溶酶体膜蛋白SLC38A9对氨基酸依赖性mTORC1的调节

质粒。

从开放阅读框（ORF）产生的PCR产物（从人类ORFeome收集物中获得）被克隆到Gateway pDONR223入口载体中。根据制造商的说明（KOD热启动DNA聚合酶；Merck Millipore），PCR用于质粒突变（RRAGB Q99L、RRAGB T75L、RRACC Q120L和RRAGC S54L）。序列验证后，将cDNA亚克隆到Gateway目的载体中，用于哺乳动物表达。使用pHAGE-N-Flag-HA、MSCV-i（N-Flag-HA）-IRES-PURO、pDEST-MYC和pHAGE-N-GFP载体瞬时转染293T细胞。稳定的293T REx或293T细胞通过MSCV-i（N-Flag-HA）-IRES-PURO的逆转录病毒转导或GIPZ非沉默短发夹RNA（shRNA）对照（RHS4346；GE Healthcare）、GIPZ shRHEB 1（GGGTGATCAGTTATGAAGA）或GIPZ shRHEB 2（TCAGACATACTCCATAGAT）的慢病毒转导产生，然后用抗生素进行选择。

细胞培养。

HEK-293T或HEK-293-REx细胞在添加10%胎牛血清（FBS）、2 mM谷氨酰胺和抗生素的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中培养，并保持在37°C和5%CO下₂收获前24至48小时，通过添加多西环素（4μg/ml；Sigma）诱导293T-REx细胞系中HA标记蛋白的表达。使用以下试剂：Torin1（250 nM；Tocris）和环己酰亚胺（2μg/ml；钙生物化学）。

氨基酸饥饿。

根据制造商的说明（pH 7.4）制备无氨基酸RPMI培养基（不含氨基酸的RPMI 1640培养基；Biomol）。对于氨基酸饥饿，用无氨基酸RPMI培养基冲洗细胞三次，然后在无氨基酸RPMA培养基中培养50分钟。如有指示，通过添加添加有RPMI 1640氨基酸溶液（50×；Biomol）的无氨基酸RPM培养基，用氨基酸刺激细胞50分钟（喂食）或10分钟（补充），使最终氨基酸浓度与标准RPMI培养基中的氨基酸浓度相同。对于单个氨基酸补充，无氨基酸RPMI培养基补充谷氨酰胺（200μM；Life Technologies）、精氨酸（114μM；Sigma）或亮氨酸（38μM；Sigma）。

基于转染的实验。

使用Lipofectamine RNAiMax（Life Technologies）将靶向人类SLC38A9（生命技术和Dharmacon）或对照siRNA（隐形RNAi siRNA阴性对照、Med GC（生命技术）和ON-TARGETplus非靶向池（Dharmacon]）的短干扰RNA（siRNAs）反向转染细胞根据制造商的说明，通常在转染72小时后收获。siRNA序列如下（5′至3′）：SLC38A91，ACCATGATGAGAACATCATAAA（HSS135864）；SLC38A9 2，ACACTGAAGGATCGTAA（J-007337-17）。根据标准方案，使用Lipofectamine 2000（Life Technologies）或PEI（聚乙烯亚胺；Polysciences Europe GmbH）转染质粒。

免疫印迹。

蛋白质通过SDS-PAGE（4至20%凝胶[Bio-Rad]或自铸8%和12%凝胶）分离，并转移到硝化纤维素膜（0.45μm；NitroBind；Fisher Scientific）。用含有5%牛血清白蛋白（BSA）（Sigma）或5%低脂牛奶（Roth）的TBS-T（20 mM Tris，150 mM NaCl，0.1%吐温20）封闭膜。在4°C的封闭缓冲液中与一级抗体和二级抗体（抗鼠抗体–辣根过氧化物酶[HRP][Promega]、抗兔抗体–HRP[Promega]、抗鼠IgG1（κ）[ab99617；Abcam]、抗小鼠IgG2重链[ab97240；Abcam]和抗大鼠抗体–HRP[Dianova]）孵育一整夜)用TBS-T洗涤后添加1小时。

