神经生物学疾病。作者手稿;PMC 2014年3月19日提供。
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尼姆斯:美国国立卫生研究院556726
自闭症患者大脑颞叶线粒体异常
,一 ,一 ,一 ,一 ,b条 ,c(c) ,b、,c(c) ,a、,d日 ,一 ,c(c)和a、,b、,e、,*
普里·古铁雷斯·里奥斯
一美国纽约哥伦比亚大学神经病学系
哈桑·奥汉·阿克曼
一美国纽约哥伦比亚大学神经病学系
戈拉兹·罗索克利亚
b条美国纽约哥伦比亚大学精神病学系
Kurenai Tanji公司
c(c)美国纽约哥伦比亚大学病理与细胞生物学系
安德鲁·德沃克
b条美国纽约哥伦比亚大学精神病学系
c(c)美国纽约哥伦比亚大学病理与细胞生物学系
埃里克·肖恩
一美国纽约哥伦比亚大学神经病学系
d日美国纽约哥伦比亚大学遗传与发展系
詹姆斯·高曼
c(c)美国纽约哥伦比亚大学病理与细胞生物学系
大卫·苏尔泽
一美国纽约哥伦比亚大学神经病学系
b条美国纽约哥伦比亚大学精神病学系
e(电子)美国纽约哥伦比亚大学药理学系
一美国纽约哥伦比亚大学神经病学系
b条美国纽约哥伦比亚大学精神病学系
c(c)美国纽约哥伦比亚大学病理与细胞生物学系
d日美国纽约哥伦比亚大学遗传与发展系
e(电子)美国纽约哥伦比亚大学药理学系
*通讯作者:美国纽约州纽约市第168街西650号布莱克大厦309室神经内科、精神病学和药理学系,邮编:10032。传真:+1 212 342 3664。,ude.aibmuloc@34sd(D.苏尔寿) 摘要
孤独症谱系障碍(ASD)由一组复杂的发育障碍组成,其特征是社交障碍、沟通障碍和重复行为。多种证据表明ASD患者存在线粒体功能障碍。在ASD中表现出突触病理的BA21颞叶皮层死后区域,我们发现与对照组相比,ASD患者表现出线粒体呼吸链蛋白复合物蛋白水平的改变,复合物I和IV活性降低,线粒体抗氧化酶SOD2降低,DNA氧化损伤加重。ASD脑线粒体膜蛋白Tom20、Tim23和孔蛋白的蛋白水平较高,表明线粒体膜质量较高。线粒体DNA或线粒体基因转录因子TFAM或辅因子PGC1α、,表明线粒体基因组或线粒体生物发生改变以外的机制是这些线粒体异常的基础。我们进一步发现ASD患者线粒体裂变蛋白(Fis1和Drp1)水平较高,融合蛋白(Mfn1、Mfn2和Opa1)水平降低,表明ASD患者脑线粒体动力学发生改变。其中许多变化在皮质锥体神经元中很明显,在ASD儿童中观察到,但在成人患者中不太明显或不存在。总之,这些发现提供了证据,证明ASD大脑锥体神经元的线粒体功能和细胞内氧化还原状态受到损害,并且线粒体功能障碍发生在儿童早期ASD症状出现时。
关键词:自闭症、线粒体、颞皮质、发育
介绍
自闭症谱系障碍(ASD)是一种复杂的神经发育疾病,包括一系列认知和行为表型,包括自闭症、阿斯伯格综合征和普遍性发育障碍,其特征是社交、沟通和语言受损,以及重复和定型行为(美国精神病学协会,1994年). 病理结果表明,出生后早期的神经发育改变对ASD发病至关重要,可能导致神经元过度生长和/或轴突过度生长(Courchesne等人,2007年)和树突棘(Hutsler和Zhang,2010年). 在大多数情况下,ASD病理的病因和生物学基础尚不清楚,建议遗传易感性和环境因素都参与其中(罗西诺和弗莱,2012b).
线粒体功能受损与正常衰老和神经精神疾病有关,包括帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、亨廷顿病(HD)、情绪障碍和精神分裂症(Lin和Beal,2006年;Manji等人,2012年;肖恩和曼弗雷迪,2003年;特鲁希纳和麦克默里,2007年). 线粒体通过呼吸链通过氧化磷酸化(OXPHOS)产生能量,在正常生理条件下产生95%以上的神经元ATP(Benard等人,2007年). 呼吸链包括电子传递链(ETC)蛋白NADH-泛醌氧化还原酶(复合物I)、琥珀酸泛醌氧化酶(复合物II)、泛醌细胞色素c(c)氧化还原酶(复合物III),细胞色素c(c)氧化酶(复合物IV)和ATP合成酶(复合物V)。通过ETC复合物的电子传递效率低下,会因能量损失而导致大脑病理,而这些酶的缺陷,尤其是复合物I、II和III,会导致呼吸链泄漏与氧反应的电子,形成有毒的反应性自由基物种。
最近的证据表明线粒体功能障碍可能参与ASD的发展和临床特征(罗西诺和弗莱,2012a). 研究已确定与线粒体能量缺乏生化内表型相关的特征,包括与线粒体功能障碍相关的异常血浆生物标记物,如血浆乳酸、丙酮酸、肉碱和氨基酸(Weissman等人,2008年),并按下ETC复合功能(Giulivi等人,2010年)线粒体膜电位降低(James等人,2009年)在ASD淋巴母细胞系中。复合体I缺陷是ASD中最常见的线粒体缺陷,已发现与复合体III和复合体IV缺陷有关(哈斯,2010年). 在一组ASD儿童中,已发现丙酮酸脱氢酶复合物(PDHC)活性低、线粒体过氧化氢生成率较高以及线粒体DNA(mtDNA)过度复制和/或缺失的证据(Giulivi等人,2010年).
