促进内源性HIF活性方面具有普遍作用，而与氧浓度无关。
MAPK信号在内源性HIF-1活性中的作用A类MAPK信号通路和抑制剂作用位点的示意图。B类荧光素酶报告系统模型。C类和D类金雀异黄素对HIF-1活性的影响。B1细胞暴露于不同剂量的金雀异黄素（一种酪氨酸激酶抑制剂），并在常压下培养(C类)或在含2%O的缺氧工作站2(D类)持续8小时。E类和F类，PDx对HIF-1活性的影响。B1细胞在常氧或缺氧条件下暴露于不同剂量的PDx，MAPK抑制剂（2%O2)持续8小时。RLU（RLU），相对灯光单位。
MAPK信号传导促进HIF-1α的反激活活性
接下来，我们测试了MAPK信号通过HIF-1的转录激活域调节HIF-1活性的假设α用表达G4.H1的质粒转染HeLa细胞α530–826，其中HIF-1α将该片段与酵母转录因子GAL4的DNA结合结构域融合。联合转染由E1B最小启动子和四个GAL4结合位点（pFR-luc）拷贝驱动的荧光素酶报告子，以监测反式激活活性。，显示了PDx对G4.H1反式激活活性的剂量依赖性抑制作用α530–826，在常氧和缺氧条件下均含有NAD和CAD。G4.H1的蛋白质水平α530–826人未受到PDx治疗的显著影响(). 总之，这些数据明确证实MAPK信号上调HIF-1的反式激活活性α.
MAPK信号在HIF-1转录激活活性中的作用αA类和B类PDx对HIF-1转录激活活性的影响α用表达G4.H1的质粒转染HeLa细胞α530–826 (2.5μg） 荧光素酶报告子pFR-luc（2.5μg） ●●●●。转染后，用不同剂量的PDx处理细胞，并在常压下培养(纳米x)关于缺氧(血红蛋白)荧光素酶测定前8小时的条件。C类和D类，PDx对G4.H1蛋白水平的影响α530-826在常氧和缺氧条件下。用pG4.H1转染在100mm培养皿中培养的HeLa细胞α530–826 (5μ克/皿）。转染24 h后，将细胞胰酶化，混合，均匀接种到新鲜培养皿中并培养12 h。用指定剂量的PDx处理细胞，并在低氧（2%O2)收获前保持8h。RLU（RLU），相对灯光单位。
HIF-1的直接磷酸化α通过MAPK与其反激活活性无关
鉴于之前的报告指出HIF-1α被MAPK直接磷酸化(32)HIF-1的确切氨基酸残基α磷酸化作用尚未明确确定。此外，不同组关于MAPK诱导的HIF直接磷酸化作用的结果之间存在不一致-α其反式激活活性(31,32). 为了进一步阐明MAPK在HIF激活中的作用，我们首先尝试确定对MAPK抑制剂敏感的功能域。G4.HIF融合构建物包含HIF-1羧基半的不同片段α与pFR-Luc报告基因共转染，转染的HeLa细胞用增加剂量的PDx处理。如所示，所有测试的构造，包括G4.H1α530–778（代表NAD），G4.H1α744–826（代表低氧反应性CAD）和G4.H1α786–826（代表组成性CAD）在常氧和缺氧条件下均被PDx抑制。这些数据表明至少有两种可能性：1）存在一个以上的磷酸化位点，每个被测结构都包含至少一个MAPK介导磷酸化位点；或2）MAPK信号影响NAD和CAD活性所需的蛋白因子。为了验证第一个假设，我们表达了HIF-1α作为GST融合蛋白，并将其用于在体外MAP激酶分析(). 而GST本身并没有被活性MAPK（GST）磷酸化。上半年α530-658和GST。上半年α530-826很容易磷酸化。然而，GST均不适用。上半年α757–826也不是GST。上半年α744–826，对应于低氧反应性CAD(6)，被磷酸化，这表明尽管缺氧反应性CAD和组成型CAD都对PDx处理敏感，但它们不包含MAPK磷酸化位点。
MAPK磷酸化与HIF-1α反式激活活性的相关性A–F，MAPK抑制剂对G4.H1反式激活活性的影响α构造。每个G4.H1α构造（3μg） 与pFR-Luc报告子（2μg） 24h后将细胞胰蛋白酶化，均匀分为12孔培养板。在报告人分析之前，立即添加指定剂量的PDx，并将细胞暴露于任何一种正常毒性(A类,C类、和E类)或缺氧（2%O2)条件(B类,D类、和F类)荧光素酶测定前8小时。克,在体外MAPK分析。HIF-1型α将片段纯化为GST融合蛋白，并与活化的MAPK和[γ-32P] ATP。这个顶部面板显示了放射自显影，以及底部面板显示了蛋白质输入。GST和髓磷脂碱性蛋白(MBP公司)分别作为阴性对照和阳性对照。RLU（RLU），相对灯光单位。