IP。

通过添加4μg/ml强力霉素（Sigma）或瞬时转染诱导HA标记蛋白的表达。转染后48小时或诱导后24小时，收集细胞并储存在−80°C。在冰镇MCLB NP-40缓冲液（50 mM Tris[PH7.4]，150 mM NaCl，0.5%NP-40补充cOmplete EDTA游离蛋白酶抑制剂片（Roche）和磷酸酶抑制剂（PhosSTOP；Roche在4°C下过夜。然后，用MCLB缓冲液洗涤琼脂糖珠三次，通过添加4×Laemmli缓冲液在95°C下煮沸或不煮沸5分钟来洗脱结合蛋白。然后通过SDS-PAGE和免疫印迹分析样品。

内源性免疫沉淀。

293T细胞在HEPES缓冲液中冰上溶解30分钟。通过离心去除细胞碎片，并通过添加蛋白质A/G和琼脂糖珠（Santa Cruz）在4°C下预处理1 h。将预先清除的裂解物与所示抗体在4°C下培养过夜，然后添加琼脂糖珠培养2 h。用HEPES缓冲液洗涤三次后，通过添加4×Laemmli缓冲液洗脱蛋白质，并在95°C下煮沸5 min。蛋白质通过SDS-PAGE分离并通过免疫印迹或凝胶内胰蛋白酶消化和质谱（MS）分析。

基于MS的蛋白质组学。

在每种条件下，用4μg/ml多西环素（Sigma）在四个15厘米的细胞培养皿中诱导293T-REx细胞中HA标记诱饵蛋白的表达24小时。细胞用冰镇磷酸盐缓冲液（PBS）清洗和采集，然后在−80°C下储存或立即在4 ml MCLB缓冲液中溶解。通过离心将细胞碎片从裂解液中清除，上清液通过0.45-μm旋转过滤器（Millipore）。将抗-HA–琼脂糖（60μl浆液；Sigma）添加到裂解液中，在4°C下旋转过夜进行免疫沉淀。样品用1 ml MCLB洗涤五次，然后用PBS洗涤五次并用150μl HA肽（250μg/ml；Sigma）洗脱。如前所述，对洗脱的免疫复合物进行处理和分析(27,28). 简单地说，用三氯乙酸（Sigma）沉淀蛋白质，然后用胰蛋白酶（Promega）消化，并通过阶段尖端脱盐。在LTQ Velos（Thermo Scientific）上对样品进行技术重复分析。光谱通过Sequest搜索进行识别，然后进行参考文献中描述的目标诱饵过滤和线性判别分析29根据简约原则，将数据库中可分配给多个蛋白质的肽组装成蛋白质。为了进行CompPASS分析，我们使用了215个以前以相同方式处理的无关诱饵蛋白(27,28). 加权和标准化D得分（WD^N个分数）根据平均肽谱匹配（APSM）计算。WD蛋白质^N个≥1和≥3的APSM被认为是高置信候选相互作用蛋白（HCIPs）。

凝胶内胰蛋白酶消化。

SDS-PAGE后，根据制造商的说明对凝胶进行银染色（SilverQuest染色试剂盒；Life Technologies），然后切割整个泳道并用含有50%乙腈（ACN）的50mM碳酸氢铵（ABC）洗涤三次，然后用ACN脱水10分钟，用20 mM ABC中的10 mM二硫苏糖醇（DTT）在56°C下还原45分钟。对于烷基化，凝胶片在黑暗中用55 mM碘乙酰胺在20 mM ABC中培养30分钟，然后用含有50%ACN的5 mM ABC洗涤两次，然后用ACN脱水和真空离心。随后，将凝胶片与12.5 ng/μl胰蛋白酶在20 mM ABC中孵育过夜，并随着ACN浓度的增加洗脱三次。对LTQ Velos进行了分级脱盐和质谱分析。如上所述对光谱进行了鉴定。