在死后的人脑中,Chauhan等人(2011年)据报道,ASD儿童小脑、颞叶和额叶线粒体呼吸链复合体表达减少。ASD患者小脑中复合物III和V、额叶皮质中复合物I以及颞叶皮质中的复合物II、III和V的水平显著降低。Anitha等人(2012年)与匹配的对照组相比,自闭症患者的前扣带回、运动皮层和丘脑线粒体ETC基因表达下调。最近,DNA氧化损伤(Rose等人,2012年)和蛋白质(Sajdel-Sulkowska等人,2011年)炎症与低谷胱甘肽氧化还原状态有关(Rose等人,2012年)在自闭症大脑的小脑和颞叶皮层。
在这里,我们确认了ASD脑中呼吸链蛋白改变的发现,并确定了进一步表征ASD线粒体功能异常的新特征。为此,我们在一组较大的死后脑组织样本中测量了ASD大脑的线粒体蛋白,分析了外侧颞叶中的BA21,该部位涉及听觉处理、语言和社会感知,与ASD相关行为有关(Bigler等人,2007年;Jou等人,2010年). 除了证实ASD患者颞叶皮层的蛋白质表达和复合物I和IV酶活性降低外,我们还发现2-9岁ASD患者线粒体抗氧化酶SOD2的蛋白质水平降低,线粒体DNA氧化损伤增加。我们还发现ASD患者脑线粒体质量增加,线粒体膜蛋白Tom20、Tim23和孔蛋白的蛋白水平增加。线粒体动力学改变的证据是ASD患者线粒体裂变蛋白(Fis1和Drp1)增加,融合蛋白(Mfn1、Mfn2和Opa1)减少。我们没有发现线粒体DNA序列、线粒体DNA拷贝数或线粒体基因转录因子TFAM和辅因子PGC1α水平的任何显著变化,这表明在ASD中观察到的线粒体异常是由线粒体基因组或基因表达改变以外的机制引起的。我们的发现为ASD脑线粒体功能和细胞内氧化还原状态受损提供了进一步证据。
方法和材料
脑组织
ASD(n=20,年龄范围3-60岁)和对照组(n=25,年龄范围2-65岁)的冷冻和固定颞叶切片取自马里兰大学自闭症组织门户网站、哈佛大脑库和NICHD发育障碍大脑和组织库。所有冷冻脑标本均保存在−80°C下,并将脑切片固定在10%福尔马林中。脑样本分为三个年龄组:2-9岁、13-20岁和46-67岁。患者和对照组各年龄组的病例信息和样本量总结如下:孤独症捐赠者符合DSM-IV的诊断标准,并通过孤独症诊断访谈进行了确认。所有对照组均为年龄、PMI和性别匹配的受试者,无已知神经疾病。尸检间隔不超过32小时(ASD患者,范围为3至32小时;对照组,范围为5至30小时)。这项研究得到哥伦比亚大学医学院机构审查委员会的批准。
表1
变量 | | 儿童
| 青春期
| 成人
|
---|
对照组(n=7) | 自闭症(n=8) | 对照组(n=9) | 自闭症(n=5) | 对照组(n=9) | 自闭症(n=7) |
---|
年龄(岁) | 范围 | 2–8.3 | 2–9 | 13.2–20 | 14.2–20 | 51–60 | 46–67.3 |
| 平均值±SD | 4.6±2.1 | 6±2.3 | 17.8±1.6 | 17.0±2.5 | 55.2±3.1 | 55.3±6.7 |
尸检间隔(hs) | 范围 | 12–25 | 3–32 | 9–30 | 9–28 | 16–29 | 15–24 |
| 平均值±SD | 16.9±3.6 | 18.4±10.8 | 22.2±7.3 | 20.9±7.6 | 22.0±2.9c(c) | 23.9±4.9 |
性别 | 男性 | 4 | 6 | 9 | 5 | 9 | 7 |
| 女性 | 三 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
死亡原因 | 癌症 | 0 | 2 | 0 | 0 | 三 | 2 |
| 心脏的 | 0 | 0 | 1 | 0 | 4 | 三 |
| 事故 | 2 | 1 | 4 | 1 | 0 | 0 |
| 窒息一 | 5 | 4 | 1 | 2 | 0 | 0 |
| 癫痫 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 其他b条 | 0 | 1 | 三 | 1 | 2 | 2 |
存储长度(ms) | 范围 | 26.0–127.0 | 13.3–120 | 35.0–107.0 | 45.9–127.0 | 不适用 | 12.7–198.0 |
| 平均值±SD | 75.5±34.9 | 47.7±38.7 | 68.6±29.0 | 70.5±35.8 | 不适用 | 73.4±71.5 |
癫痫发作史(n) | | 0 | 1 | 0 | 2 | 0 | 三 |
蛋白质印迹分析
将冷冻的脑组织样本均匀化于1×RIPA缓冲液中,缓冲液中添加蛋白酶抑制剂(Roche)和磷酸酶抑制剂(Sigma)。悬浮液在13000下离心克收集上清液,并使用Bradford方法(BioRad)测定总蛋白。将样品放入贴有标签的小瓶中,并在−80°C下保存,直至使用。将每个样品的50微克总蛋白与NuPAGE样品缓冲液混合,并在4–12%NuPAGE Bis–Tris凝胶(Invitrogen)中分离,然后转移到Whatman PROTRAN硝化纤维素转移膜(0.25μm)中。为了进行免疫印迹,用含0.1%吐温20(TBS-T)的1×Tris缓冲盐水清洗膜,用5%的干牛奶在1×TBS-T中在室温(RT)下封闭1h。