MAPK信号转导促进p300的反激活活性
由于CAD对PDx敏感，但缺乏MAPK磷酸化位点，我们探讨了转录辅激活子可能参与MAPK向HIF的信号传导的可能性。由于p300/CBP是参与HIF激活的主要辅激活因子，我们接下来测试了MAPK对p300反激活活性的影响。表达G4.p300（aa 1–2414）的质粒与pFR-Luc报告子共转染，转染的HeLa细胞用Me处理2SO、PDx或染料木素，并在常氧或缺氧条件下培养。表明缺氧和我2SO对p300反式激活活性影响不大，PDx或染料木素显著抑制了这种活性。PDx的作用呈剂量依赖性()并影响p300的转录激活域（G4.p300TD；aa 1751–2414）(). 此外，用表达ERK1/2上游激活物MEK1的质粒进行转染(36)，增强了p300TD的交易激活活性(). 接下来我们测试了p300TD是否是MAPK的直接底物。我们表达并纯化p300TD（aa 1572–2370）作为GST融合蛋白，并将其用于在体外MAPK分析。我们观察到p300的这个区域很容易被MAPK磷酸化在体外(). 最后，当与NAD（G4.H1）共表达时α530-778），p300（pCMV-β-p300）或CBP（pRSV CBP）增强NAD的反式激活活性，NAD被野生型E1A抑制，但不被靶向p300/CBP缺陷的E1A突变体抑制（未显示）(42)这表明p300也是NAD活性所必需的。因此，PDx对NAD和CAD活性的影响至少部分是由p300/CBP的抑制引起的。
MAPK对p300反式激活活性的影响A类PDx和染料木素对p300反式激活活性的影响。HeLa细胞与表达G4.p300的质粒和GAL4-荧光素酶报告子（pFR-luc）联合转染。将转染细胞均匀分割并暴露于Me2SO公司(二甲基亚砜)，PDx（75μM） 或在荧光素酶测定前立即在常氧或缺氧条件下服用染料木素6小时。B类PDx对p300活性的剂量依赖性影响。将HeLa细胞转染为B类，并且使用了越来越多的PDx，如图所示（μM） ●●●●。C类，PDx对p300TD反式激活域的剂量依赖性效应。用质粒G4.p300TD转染HeLa细胞，表达p300的反式激活域（aa 1751–2414），并将细胞暴露于浓度增加的PDx。D类MEK1过度表达对p300TD反式激活活性的影响。表达MEK1（2）的质粒μg） 用pG4.p300TD（2μg） 和荧光素酶报告子（pFR-Luc；2μg） ●●●●。荧光素酶活性表达为联合转染载体对照的倍增加。E类，p300TD的直接磷酸化在体外由MAPK提供。GST.p300TD在BL21细胞中表达并纯化，用于MAPK激酶检测。RLU（RLU），相对灯光单位。
MAPK信号促进p300和HIF-1αCAD之间的相互作用
HIF-1型α交易激活活动依赖于p300的募集。接下来我们研究了MAPK信号是否影响p300和HIF-1之间的物理相互作用αCAD。我们将HeLa细胞暴露于有无PDx的缺氧环境中。如所示，PDx治疗对p300水平没有影响。我们用细菌表达的GST培养细胞裂解物。上半年α530-826蛋白，用抗p300单克隆抗体免疫印迹法检测纯化后的p300蛋白。如所示而细胞内p300从正常或Me中裂解2SO处理的细胞容易与GST结合。上半年α530-826，少量p300从PDx处理的裂解液中铜纯化。GST时观察到类似结果。上半年α使用了757–826（未显示）。进一步证实阻断MAPK信号会破坏HIF-1/p300相互作用体内，表达G4.H1的质粒α将786–826（结构性CAD）转染到HeLa细胞中，并用Me处理转染细胞2SO或PDx，并在常氧或缺氧条件下培养。Western blot分析显示G4.H1α786–826在所有转染细胞中表达(). 用抗p300或抗Gal4抗体进行免疫沉淀和Western blot分析证实G4.H1α如前所述，786–826与p300相互作用，与氧浓度无关(24). 然而，PDx治疗显著削弱了这种相互作用(,底部两个面板). 这些结果表明MAPK信号促进p300和HIF-1之间的相互作用α计算机辅助设计体内.