RNA分离、cDNA合成和RT-qPCR。

使用高纯度RNA分离试剂盒（Roche）分离293T细胞的总RNA，然后使用转录因子第一链cDNA合成试剂盒（罗氏）将其反转录成cDNA。对LightCycler 480（Roche）进行实时定量PCR（RT-qPCR），使用带有SLC38A9特异性引物的LightCyscler 480 SYBR绿色I母版（qPCR_SLC38A9_for，CAGTTTAGCCATCGGATCT；qPCR_SLC38A9 _rev，GGTAGCGGCTGTAAAT）或RHEB GTPase（qPCR _RHEB_for，TACCGTGGAATC；qPCR R_RHEB_rev，TATTCATTGCCCGGCTGTGTGTGT）。将SLC38A9或RHEB mRNA的相对表达归一化为三个参考基因的几何平均值（ACTB、HMBS和TBP；qPCR_ACTB_for、CGGGAAAATCGTGACATTAAG；qPCR-ACB_rev、TGATCTCCTTGCATCCTGGG；qPCR_HMBS_for、CCCTGGAGAATGAAGATTGG；qPCR_HMBS-rev、TTCTGGAGTCTTAGG；qPCR_TBP_rev，TATTGTGTTCTGAATAGGCTGTGG）。

免疫荧光。

293T或293T-REx细胞接种在聚乙烯上-我-在siRNA或质粒转染后，赖氨酸包被384孔板（PerkinElmer）并用4%多聚甲醛固定。用0.5%Triton X-100在PBS中渗透细胞（10分钟），然后用1%BSA在PBS内封闭1小时。一级和二级抗体，以及核和细胞质染色试剂（Alexa荧光偶联抗体；生命科技）、抗鼠抗体–Cy3（Jackson ImmunoResearch）、DRAQ5（Cell Signaling）、，和HSC CellMask深红色染色剂（Life Technologies）在PBS中的0.1%BSA中孵育1小时，其间三次洗涤PBS。对于双重染色，抗体按顺序培养。使用60倍水浸物镜在PerkinElmer的Opera高内容筛查系统上采集图像，并使用Acapella高内容成像分析软件（PerkinEl默）进行可视化。为了评估mTOR易位，使用Acapella软件自动计算每个细胞中mTOR或LAMP2阳性点的数量。为了计算皮尔逊相关系数，沿ImageJ中的一条线测量叠加图像的不同通道中的像素强度，并使用GraphPad Prism和Excel进行分析。

SLC38A9的细胞溶质尾部足以介导与Rag-Ragulator复合体的结合。

SLC38A9预计包含11个跨膜结构域(32)和一条119英亩长的面向细胞质的N末端尾巴(图2A). 为了确定SLC38A9的哪一部分介导与Rag和LAMTOR蛋白的结合，我们在稳定的293T-REx细胞中瞬时表达全长SLC38A 9和N末端细胞溶质片段（aa 1至119）作为GFP融合物，诱导表达HA标记的Rag或LAMTOR蛋白质。免疫沉淀实验表明，仅当使用N末端片段时，SLC38A9与RRAGA、RRAGB和LAMTOR1的结合才得以保留甚至增强(图3). 我们还将来自诱导表达SLC38A9的N末端细胞溶质片段的细胞的裂解物进行IP-MS分析。LAMTOR1、LAMTOR2、LAMTOR 3和LAMTOR5，以及与SLC38A9的前119个氨基酸相关的RRAGB和RRAGC(图2A，灰色箭头）。因此，这些结果表明SLC38A9的N末端可溶性部分足以与Rag-Ragulator复合物的几个亚单位结合。

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图3

SLC38A9的细胞质N末端介导与Rag-Ragulator复合体的关联。将GFP-SLC38A9全长、GFP-SLC38A9 aa 1至119或GFP单独转染293T-REx细胞，诱导表达所示HA标记的Rag或LAMTOR蛋白。NP-40细胞裂解物用抗GFP微球进行免疫沉淀，用SDS-PAGE和免疫印迹法检测共免疫沉淀蛋白。