将膜与呼吸链蛋白复合物I NDUFS3亚基(Mitoscience,MS110)的一级抗体孵育过夜,复合物II 30KD亚基(Mitoscience,MS203)、复合物III UQCR2亚基,裂变蛋白Fis1(Proteintech,10586-1-AP)和Drp1(Santa Crutz,sc32898)、线粒体外膜蛋白孔蛋白(Abcam,ab15895)和Tom20(Proteitech,11802-1-AP)、内膜蛋白Tim23(Proteiotech,11123-AP)、基质蛋白细胞色素c(c)(Abcam,ab13575)、线粒体基因转录因子PGC1alpha(Abcam,ab54481)和TFAM(Abcam,ab119684)、肌动蛋白(Sigma,A5441)和过氧化氢酶(线粒体科学,MS721)。在一级抗体暴露后,用1×TBS-T缓冲液以10分钟的间隔清洗细胞膜三次,然后用适当的二级抗体在RT下培养1小时,然后每隔10分钟再清洗三次。使用ECL或超信号化学发光试剂(Pierce)观察蛋白质带。免疫反应带的密度用ImageJ定量,并表示为平均值±SEM。在每个凝胶上使用一个参考标准样品,对同一个印迹上的每个其他条带进行标准化,然后跨多个印迹进行比较,因为数据集中的每个条带都按照相同的标准进行了标准化。
线粒体芯片分析
如前所述,为MitoChip分析准备样品(van Eijsden等人,2006年). 简单地说,使用三套PCR引物进行长程PCR,可以扩增整个mtDNA,每个反应使用100 ng输入DNA。所有反应的循环条件为:1)95℃,2 min;2) 95°C,持续15秒;3) 68°C持续7分钟;4) 重复步骤2 29次;5) 最后延伸12分钟。作为PCR扩增和后续杂交的对照,使用CustomSeq中包含的正向和反向引物,与测试样品一起扩增7.5 kb质粒DNA(Tag IQ-EX模板)™套件(Affymetrix)。第一代和第二代线粒体芯片分析的样本池、DNA片段和标记程序相同。如Affymetrix CustomSeq中所述进行MitoChip的预杂交、杂交、洗涤和扫描™重排序协议。使用重测序分析(RA)软件(基因芯片测序分析软件4.1.0版,Affymetrix Inc.,2005)对微阵列数据进行分析。
线粒体DNA定量
使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System(Applied Biosystems)评估从尸检样本中提取的100 ng总DNA中的mtDNA含量。我们使用6FAM荧光标记的12S核糖体TaqMan线粒体分析法和引物5′-CCA CGG GAA ACA GCA GTG ATT-3′和5′-CTA TTG ACT TGG GTT AAT CGT GTG A-3′测定线粒体DNA。用PDARs RNAseP试剂盒(Applied Biosystems,应用生物系统)和VIC标记探针测量核单拷贝基因RNAse P。我们使用校准曲线量化mtDNA与nDNA拷贝数。
线粒体DNA缺失检测
为了检测线粒体DNA缺失,我们使用Takara LA Taq Kit(Fisher Scientific)进行长程PCR扩增。使用引物集(XBA 8286F 5′-CTC TAG AGC CCA CTG TAA AGC TAA CTT AGC-3′和MBO 15591-B 5′GGG ACG GAT CGG ATG TTA GGC G-3′),在热循环器(GenAmp PCR System 9700;Applied Biosystem)中通过PCR反应扩增出7.305 kb片段。PCR反应的条件为:94°C初始变性2 min,然后30个循环:94°C:15 s,68°C:8 min,68°C:13 min,4°C保持。产品在含有0.01%溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶上分离,并通过紫外线透光仪进行可视化。
线粒体复合物I和复合物IV试纸分析
根据制造商的说明(Abcam ab109876,ab109720),使用线粒体油尺测定试剂盒测定络合物I和IV的活性。允许15微克蛋白质通过量油尺膜横向吸液,将量油尺转移到适当的(复合物I或复合物IV)酶底物缓冲液中,通过测量沉淀的光密度计算酶活性,使用ImageJ®程序的比色酶反应产物。使用MetaPath Mito Disease 4 Plex油尺阵列(Abcam 109879)量化复合物I和IV的数量,并通过相应蛋白带的光密度表示。所有测量均重复进行,复合物I和IV催化活性分别归一化为总蛋白量和复合物蛋白量。
免疫组织化学
根据一般方案,对ASD患儿(n=8)和年龄匹配的对照组(n=7)进行免疫组织化学(IHC)检查。将一立方厘米的脑切片固定在10%中性缓冲福尔马林中,并嵌入石蜡块中。制备七微米厚的连续切片,脱蜡并重新水化。用Trilogy缓冲液(Cell Marque)在蒸锅中进行抗原回收40分钟。然后在4°C下将切片与抗线粒体膜蛋白孔蛋白(Abcam)、mtCOX2(Abcam)、SOD2(Abcam)、裂变蛋白Fis1(Proteintech)和Drp1(Santa Crutz)、融合蛋白Opa1(BD Bioscience)、Mfn1(Santa-Crutz)和Mfn2(Abcam1)的一级抗体孵育过夜,然后,在室温下将适当种类的二级抗体与Alexa 488(Invitrogen)结合1小时。在初级孵育期间,阴性对照切片保存在PBS中,不含初级抗体。背景仅抗兔和抗鼠二级抗体的免疫反应可忽略不计。
8-OHdG免疫染色
