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.2001年9月17日;20(18):5197-206.
doi:10.1093/emboj/20.18.5197。

脯氨酰羟基化激活的低氧诱导因子-α链中两个破坏域的独立功能

附属公司

脯氨酸羟基化激活的缺氧诱导因子α链中两个破坏结构域的独立功能

N质量等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

低氧诱导因子α(HIF-α)亚单位的氧依赖性蛋白水解破坏在调节低氧转录反应中起着重要作用。最近的研究确定了von Hippel-Lindau肿瘤抑制因子E3泛素连接酶(VHLE3)在这一过程中的关键功能,并确定了与HIF-1α的相互作用,该作用受脯氨酰羟基化调节。在这里,我们表明HIF-α氧依赖降解域(ODDD)中的两个独立区域以依赖脯氨酰羟基化的方式被VHLE3靶向泛素化。在一系列体外和体内实验中,我们证明了HIF系统调节中每个位点的独立和非冗余操作。这两个位点都包含一个共同的核心基序,但在整体序列和与VHLE3连接酶复合物结合的条件上都不同。两个独立破坏域的定义暗示了pVHL-HIF-α相互作用的更复杂系统,但强化了脯氨酰羟基化作为氧依赖性破坏信号的作用。

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数字

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图1。VHLE3连接酶可以与HIF-1αODDD的两个不同区域在功能上相互作用。(A类)泛素化[35S] 通过从VHL缺陷RCC4细胞或稳定转染pcDNA3-VHL(RCC4/VHL)的RCC4细胞质提取物获得的蛋氨酸标记的GAL–HIF-1α融合蛋白。如图所示,在存在或不存在外源性泛素的情况下进行反应。当底物中含有HIF-1α氨基酸344-698、344-553和554-698,但不含氨基酸652-826时,可以看到VHLE3依赖的泛素化,导致通道顶部流动性降低的强烈信号。星号表示全长、正确启动的GAL344-698融合蛋白(参见材料和方法)。(B类)VHLE3依赖于途径纯化成分的泛素化。免疫纯化的GAL–HIF-1α融合蛋白(GAL344–698)在存在E1、E2、VHLE3(E3)、泛素和ATP(通道标记为“+”)的情况下发生泛素化,但在没有任何单独成分的情况下不会发生。(C类)纯化成分分析中不同GAL–HIF-1α融合蛋白的泛素化。使用所有组分(+)或缺乏泛素(–泛素)或VHLE3(–VHLE3)的混合物进行反应。当底物中含有HIF-1α氨基酸344-698、344-553和554-698,但不含氨基酸652-826时,可以看到VHLE3依赖的泛素化。
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图2。GAL344-553底物与细胞提取物预孵育对VHLE3依赖性泛素化的影响。将底物单独在缓冲液(–e.)中孵育,或在细胞质提取物(+c.e.)、核提取物(+n.e.)或细胞质提取物中孵育,这些提取物通过与己糖激酶和葡萄糖(+c.e.+己糖)孵育而耗尽ATP。所有提取物均由缺乏pVHL的RCC4细胞制备。免疫纯化后,在VHLE3存在(+)或不存在(-VHLE3)的情况下,在纯化组分分析中对GAL344–553底物进行泛素化。细胞质提取物预处理大大增强了VHLE3依赖的泛素化。
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图3。确定支持VHLE3相互作用和泛素化的HIF-α序列。(A–C)GAL-HIF-1α或GAL–HIF-2α融合蛋白底物的泛素化,这些底物已单独在缓冲液(–C.e.)或细胞质提取物(+C.e。(A类)基于外显子的分析表明,HIF-1α外显子9(残基344-417)编码的序列构成VHLE3依赖泛素化的N末端ODDD靶位点。请注意,实际的外显子10-11边界位于氨基酸512-513处。(B类)同源HIF-1α和HIF-2α序列的分析表明,VHLE3靶位点在HIF-α亚型之间是保守的。(C类)对N-末端ODDD靶位点的进一步分析表明,高效泛素化需要HIF-1α残基360–417,而残基380–417支持减少但仍显著依赖VHLE3的泛素化。(D类)VHLE3相互作用分析。指示的[35S] 蛋氨酸标记的GAL–HIF-1α融合蛋白在单独缓冲液(–c.e.)或细胞质提取物(+c.e。然后添加786-0 HA●VHL细胞提取物(在不支持VHLE3靶点修饰的缓冲液中制备),并进行抗HA免疫沉淀。通过SDS-PAGE和放射自显影术分析检索到的GAL-HIF-1α融合蛋白的免疫沉淀和输入样本。HIF-1α残基380–417构成暴露于c.e.后能够与VHLE3相互作用的最小结构域。