SLC38A9定位于溶酶体。

考虑到SLC38A9与Rag和LAMTOR蛋白相关，它们位于溶酶体的外围，我们检测了SLC38A的亚细胞定位。而GFP标记的SLC38A9定位于LAMP2阳性囊泡，具有较强的正相关（皮尔逊相关系数[R（右）]0.9），缺乏所有跨膜结构域的N末端片段主要分布在胞浆和细胞核中(图4A). 然而，一小部分GFP标记的SLC38A9（aa 1至119）也与LAMP2阳性囊泡共定位，仍保持中间正相关(R（右）=0.56），可能是由于与Rag-Ragulator复合物成分的相互作用(图4A). 此外，内源性SLC38A9和LAMP2在整个细胞溶质的间断性囊泡结构中同时检测到，且呈强正相关(R（右）= 0.88) (图4B). 值得注意的是，RNAi介导的SLC38A9缺失表明抗体的这种囊泡染色对SLC38A 9是特异的(图4B)SLC38A9和LAMP2的剩余非特异性核染色无相关性(R（右）= 0.12). 因此，SLC38A9是一种溶酶体跨膜蛋白。

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图4

SLC38A9定位于溶酶体。（A） 将转染GFP-SLC38A9全长或GFP-SLC38A9 aa 1至119的293T细胞固定并用抗LAMP2抗体染色。比例尺，10μm。皮尔逊相关系数(R（右）)沿ImageJ中的一条线测量叠加图像的不同通道中的像素强度后，在Excel中计算。A.U.，任意单位。（B） 293T细胞转染非靶向对照（sicon）或SLC38A9型siRNA被固定，并用抗SLC38A9和抗LAMP2抗体标记。比例尺，10μm。R（右）按照面板A所述进行计算。

SLC38A9与Rag-Ragulator复合物的定位和结合受到氨基酸的不同影响。

由于Rag GTPases和Ragulator以氨基酸依赖的方式调节mTORC1活性，我们监测了在氨基酸保护（氨基酸饥饿培养基）和喂食（氨基酸饥饿补充培养基）条件下SLC38A9定位的动力学以及与Rag-Ragulattor复合物组分的关联。共聚焦显微镜显示，内源性SLC38A9与HA标记的RRAGC、LAMTOR2和LAMTOR5以及内源性LAMP2共定位，与细胞氨基酸状态无关，且具有较强的正相关性（0.82≤R（右）≤ 0.97) (图5). siRNA介导的SLC38A9缺失证实了囊泡SLC38A染色的特异性，显著降低了相关性（-0.65≤R（右）≤ 0.20) (图5). 值得注意的是，氨基酸饥饿诱导LAMP2聚集(33)-和SLC38A9-阳性溶酶体，以及与这些簇共定位的过度表达的HA-RRAGC、HA-LAMTOR2和HA-LAMTAR5(图5).

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图5

SLC38A9与Rag-Ragulator复合物的氨基酸依赖性共定位。用对照（sicon）或SLC38A9型小干扰RNA。在用抗HA或抗LAMP2和抗SLC38A9抗体进行固定和标记之前，细胞在完整的RPMI生长培养基（喂食）中培养50分钟或饥饿氨基酸。比例尺，10μm。在ImageJ中沿一条线测量叠加图像的不同通道中的像素强度，以及皮尔逊相关系数(R（右）)在Excel中计算。

免疫沉淀实验表明，当氨基酸饥饿时，GFP标记的全长SLC38A9与HA标记的RRAGA和RRAGC的相互作用显著增强。相反，GFP标记的SLC38A9 aa 1至119与HA-RRAGA和HA-RRAGC的结合对氨基酸不敏感(图6A). 如其他Rag GTPase相互作用蛋白所述(20,23)SLC38A9与RRAGA/RRAGC或RRAGB/RRAGC异二聚体的结合依赖于其核苷酸状态。虽然Rag GTPase突变体RRAGB-Q99L和RRAGC-S54L锁定在mTORC1激活核苷酸状态，与野生型RRAGB/RRAGC相比，完全消除了共免疫沉淀SLC38A9的数量，但当Rag GTPase突变体RRAGB-T75L和RRACC-Q120L时，SLC38A的结合增加，它们被锁定在核苷酸结合状态(图6B). 值得注意的是，SLC38A9首选与RRAGA/RRAGC绑定，而不是与RRAGB/RRAGC配对(图6B). 在RNAi介导的SLC38A9-缺失细胞中，过度表达myc-tagged LAMTOR2与野生型RRAGB/RRAGC和突变型RRAGB-T75L/RRAGC-Q120L异二聚体越来越相关(图6B). 重要的是，SLC38A9缺失对Ragulator、Rag GTPase和mTORC1复合物的组成没有影响(图6C到​toE；E类; 另见补充材料中的表S1D）。因此，无论营养条件如何，SLC38A9都与Rag-Raulator复合物在溶酶体定位，而SLC38A9和Rag GTP酶之间的相互作用由其核苷酸结合状态决定，并且在依赖于SLC38A9跨膜结构域的氨基酸饥饿时进一步加强。