用蛋白酶K(20μg/ml)在37°C下处理提取抗原的脑切片45分钟。用过氧化物酶阻断剂(DAKO)阻断载玻片的内源性过氧化物酶活性,在缓冲液中冲洗5分钟,并用无血清蛋白阻断剂(DA KO)孵育1小时。用抗8-OHdG抗体(Abcam,1:5000)孵养切片37°C下放置1h,然后在RT下放置Alexa-488结合二级抗体1h。使用Olympus BX-61荧光显微镜获取图像,并使用Image J软件量化每例随机选择的30个锥体神经元的染色强度。
成像
为了对孔蛋白、COX2和SOD2阳性线粒体进行成像,我们使用了一个具有63倍物镜和缩放因子2(孔蛋白、SOD2)和3(COX2)的徕卡多光子成像系统。使用ImageJ量化单个神经元胞体中的荧光强度。对于线粒体融合和分裂蛋白以及8-OHdG染色,我们使用配备有Metamorph成像软件的Olympus BX61表观荧光显微镜。选择三个颞叶皮层第五层区域(每个区域438.6μm×330.2μm),并以20倍放大率成像。在每个区域中,根据包含核仁的切面,在赤道附近切下20个神经元,然后手动选择并绘制轮廓。获得每个神经元胞体的荧光强度,取平均值,并通过减去阴性对照切片的荧光强度来校正背景。所有图像均在相同条件下采集。
统计分析
使用GraphPad Prism软件进行统计分析。使用Kolmogorov–Smirnov检验确定数据的正态分布。ASD组和对照组之间的归一化强度值差异是通过非参数Kruskal–Wallis检验和Dunn的后验进行的,因为一些数据集不是正态分布的。相关分析采用Spearman相关检验和非线性回归。结果表示为平均值±SEM。第页<0.05被认为具有统计学意义。
结果
对照组和患者的人口统计学变量
ASD通常在2-4岁时被诊断为ASD,一部分儿童到了青春期就摆脱了严重残疾,并在经过多年的行为干预后康复(Helt等人,2008年). 根据这一发展轨迹,我们检查了不同年龄段的患者和对照组的脑样本:儿童期(2-9岁)、青春期(13-20岁)和成年后期(46-67岁),样本年龄范围主要取决于组织可用性。患者和对照组的人口统计学和临床特征详见在每个年龄组中,对照组与患者的年龄、尸检间隔(PMI)、性别和组织存储长度相匹配。除PMI不同外(PMI仅在<10岁和>45岁的对照组之间存在差异(p=0.038)没有什么不同。
ASD患者颞叶BA21线粒体呼吸链蛋白水平
Western blotting法测定BA21线粒体呼吸链蛋白水平()使用一组MitoSciences小鼠单克隆抗体(见方法和材料),这些单克隆抗体识别在复合物未组装时不稳定的亚单位。将不同蛋白质复合物条带的相对密度归一化为β-肌动蛋白水平,并绘制数据分布图我们观察到ASD患者复合物I亚单位NDUFS3的水平显著降低。当样本按年龄分层时,仅在<10岁组中检测到复合物I亚单位NDUFS3的水平显著降低。在ASD患者和任何年龄组的对照组之间,复合物II 30KD亚基水平没有显著差异。在<10岁和>45岁的患者中,复合物III UQCR2亚单位的水平显著降低。使用亚单位1(COX1)、2(COX2)和4(COX4)抗体检测复合物IV的蛋白水平:COX1水平在<10年的ASD患者中显著降低,但在10-20年和>45年的患者中没有降低,在两个年轻组中,ASD患者的COX2水平下降,而COX4蛋白水平在所有年龄组的患者和对照组之间保持不变。在年龄<10岁的ASD患者中,复合V亚单位αATP5A显著降低,但在其他组中没有降低。
BA21 ASD死后大脑线粒体呼吸链蛋白水平。(A) ASD患者和年龄匹配的对照组中呼吸链蛋白复合物I–V的典型蛋白质印迹图像。C、 控制;A、 ASD;R、 颞叶脑组织的蛋白质样本,用作比较不同凝胶中装载的样本的谱带强度的参考;(B) ASD和对照脑中不同呼吸链复合物带的相对密度散点图,归一化为肌动蛋白。与年龄、PMI匹配的对照组相比,*第页<0.05,**第页<0.01.
总之,我们观察到ASD患者大脑中复合物I、III、IV和V亚单位的蛋白质水平显著降低:这些亚单位的平均水平在ASD患者中低于<10岁年龄组的对照组,而复合物III在>45岁的患者中也降低。ASD患者的复合物II没有显著差异。这些结果表明ASD脑线粒体呼吸链复合体的表达降低,这意味着线粒体氧化磷酸化缺陷。
线粒体质量的蛋白质印迹分析
为了确定呼吸链蛋白亚基水平的降低是否是由于线粒体丢失所致,我们通过对线粒体外膜蛋白孔蛋白、Tom20、线粒体内膜蛋白Tim23和膜间线粒体蛋白细胞色素的免疫印迹来测量ASD脑内的线粒体总质量c(c)(Arthur等人,2009年;Brinckmann等人,2010年). 与我们的期望相反()10岁以下年龄组ASD脑内孔蛋白、Tom20和Tim23的蛋白水平显著高于对照组,而细胞色素的水平则高于对照组c(c)在ASD和对照样品中具有可比性。我们观察到ASD儿童的Tom20和Tim23水平显著高于对照组儿童,而在年龄>45岁的组中,对照组的Tom20>高于ASD患者。
线粒体膜蛋白Tom20、Porin、Tim23和膜间隙蛋白细胞色素水平c(c)(细胞c(c))BA21 ASD死后大脑。(A) Tom20、Tim23、porin和Cyto的Western blots代表性图像c(c)ASD患者和年龄匹配的对照组。C、 控制;A、 ASD,R,参考样品;(B) ASD患者和对照组Tom20、Tim23和孔蛋白相对强度散点图,归一化为肌动蛋白。与年龄、PMI匹配的对照组相比,*第页<0.05,**第页<0.01.