MAPK信号调节p300和HIF-1之间的相互作用α计算机辅助设计A类PDx治疗不会影响p300水平。HeLa细胞与PDx在100℃孵育μM持续6 h，用抗p300抗体进行免疫印迹分析细胞裂解产物。B类GST下拉分析。GST和GST。上半年α530–826与全细胞裂解物一起孵育(WCL公司)来自未经治疗或与我一起治疗的HeLa2SO公司(二甲基亚砜)或PDx（100μM） 沉淀在8%的SDS-PAGE中溶解6 h。顶部面板考马斯蓝染色显示GST和GST。上半年α下拉分析中使用的530–826个蛋白质。底部用抗p300单克隆抗体进行Western blotting，证明GST。上半年α未能从PDx处理的细胞裂解液中拉下p300。C类PDx治疗对HIF-1相互作用的影响αCAD和p300体内将G4.H1转染HeLa细胞α786–826，在收获前用或不用PDx处理，并在常氧或缺氧条件下培养6小时。全细胞裂解物(WCL；顶部三个面板)检测HIF-1水平α，磷酸化ERK(ERKp公司)和G4.H1α786–826（通过Western blot）(工作分解结构). 免疫沉淀(I.P公司）用抗p300和抗Gal4单克隆抗体进行，免疫沉淀物用抗Gal5或抗p300单克隆抗体相互检测(底部两个面板).
MAPK信号不是氧气感应机制的一部分
最后，我们研究了MAPK信号是否参与HeLa细胞的氧感应机制。我们首先检测了缺氧或羟化酶抑制剂是否会影响活化（磷酸化）ERK的水平。HeLa细胞在含有10%胎牛血清的正常培养基中培养，在免疫印迹分析中用特异性多克隆抗体检测总ERK和活化ERK水平。如所示在正常培养条件下，总ERK1/2和活化ERK1/2水平较高，既不受缺氧影响，也不受模拟缺氧的Dfx或DOG的影响。MAPK进一步激活对HIF-1反应性的影响α通过过度表达ERK上游激活物MEK1来分析低氧和Dfx。在所有测试条件下，MEK1的过度表达增强HIF-CAD活性，而PDx的加入阻断了MEK1效应(). 最重要的是，MAPK水平的变化不会影响HIF-1的反应性α缺氧活性或Dfx。
MAPK信号在低氧感觉中的作用A类低氧和低氧模拟物对MAPK活性的影响。HeLa细胞维持在常氧或暴露于低氧（2%O2)，Dfx（130μM） ，或狗（1 mM）6小时50μg全细胞裂解物应用于SDS-PAGE。通过免疫印迹法测定总ERK1/2和活化的ERK1/2（pERK1/2）。B类MEK1过度表达对HIF-1的影响α活性及其对缺氧的反应性。2μg pCMV。MEK1或载体单独与2μpG4.H1中的gα744–826和2μg pRR-Luc进入100 mm培养皿中的HeLa细胞。转染24h后，将细胞胰蛋白酶化，均匀分割成12孔培养板。接种后12h，将细胞切换到指定的培养条件或暴露于指定的化学物质6h，然后进行分析。荧光素酶活性标准化为联合转染0.5μg pCMV。β-加仑。RLU（RLU），相对灯光单位。
讨论
自从首次观察到染料木素降低HIF-1和HIF-1蛋白水平以来，磷酸化在HIF激活中的作用已成为一个有争议的问题α和HIF-1β并阻断DNA结合复合体的形成(40). 后来发现，甲乙酮特异性抑制剂PDx抑制缺氧刺激的HIF活性，但对HIF DNA结合复合物的形成几乎没有影响(30). 这些结果表明，MAPK信号可能在HIF-1反式激活活性的调节中发挥作用，但对HIF-1蛋白水平的影响不大β缺氧刺激HIF-1的积累α有报道表明p44/p42激酶（ERK1/2）可直接磷酸化HIF-1α并在对HIF-1无影响的情况下调节其转录活性α缺氧诱导的蛋白质水平(32). 后来发现PTEN/磷脂酰肌醇3-激酶/Akt和MAPK途径都能增强HIF，这进一步使这个问题复杂化-α正常氧条件下肿瘤细胞或有丝分裂信号刺激细胞的水平(43,44)并且有证据表明这种增强涉及HIF-1的控制α翻译(45). 然而，最近的一份报告表明，磷脂酰肌醇3-激酶/Akt途径对于HIF-1的稳定既不需要也不充分α(46). 这里的数据表明HIF-1的反激活活性α受MAPK信号的影响。而低剂量（50μM或更低），PDx在阻断HIF-1的反式激活活性方面非常有效α对蛋白质水平影响很小或没有影响。然而，更高剂量（100μM或更多）PDx减少的低氧累积HIF-1α级别（未显示）。这些数据与MAPK信号转导的翻译作用一致，并表明在某些条件下，MAPK信号可能通过影响HIF-1的蛋白水平来调节HIF活性α.