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图6

SLC38A9与Rag GTPases的结合依赖于氨基酸和核苷酸。（A） 将GFP-SLC38A9全长、GFP-SLC38A9 aa 1至119或GFP单独转染293T-REx细胞，诱导表达HA标记的Rag GTPase蛋白。细胞要么在完全RPMI生长培养基（喂食）中生长50分钟，要么氨基酸（aa）缺乏，随后用MCLB NP-40裂解以进行GFP免疫沉淀。用SDS-PAGE和免疫印迹法分析免疫沉淀物。（B） 293T细胞转染非靶向对照（sicon）或SLC38A9型siRNAs和myc-tagged LAMTOR2，以及野生型（RRAGB野生型[RB-wt]、RRAGC野生型[RC wt]和RRAGA野生型[RA wt]）或突变型（RRAGB Q99L[RB-QL]、RRAGB T75L[RB-TL]、RRACC Q120L[RC QL]、RRAGC S54L[RC SL]）HA-taged Rag GTPase蛋白，如图所示。在HEPES缓冲液中溶解细胞，进行HA-免疫沉淀，并如上所述进行分析。（C） 用对照（sicon）或SLC38A9型siRNA如图所示，随后在MCLB CHAPS缓冲液中裂解，并用HA珠免疫沉淀。用MS分析洗脱液。肽的数量显示为每种蛋白质0到100个肽。完整的蛋白质组数据见补充材料中的表S1D。（D） 在HEPES缓冲液中溶解类似于C组的细胞，然后进行免疫沉淀、SDS-PAGE和免疫印迹。（E） 如面板C所述转染猛禽过表达293T-REx细胞，在MCLB CHAPS缓冲液中裂解，并按面板D所述分析。

mTORC1信令需要SLC38A9。

接下来我们研究了mTORC1激酶活性是否受SLC38A9调节。在SLC38A9缺失细胞中，mTORC1底物S6K（核糖体蛋白S6激酶；70-kDa，多肽1）、4EBP1（真核翻译起始因子4E结合蛋白1）和ULK1（unc-51样自噬激活激酶1）的磷酸化降低，而其总蛋白水平保持不变(图7A和​和B）。B). 值得注意的是，SLC38A9的敲除被免疫印迹证实(图7A和​和B）B)和RT-qPCR(图7C). 相反，当全长SLC38A9或其N末端片段过度表达时，我们观察到S6K和ULK1的磷酸化增加(图7D). 重要的是，当用mTOR催化抑制剂Torin1处理细胞时，SLC38A9过度表达诱导的mTORC1过度活性被完全消除(图7E)并且当GTPase RHEB被特异性耗尽时显著降低(图7F)，表明SLC38A9介导的mTORC1激活是通过RHEB实现的。RT-qPCR证实RHEB耗竭(图7G). 总之，我们的数据以及SLC38A9与其他SLC38类蛋白质的同源性(34)提出溶酶体跨膜蛋白SLC38A9以氨基酸敏感性方式控制mTORC1激酶活性的可能性。