年轻自闭症患者颞叶线粒体DNA分析
当我们观察到由线粒体DNA(mtDNA)编码的复合物IV亚单位COX1和COX2的蛋白质水平下降时,我们检测了包括8名ASD儿童和7名对照儿童在内的儿童脑mtDNA的序列和数量。除了同义突变(m.7064T>C)外,线粒体序列分析(Affymetrix GeneChip®人类线粒体重测序阵列)显示,自闭症患者仅具有已知多态性(G5460A、G5178A、G9055A、G6150A、T6253C)。长范围PCR扩增排除了大规模缺失和重复的存在,即使是少量(). 实时PCR分析还排除了线粒体DNA数量的变化(). 因此,没有证据表明这些ASD患者线粒体DNA序列或拷贝数发生异常变化,尽管DNA表现出较高水平的氧化损伤(见下文)。
年轻自闭症患者BA21颞叶线粒体DNA分析。(A) 琼脂糖凝胶电泳显示ASD患者没有缺失。M、 HindIII消化的Lambda DNA标记,线粒体DNA缺失的C(+)阳性对照,C(−)正常对照;1至8名ASD患者。(B) 线粒体DNA拷贝数,表示为线粒体DNA相对于核DNA的数量。
ASD患者颞叶PGC1α或TFAM蛋白水平
线粒体生物发生的变化可能是ASD中ETC水平降低或线粒体含量增加的基础。调节线粒体生物发生和激活线粒体基因表达的蛋白质包括PGC1α和TFAM(Kim等人,2010年). 在包括HD和PD在内的神经退行性疾病中,这两种蛋白的水平都降低,这与发病机制有关(Taherzadeh-Fard等人,2011年;Tsunemi和La Spada,2012年). 相反,我们发现ASD和对照样品之间的PGC1α或TFAM水平没有显著差异()这表明另一种机制导致ASD颞叶皮质线粒体异常。然而,在对照组和ASD组中,年轻组和青少年组之间的PGC1α似乎与年龄有关。
BA21 ASD死后脑线粒体基因转录因子TFAM和辅因子PGC1α水平。(A) ASD患者和年龄匹配的对照组TFAM和PGC1α蛋白印迹的代表性图像。C控制;A、 ASD,R,参考样品;(B) PGC1α和TFAM带的相对密度散点图,归一化为肌动蛋白。在任何年龄组ASD和对照组之间,PGC1α和TFAM水平均无显著差异。
年轻ASD颞叶线粒体复合体I/IV活性
当归一化为总蛋白量时,试纸法显示ASD患者大脑中复合物I和复合物IV活性降低(). 通过量化复合物I和IV的数量,我们发现ASD大脑中复合物I与IV的数量显著减少()与Western blot测定的结果一致(). 然而,虽然按照复合物I和IV的数量进行了标准化,但在ASD和对照组之间,每个复合物I与IV蛋白复合物单位的复合物I及IV酶活性没有检测到差异(). 这些结果表明,复合物I和复合物IV活性的降低与这两种复合物数量的减少有关。
年轻ASD患者BA21颞叶线粒体复合物I和IV酶活性。(A) 复合物I和IV酶活性的离散分析的代表性图像,复合物I与IV多亚单位复合物的数量。请注意,当使用试剂盒中包含的洗涤剂提取样品时,剥离到试纸硝酸纤维素膜上的抗体能够捕获天然形式的多亚基复合物。(B) ASD颞叶线粒体复合物I和IV酶活性降低。将酶活性归一化为总蛋白量,并表示为每μg总蛋白的复合物I和IV酶活性。与年龄、PMI匹配的对照组相比,**第页<0.01; (C) ASD颞叶线粒体复合物I和IV数量减少。络合物的数量由络合物I和络合物IV带的光密度表示。与年龄、PMI匹配的对照组相比,**第页<0.01; (D) 复合物I和IV酶活性标准化为复合物的数量。ASD和对照组之间每个复合物I或IV单元的酶活性没有检测到差异。
抗氧化酶过氧化氢酶和线粒体SOD2的分析
线粒体是活性氧产生的主要来源,也是活性氧损伤的主要靶点。在线粒体中,超氧化物通过线粒体基质酶锰超氧化物歧化酶(MnSOD,SOD2)转化为活性较低的代谢物过氧化氢(Weydert和Cullen,2010年). 过氧化氢水平依次由谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物酶体过氧化氢酶活性调节。剩余的过氧化氢可以与铁反应,生成高度活性的羟基自由基。我们分析了过氧化氢酶和线粒体超氧化物歧化酶SOD2这两种抗氧化酶的蛋白质水平(). 尽管ASD患者颞叶过氧化氢酶在任何年龄段均无变化,但ASD儿童的SOD2显著降低,但青少年和成人ASD患者之间SOD2蛋白水平无显著差异。
BA21 ASD死后大脑中抗氧化酶SOD2和过氧化氢酶的水平。(A) ASD病例和年龄匹配的对照组SOD2和过氧化氢酶蛋白印迹的代表性图像。C、 控制;A、 ASD,R,参考样品;(B) SOD2和过氧化氢酶条带相对密度的散点图,标准化为肌动蛋白。与年龄、PMI匹配的对照组相比,**第页<0.01.