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图4。识别VHLE3靶向的潜在核心基序。(A类)人类HIF-1α中确定的N端和C端VHLE3结合位点的氨基酸序列与其他物种(如图所示)的相应区域以及HIF-2α序列对齐。核心图案有阴影。(B类)该核心基序突变对VHLE3依赖的泛素化的影响。GAL344-417底物和指示的突变衍生物单独用缓冲液(-)或细胞质提取物(+)预处理,免疫纯化后添加到含有或不含VHLE3的泛素化反应中。突变体P402A和LL397400AA,但非P394A,消融活性。(C类)在与GAL报告基因pUAS-tk-Luc联合转染的U2OS细胞中,含有指示HIF-1α序列的GAL–HIF-1 a-VP16融合蛋白的氧调节活性。柱显示校正的荧光素酶活性,三个独立实验的平均值±1 SE。在HIF-1α残基344-417中观察到调节的融合蛋白活性,但在P402A突变衍生物或HIF-1β残基344–400中未观察到调节融合蛋白活性。
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图5。脯氨酸残基402和564对HIF-1α的调节至关重要在体外体内. (A类)在存在(+)或不存在(-)外源泛素的情况下,通过RCC4或RCC4/VHL细胞的细胞质提取物对野生型HIF-1α或指示突变体进行泛素化。双突变体P402A+P564G没有显示出VHLE3依赖的泛素化,但每个VHLE3靶位点的关键脯氨酸残基的单一突变仅部分降低泛素化。(B类)与HRE报告质粒pGL3PGK6TKp共同转染的HIF-1α缺陷CHO-Ka13细胞中瞬时转染的野生型HIF-1 a和指示的突变衍生物的活性。柱显示校正的荧光素酶活性,三个独立实验的平均值±1 SE。与野生型HIF-1α相比,单个脯氨酸突变体显示出部分增强的常氧活性,而组合突变体在常氧条件下显示出完全的组成活性。(C类)在常氧条件下生长的HIF-1α缺陷CHO-Ka13细胞提取物中瞬时转染的野生型HIF-1α和指示的突变衍生物的免疫印迹分析。
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图6。N-末端VHLE3靶位点由脯氨酰羟基化调节。(A类)补充铁(II)对VHLE3依赖性泛素化的影响。GAL344-417和GAL554-698底物单独在缓冲液(–)、细胞质提取物(+)或添加铁(Fe)的细胞质提取物中预先培养2++). 免疫纯化后,在有(+)或无(-)VHLE3的纯化成分分析中,底物泛素化。这两种底物都表现出VHLE3依赖的泛素化作用,通过添加额外的铁进行预处理可以增强泛素化。(B类)脯氨酸类似物3,4-脱氢的作用--脯氨酸与VHLE3相互作用。[35S] 在含有过量蛋氨酸的反应中制备了标记为GAL–HIF-1α的蛋氨酸底物-脯氨酸(P)或3,4-脱氢--脯氨酸(D),并使用786-0 HA●VHL细胞提取物测试VHLE3相互作用,如图3D所示(参见材料和方法)。放射自显影显示抗HA免疫沉淀物中相互作用的GAL–HIF-1α蛋白的SDS–PAGE分析以及输入样本。(C类)脯氨酰羟化酶抑制剂的作用N个-草酰甘氨酸对GAL380–417 P394A底物的修饰。N个-草酰甘氨酸(1mM)抑制细胞质提取物的修饰活性并阻止VHLE3相互作用。通过添加5 mM 2-酮戊二酸盐,部分恢复了修饰。(D类)VHLE3与合成肽的相互作用。与HIF-1α残基390-417(B28PRO)对应的生物素化肽,或与Pro402被羟脯氨酸取代的相应肽(B28HYP),在与786-0 HA●VHL细胞提取物孵育之前,仅与缓冲液(–c.e.)孵育。在使用链霉亲和素珠回收肽后,通过抗-HA免疫印迹检测捕获的HA●VHL。B28HYP而非B28PRO捕获了HA●VHL。在VHLE3相互作用之前,B28PRO也与细胞质提取物(+c.e.)孵育。(E类)过量的B28HYP而非B28PRO阻止VHLE3依赖的泛素化。GAL344-553底物单独用缓冲液(-c.e.)或细胞质提取物(+c.e.)预处理,然后在存在或不存在肽的情况下添加到纯化成分泛素化分析中,如图所示。
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图7。VHLE3靶向HIF-1αODDD中N和C末端位点的不同要求。(A类)普通和S100细胞质提取物的比较。[35S] 蛋氨酸标记的GAL344-553和GAL554-698底物在新鲜细胞质提取物(+)、在4°C下放置4 h(4°C 4 h+)的细胞质提取物或RCC4/VHL细胞细胞质提取物的S100上清液(S100+)中泛素化。S100提取物支持GAL554-698的VHLE3依赖泛素化,但不支持GAL344-553。(B类)GAL-HIF-1α与网织红细胞裂解物中产生的HA●VHL的相互作用。[35S] 在使用抗-GAL进行免疫沉淀之前,将蛋氨酸标记的C末端HA标记的VHL(VHLHA)或N末端HA标记VHL(数据未显示)与非放射性标记的GAL–HIF-1α底物混合并在缓冲液(–)或细胞质提取物(+)中孵育。VHLHA与GAL554–698共免疫沉淀,而GAL652–826和GAL344–553的结合背景水平。GAL–HIF-1α蛋白的等效免疫沉淀通过抗GAL免疫印迹证实(数据未显示)。

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