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图7

SLC38A9调节mTORC1活性。（A和B）293T细胞转染不同的非靶向对照（sicon）或SLC38A9型如图所示的siRNAs。细胞裂解物进行SDS-PAGE和免疫印迹。使用磷酸特异性抗体测定S6K（A）、ULK1（A）和4EBP1（A和B）的磷酸化状态。PCNA用作装载控制。暴露。（C） 此外，通过RT-qPCR证实了面板A和B中SLC38A9的敲除。几何平均值。（D） 将HA-SLC38A9全长、HA-SLC38 A9 aa 1至119或空载体转染293T细胞。转染48小时后，对细胞进行裂解，并使用磷酸特异性抗体测定mTORC1底物的磷酸化状态。PCNA用作装载控制。（E） 以Torin1（1 h，250 nM）或二甲基亚砜（DMSO）作为对照，并按照D组所述进行分析。（F）分别用HA-SLC38A9全长或空载体转染稳定shRNA-介导的RHEB GTPase缺失或对照293T细胞，然后进行SDS-PAGE和免疫印迹。通过测定S6K的磷酸化状态来评估mTORC1活性。（G） RT-qPCR证实了面板F中显示的RHEB GTPase敲除。

SLC38A9根据氨基酸可用性调节mTORC1活性。

为了验证我们的假设，我们在SLC38A9缺失或过度表达的细胞中监测了mTORC1活性对氨基酸稳态改变的反应。首先，我们用环己酰亚胺（CHX）处理细胞，众所周知，CHX可以增加细胞内的氨基酸库(35,——37). 正如预期的那样，在CHX治疗后，ULK1和4EBP1的磷酸化增加。然而，SLC38A9的耗竭完全抑制了这种作用(图8A). 其次，我们在缺乏氨基酸的情况下培养细胞很快（50分钟）。与喂食细胞相比，氨基酸饥饿时ULK1的磷酸化降低(图8B). 相反，氨基酸饥饿并没有加剧SLC38A9缺失细胞中观察到的ULK1磷酸化降低(图8B). 与此相一致，SLC38A9的过度表达部分恢复了氨基酸饥饿诱导的ULK1磷酸化降低(图8C). 第三，在短时间的氨基酸饥饿后，我们补充了所有氨基酸或已知调节mTORC1活性的单个氨基酸，即谷氨酰胺、精氨酸或亮氨酸(15,38,39). 在siRNA控制细胞中，ULK1的磷酸化在所有补充条件下都增加。然而，在SLC38A9缺失的细胞中，无论是使用全部还是仅使用单个氨基酸，在氨基酸补充后ULK1磷酸化仅略微增加(图8D). 总之，我们提供的证据表明，SLC38A9蛋白水平的改变使细胞对氨基酸的可用性部分不敏感。

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图8

SLC38A9根据氨基酸可用性调节mTORC1活性。（A和B）用非靶向对照（sicon）转染72小时后，或SLC38A9型siRNA，293T细胞用CHX（2 h，2μg/ml）或DMSO处理作为对照（a），或喂食或氨基酸饥饿50 min（B），如图所示。将细胞裂解物与所示抗体进行SDS-PAGE和免疫印迹。PCNA作为装载控制。（C） 将转染HA-SLC38A9或空载体的293T细胞的裂解液喂食或将氨基酸饥饿50分钟，并用所示抗体进行免疫印迹分析。PCNA作为负载控制。（D） 293T细胞转染非靶向对照（sicon）或SLC38A9型siRNA要么被氨基酸饥饿50分钟，要么被氨基酸饿死50分钟，然后用指定的氨基酸补充10分钟。使用磷酸特异性抗体测定ULK1的磷酸化状态。PCNA作为装载控制。星号表示非特定带。

我们感谢J.W.Harper对CompPASS的关键访问。我们感谢S.Müller、I.Dikic和S.Oess随时共享协议和试剂，感谢D.McEwan的有益讨论。抗受体抗体和RHEB GTPase cDNA是来自I.Dikic的礼物。我们从S.Fulda获得了RHEB shRNAs。我们感谢贝伦兹实验室的成员提供资源和进行讨论。我们感谢I.Dikic的慷慨支持。

这项工作得到了德国研究基金会（BE 4685/1-1）和欧洲研究理事会（282333）的资助。

J.J.和H.M.G.进行了所有实验。C.B.和J.J.构思了这项研究。J.J.、H.M.G.和C.B.撰写了这份手稿。