8-OHG羟基鸟苷免疫标记
儿童ASD颞叶皮层SOD2蛋白水平较低,提示DNA可能存在氧化损伤。氧化修饰核苷8-羟基-2′-脱氧鸟苷(8-OHdG)被广泛用作DNA氧化损伤的生物标志物(de Souza-Pinto等人,2008年). 我们测定了自闭症儿童和对照组受试者颞叶皮层的8-OHdG水平。我们在对照组锥体神经元的核仁和细胞质中观察到低水平的8-OHdG标记,这可能反映了死后固定导致的基础DNA氧化。相反,ASD患者的锥体神经元有强烈的细胞质染色()这表明这些初级投射神经元对DNA氧化损伤特别敏感。仅在二级抗体中孵育的阴性对照未标记(未显示)。8-OHdG信号与PMI或组织处理中的其他因素或死亡原因无关(和见下文)。因此,数据显示年轻ASD患者颞叶皮层锥体神经元的线粒体DNA氧化损伤。
BA21 ASD死后大脑8-OHdG水平。(A) 颞叶V层锥体神经元8-OHdG免疫组化的代表性图像。金字塔神经元由一个特征性的三角形形态识别,其突出的顶端树突指向软脑膜表面。提供了来自3名对照组(C1,2岁;C2,4岁;C3,5岁)和3名ASD患者(A1,3岁;A2:3岁;A3,7岁)的样本。在CP和AP中显示了C2和A1装箱区的金字塔神经元。比例尺,20μm。(B) 每个锥体神经元胞质8-OHdG荧光强度的量化。对照组,n=7;ASD,n=8。**与对照组相比,第页<0.01. (C) 8-OHdG荧光强度与混杂因素(r,Spearman相关系数;第页,重要性第页价值;R(右)2,决定系数)。
锥体神经元受损线粒体的增加
我们发现ASD儿童颞叶皮质线粒体ETC蛋白减少、氧化应激增加以及线粒体质量增加,这表明ASD大脑受损线粒体可能增加。为了解决这个问题,我们对COX2和SOD2进行免疫标记,以显示功能性线粒体和孔蛋白(Arthur等人,2009年;Keeney等人,2006年)评估ASD和对照儿童固定脑切片中的线粒体质量。与Western blot结果一致,我们观察到ASD颞叶皮层锥体神经元的COX2和SOD2荧光显著降低,而孔蛋白免疫荧光显著升高(). 我们将呼吸链复合物和SOD2的蛋白质水平归一化为Tom20水平指示的线粒体总蛋白质含量(). 复合物I的每个线粒体蛋白质单位的蛋白质水平降低了40%,复合物II降低了22%,复合物III降低了45%,复合物IV降低了30%,复合物V降低了45%,SOD2降低了43%,这与ASD锥体神经元线粒体中功能蛋白的降低一致。当将这些功能蛋白的水平标准化为孔蛋白时,我们观察到类似的结果(未显示)。总之,这些数据表明受损的线粒体积聚在年轻ASD患者颞叶皮层的锥体神经元中。
BA21 ASD死后大脑中受损线粒体的增加。对V层锥体神经元(每例10-20个神经元)进行孔蛋白、SOD2和COX2免疫标记。比例尺,10μm。(A) 颞叶V层锥体神经元孔蛋白、SOD2、COX2免疫组化的代表性图像。(B) ASD患者和对照组颞叶V层锥体神经元孔蛋白、SOD2和COX2免疫荧光强度的定量。与对照组相比,ASD患者的SOD2、COX2强度降低,但孔蛋白荧光增强。对照组,n=7;ASD,n=8。与对照组相比,*第页<0.05,**第页<0.01. (C) 线粒体呼吸链蛋白和SOD2的蛋白水平,归一化为线粒体外膜蛋白Tom20的水平。对照组,n=7;ASD,n=8。与对照组相比,*第页<0.05,**第页<0.01.
ASD颞叶皮质线粒体分裂融合蛋白的分析
线粒体动力学受裂变蛋白Drp1、Fis1和融合蛋白Mfn1、Mfn2和Opa1调节(Detmer和Chan,2007年)与线粒体形态和大小、分布、功能和周转有关。线粒体动力学受损与包括PD、HD和AD在内的神经退行性疾病密切相关(陈和陈,2009年). 我们的研究结果显示,ASD和对照组之间Drp1、Fis1、Mfn1/2和Opa1的水平存在显著差异():10年以内的ASD患者的Drp1水平增加了14%,45岁以上的患者增加了18%。年龄小于10岁的ASD患者的Fis1水平显著增加了15%。相比之下,10岁以下ASD患者Mfn1、Mfn2和Opa1的融合蛋白水平分别降低了25%、14%和14%。与免疫印迹分析显示的变化一致,在10岁以下的ASD患者中,Mfn1和Opa1在锥体神经元中的免疫反应较低,而Drp1和Fis1的免疫标记较高。总之,ASD儿童的线粒体裂变蛋白升高,融合蛋白降低().