虽然现在很清楚MAPK信号促进HIF-1的转录激活活性α有人认为MAPK直接磷酸化HIF-α(32)没有直接证据表明MAPK介导的磷酸化与HIF-1的反式激活活性相关α此外，据报道PDx抑制HIF-2α（EPAS1）反式激活活性，但不抑制其磷酸化(31). 然而最近研究表明HIF的C末端结构域-α在多个位点被磷酸化，并且保守苏氨酸残基（Thr）的突变796在HIF-1中α/HIF-2中的T844α)抑制HIF之间的相互作用-α和CBP/p300，这种磷酸化不是由MAPK介导的(47). 我们观察到HIF-1的反应性CAD和本构性CADα被PDx暴露抑制，aa 757–826和aa 744–826区域均未被MAPK磷酸化，表明这不是通过HIF-1的直接磷酸化αMAPK影响HIF-1的转录激活活性αCAD。相反，我们观察到MAPK信号影响p300的反式激活活性，p300是HIF所需的协同激活物-α以及p300和HIF-1之间的相互作用α受MAPK信号的影响。虽然包含NAD和部分氧依赖性降解域的aa 530-743区域被MAPK磷酸化在体外() (48)，因为HIF-1α530-826和HIF-1α757–826表示为大肠杆菌因此，缺乏翻译后修饰，可以有效地结合细胞裂解物中的p300，HIF-1的直接磷酸化αp300的招募不需要。此外，尽管PDx不影响p300水平，HIF-1α在PDx处理的细胞裂解物中未能结合p300，表明MAPK或其下游激酶对p300或其他细胞因子的磷酸化可能调节p300和HIF-CAD之间的相互作用。因此，我们的数据表明，p300和很可能的CBP在HIF激活中充当MAPK信号的集合体。
MAPK依赖的CBP磷酸化最初在调节Elk-1活性中被报道(49)，后来发现通过CBP的MAPK信号传导在T细胞活化中发挥作用(50). 最近，发现苯肾上腺素介导的心肌细胞基因表达刺激通过p300和CBP涉及MAPK信号(51). 有趣的是，MEKK1的过度表达以c-Jun N末端激酶依赖的方式增强了p300的转录活性(52). 由于MEKK1也能激活MEK1，因此MEK1-MAPK通路可能在MEKK1的刺激作用中发挥作用。p300和CBP如何整合MAPK信号目前尚不清楚。因为p300和CBP是参与多种细胞过程的大量转录因子的共同因子(53)，信号介导的p300/CBP在不同相互作用配偶体之间的重新分布可能不同地调节p300/CBP依赖性转录因子(54)以及p300TD的功能，从而根据信号重新编程基因表达。因此，一种可能性是p300和CBP是MAPK或下游激酶的直接底物。支持这一假设的是，有报道称CBP的C末端反式激活域被MAPK磷酸化在体外(49)，我们现在证明p300的C末端反式激活域可以以类似的方式被MAPK磷酸化(). MAPK信号也可能导致p300/CBP相互作用因子池的磷酸化，如其他几个转录因子所示。在这两种情况下，磷酸化事件可能会对p300和各种蛋白因子之间的亲和力产生不同的影响，从而导致p300/CBP在相互作用的伙伴之间的信号介导的重新分布。特别是，由于MAPK信号刺激p300/CBP的反式激活活性，磷酸化事件很可能增强p300/CPP和基本转录机制之间的相互作用。
MAPK信号在HIF激活中的生物学相关性还只是部分了解。以前，在HMEC细胞中观察到缺氧时ERK激活(55). 然而，在我们的系统中，MAPK抑制剂在常氧和缺氧条件下均抑制HIF的转录活性。因此，MAPK依赖性对缺氧或缺氧模拟刺激的HIF活性没有特异性。在暴露于MAPK抑制剂或MEK1过度表达的细胞中，缺氧反应仍然存在。此外，在有血清存在的情况下，MAPK具有组成性活性，激活的MAPK水平不会因缺氧或HeLa细胞中的缺氧模拟物而改变。最后，我们还发现FIH不是MAPK的底物，排除了MAPK通过修饰FIH羟化酶活性向HIF发出信号的可能性（未显示）。这些结果表明MAPK信号不是HeLa细胞缺氧感应机制的一部分。然而，由于MAPK信号促进HIF激活，它可能代表一种独立的途径，将肿瘤发生与HIF激活和血管生成联系起来，并可能协同其他HIF激活途径的作用。