BA21 ASD死后脑组织线粒体分裂和融合蛋白的表达。代表性免疫印迹(A)和定量(B)显示,ASD颞叶中裂变蛋白Drp1和Fis1的水平显著升高,而年轻ASD患者中融合蛋白Mfn1、Mfn2和Opa1的水平显著降低。与年龄匹配的对照组相比,*第页<0.05,**第页<0.01. Mfn1/2、Opa1、Drp1和Fis1的蛋白质水平差异最大的是10岁以下的病例,86–100%的患者表现出比对照组更低/更高的水平。(C) 儿童ASD患者和对照组颞叶V层锥体神经元Mfn1/2、Opa1、Drp1和Fis1免疫组化的代表性图像。与对照组相比,ASD神经元Mfn1/2、Opa1强度降低,Fis1和Drp1荧光增强。对照组,n=7;ASD,n=8。比例尺,50μm。
线粒体蛋白水平与混杂因素的相关性分析
尸检脑组织中蛋白质表达的比较因许多混杂因素而变得复杂,包括年龄、性别、尸检间隔、死亡原因和其他变量。因此,我们对这些因素与线粒体蛋白水平进行了相关性分析。如所示线粒体呼吸链蛋白水平与癫痫发作史、性别或死因无显著相关性。贮藏时间对复合物I蛋白水平有轻微影响(决定系数R2=0.029)和图1(R2=0.0003). 癫痫发作史与融合蛋白Mfn2(R2=0.032)和Opa1(R2=0.067); 即使在排除有癫痫发作史的单一病例后,儿童ASD脑内Mfn2和Opa1水平仍显著降低。对于青少年和成人组,Mfn1、Mfn2和Opa1的显著降低可能与癫痫史有关,因为更多的患者表现出癫痫症状,尽管需要注意的是,癫痫在ASD患者中非常常见(图赫曼和拉宾,2002年). 复合物IV COX1亚基蛋白水平随PMI升高而升高,而复合物V、Mfn2和Opa1水平与PMI呈负相关(R2分别为0.111、0.089、0.017)。随着年龄的增长,大多数线粒体蛋白质的水平略有下降(R2:复合物IV COX4,0.146;络合物V,0.111;细胞色素c(c), 0.101; PGC1α,0.072;TFAM,0.019;Mfn1,0.026;Mfn2,0.089;Opa1,0.061),而SOD2(R2:0.027)和过氧化氢酶(R2:0.062)随着年龄的增长而增加。总之,线粒体蛋白质随着年龄的增长而发生变化,这对所有个体来说都是常见的。然而,我们在ASD患者和对照组之间发现的线粒体蛋白的变化并不是任何年龄组PMI、死亡原因、性别或储存时间差异的结果。
表2
| | 储存时间 | 癫痫发作史 | 死亡年龄 | 采购经理人指数 | 性别 | 死亡原因 |
---|
综合体I | 第页(第页) | −0.350 (0.044) | 0.015 (0.922) | −0.082 (0.594) | 0.120 (0.435) | −0.229 (0.411) | −0.200 (0.193) |
综合体II | 第页(第页) | −0.002 (0.993) | 0.150 (0.322) | −0.110 (0.480) | −0.160 (0.305) | −0.131 (0.641) | 0.220 (0.153) |
综合体III | 第页(第页) | −0.023 (0.899) | 0.076 (0.622) | −0.006 (0.967) | 0.098 (0.527) | −0.197 (0.483) | 0.023 (0.883) |
复合物IV(COX1) | 第页(第页) | −0.240 (0.163) | 0.038 (0.806) | 0.170 (0.256) | 0.430 (0.003) | −0.164 (0.560) | −0.120 (0.430) |
综合体IV(COX2) | 第页(第页) | −0.170 (0.349) | 0.096 (0.532) | −0.077 (0.615) | −0.140 (0.352) | −0.098 (0.727) | −0.038 (0.803) |
综合体IV(COX4) | 第页(第页) | −0.110 (0.549) | 0.280 (0.061) | −0.390 (0.007) | −0.270 (0.071) | 0.229 (0.411) | 0.180 (0.242) |
复合体V | 第页(第页) | −0.006 (0.975) | 0.150 (0.330) | −0.470 (0.001) | −0.370 (0.014) | −0.066 (0.817) | 0.110 (0.473) |
20岁以下 | 第页(第页) | 0.079 (0.656) | 0.058 (0.705) | −0.077 (0.615) | 0.069 (0.658) | 0.131 (0.641) | 0.110 (0.491) |
时间23 | 第页(第页) | 0.065 (0.714) | −0.190 (0.220) | 0.260 (0.086) | 0.190 (0.216) | 0.247 (0.375) | 0.093 (0.542) |
波林 | 第页(第页) | −0.130 (0.474) | 0.073 (0.634) | −0.250 (0.099) | 0.210 (0.180) | 0.148 (0.599) | −0.150 (0.331) |
细胞c(c) | 第页(第页) | 0.150 (0.397) | 0.120 (0.449) | −0.490 (0.001) | −0.180 (0.255) | 0.196 (0.483) | −0.034 (0.824) |
SOD2标准 | 第页(第页) | −0.140 (0.417) | 0.038 (0.806) | 0.420 (0.004) | 0.120 (0.435) | −0.147 (0.600) | −0.029 (0.848) |
过氧化氢酶 | 第页(第页) | −0.076 (0.668) | −0.190 (0.208) | 0.450 (0.002) | 0.130 (0.394) | −0.229 (0.411) | 0.097 (0.528) |
PGC1α | 第页(第页) | −0.150 (0.396) | 0.073 (0.634) | −0.610 (0.001) | −0.180 (0.236) | −0.263 (0.344) | −0.210 (0.169) |
TFAM公司 | 第页(第页) | −0.260 (0.130) | 0.078 (0.610) | −0.370 (0.013) | 0.180 (0.242) | 0.410 (0.129) | −0.254 (0.09) |
图纸1 | 第页(第页) | 0.062 (0.728) | −0.150 (0.322) | 0.074 (0.631) | 0.260 (0.084) | 0.000 (1.000) | 0.061 (0.689) |
图1 | 第页(第页) | 0.047 (0.000) | 0.130 (0.410) | −0.007 (0.962) | 0.100 (0.501) | 0.246 (0.377) | −0.075 (0.623) |
Mfn1公司 | 第页(第页) | −0.210 (0.237) | 0.270 (0.071) | −0.350 (0.020) | −0.079 (0.611) | −0.164 (0.560) | 0.190 (0.212) |
Mfn2公司 | 对(第页) | −0.120 (0.503) | 0.350 (0.017) | −0.630 (0.000) | −0.400 (0.008) | −0.181 (0.520) | 0.067 (0.663) |
Opa1公司 | 第页(第页) | −0.110 (0.529) | 0.420 (0.004) | −0.440 (0.002) | −0.410 (0.006) | 0.033 (0.908) | 0.160 (0.282) |
讨论
本研究通过显示影响线粒体氧合酶、复合物I和IV酶活性、抗氧化防御、动力学和含量的蛋白质变化,证明了ASD儿童颞叶皮质内的线粒体缺陷。也许最重要的是,数据表明,ASD患者和对照组之间的许多差异主要发生在儿童时期,当ASD症状最初表现时,其中一些特征存在于皮层锥体神经元,即皮层的主要神经元。我们检测了BA21皮层,该皮层广泛参与ASD,因为它参与包括语言在内的社会交际过程中的大脑网络(Gillberg和Coleman,2000年)社会和言语感知(Redcay,2008年)、意图和理解(Allison等人,2000年),所有这些都在ASD中受损(美国精神病学协会,1994年). ASD颞叶皮层的异常已被功能成像和病理研究证实,包括基因转录谱紊乱(Garbett等人,2008年;Voineagu等人,2011年)兴奋性锥体神经元树突棘密度增加(Hutsler和Zhang,2010年)和功能特异性降低(Shih等人,2011年). 我们对线粒体呼吸链蛋白水平和酶活性、线粒体抗氧化酶SOD2、线粒体分裂和融合蛋白、,ASD儿童颞叶皮层锥体神经元的局部氧化应激表明该皮层区域的线粒体功能障碍,可能代表ASD行为缺陷的病理相关性。
ASD脑颞叶线粒体缺陷与氧化应激
在较小队列患者和对照组的死后脑组织中,Chauhan等人(2011年)发现ASD患者呼吸链蛋白表达显著降低,ASD儿童颞叶皮层复合物II、III和IV水平较低。我们还发现,除复合物II外,年龄<10岁的ASD儿童的每个呼吸链蛋白水平均降低,并且,在年龄介于10–20岁之间的ASD患者中,复合物IV COX2亚基水平降低,而年龄>45岁的患者的复合物III水平显著降低。ASD儿童的呼吸链损伤最为严重,因为<10岁的患者复合物I、III、IV和V蛋白水平较低,复合物I和IV酶活性降低。年轻时严重的呼吸链异常可能导致线粒体功能障碍和能量代谢异常,并有助于ASD症状的出现:然而,<30%的成年患者也表现出线粒体ETC复合物水平下降,因此,一些患者一生中可能会发生线粒体异常。
ETC蛋白由线粒体DNA基因和核DNA基因编码(迪莫罗和肖恩,2008年)因此,自闭症儿童大脑中生化变化的模式可能是由于线粒体DNA突变或线粒体DNA丰度降低(线粒体DNA缺失)(Pons等人,2004年). 然而,我们对8名自闭症谱系障碍儿童大脑中mtDNA的详细分子分析排除了这些患者的mtDNA直接参与。ETC异常可能继发于环境应激源,包括异常钙++信号传导、免疫功能改变、有毒化合物或氧化应激(James等人,2009年).
呼吸链复合物缺陷危害ATP合成并加速自由基的生成,包括超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基,这些自由基会对蛋白质和DNA造成氧化损伤(Henchcliffe和Beal,2008年). 一致地,我们观察到年轻ASD患者颞皮质锥体神经元中氧化修饰的mtDNA的广泛染色。这些结果支持以下结论Chauhan等人(2011年)他发现,脂肪酸氧化产物脂质过氧化氢(LOOH)在4–10岁患者的小脑和颞叶皮层显著升高,而在14–39岁患者中没有显著升高。
ASD组织中的一些变化,例如过氧化作用增加(罗西诺和弗莱,2012a)和膜异常(Chauhan和Chuhan,2006年)与活性氧(ROS)的影响一致。抗氧化酶协同保护细胞免受活性氧损伤(安达信,2004). 我们发现,10岁以下ASD患者颞叶线粒体抗氧化酶SOD2水平显著降低,表明氧化应激可能是ASD儿童特有的。我们的结果与Meguid等人的结果一致,他们发现ASD患者血浆中SOD蛋白水平较低(Meguid等人,2011年)和Yorbik等人报告说,ASD血液中的SOD活性低于对照组(Yorbik等人,2002年). 然而,我们在任何年龄段的ASD患者中均未观察到过氧化氢酶蛋白水平的任何变化,这表明氧化应激可能源于线粒体而非过氧化物酶体功能障碍。抵抗活性氧的能力减弱使线粒体更容易受到氧化损伤,从而导致活性氧生成增加的恶性循环(James等人,2009年).
随着时间的推移,累积性呼吸链缺陷和氧化性DNA损伤可能会损害线粒体功能,并可能影响ASD的发病或严重程度以及并存症状。尽管存在慢性线粒体呼吸链缺陷和氧化应激,患者可能会形成代偿机制来维持充足的能量生产(Celotto等人,2011年),通过增加糖酵解通量、生酮和克雷伯循环活性,增加线粒体DNA拷贝数以维持线粒体转录物的正常水平(Cannon等人,2011年)或通过与年龄相关的DNA修复增加(Humphreys等人,2007年). 据报道,ASD患者线粒体最大呼吸频率较高,这可能是对复合I功能抑郁的代偿反应(Benzecry等人,2009年;霍尔兹曼,2008). 这种代偿机制可以解释为什么老年ASD患者线粒体功能障碍不那么严重。
致谢
基金
这项研究得到西蒙斯基金会的支持。苏尔寿实验室的额外支持来自帕金森病和JPB基金会。DiMauro实验室由NICHD拨款HD32062和万豪线粒体疾病临床研究基金(MMDCRF)资助。
我们感谢Daniel Geshwind博士对手稿的批判性审查。我们还感谢自闭症组织门户网站、哈佛大脑银行和马里兰州NICHD大脑与组织银行为本研究慷慨提供脑组织。
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