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酒精临床实验研究。作者手稿；PMC 2013年8月26日提供。
以最终编辑形式发布为：
酒精临床实验研究，2009年10月；33(10): 1704–1710.
2009年7月1日在线发布。 数字对象标识：10.1111/j.1530-0277.2009.01007.x
预防性维修识别码：项目经理3753180
尼姆斯：NIHMS497557
PMID：19572984

Lieber-DeCarli饮食诱导的小鼠酒精性和蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎模型中MicroRNA表达谱

安吉拉·多尔加尼乌克,扬·彼得拉塞克,凯伦·柯迪斯,唐娜·卡塔拉诺,Pranti Mandrekar公司,阿鲁穆加姆·维拉尤德姆、和Gyongyi Szabo公司
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

背景

酒精性和非酒精性脂肪性肝炎是全球肝病的主要病因。虽然病因不同，但它们具有共同的病理生理机制，并以脂肪代谢异常、炎症和纤维化为特征。Micro-RNA（miRNA）是高度保守的非编码RNA，通过降解靶mRNA或抑制翻译，在转录后水平控制基因表达。每个miRNA控制多个靶点的表达；miRNAs与脂质代谢和炎症的调节有关。

方法

我们给C57Bl6喂食Lieber-DeCarli酒精或蛋氨酸缺乏（MCD）饮食，并通过ELISA分析肝脏组织病理学、细胞因子、生化分析ALT和微阵列分析microRNA谱。

结果

Lieber-DeCarli和MCD饮食都会导致肝脂肪变性、肝损伤（以ALT升高为标志）和血清TNFα水平升高，这表明动物模型分别描述了酒精性和非酒精性脂肪肝的病理生理特征。我们发现Lieber-deCarli饮食上调了已知miRNA的1%，下调了1%；与对照组相比，MCD饮食上调了已知miRNA的3%，下调了1%。在改变表达水平的miRNA中，五种miRNA在酒精性和非酒精性脂肪肝中常见：在Lieber-DeCarli或MCD饮食喂养后，miR-705和miR-1224的表达增加。相比之下，与相应的对照组相比，在Lieber-deCarli喂养中，miR-182、miR-183和miR-199a-3p被下调，而MCD饮食导致其上调。

结论

我们的研究结果表明脂肪性肝炎模型期间miRNA表达谱的病因学特异性变化，这为酒精性和非酒精性脂肪肝疾病的病理生理学研究开辟了新的途径。

关键词：肝脏、酒精、NASH、体内

简介

脂肪性肝炎（SH）是一种全球性的新兴肝病，通常先于肝纤维化、肝衰竭和肝细胞癌(Bugianesi等人，2002年;Day C.P.，2005年;Morgan TR等人，2004年). 虽然脂肪性肝炎可能是由慢性酒精滥用（酒精性脂肪肝和脂肪性肝炎）引起的，或伴随无酒精滥用史的代谢综合征（非酒精性脂肪肝和脂肪性肝），但这些实体具有共同的组织病理学特征，并具有共同的肝损伤机制成分(Tsukamoto H等人，2008年). 酒精性和非酒精性肝病都以脂肪变性、炎症和肝纤维化进展为特征（Morita等人，2003；布伦特2001). 据报道，这两种脂肪性肝病的蛋白质在转录、翻译和功能水平上存在特殊性，但蛋白质调节的明确差异可能会将酒精和非酒精病因排除在外，尚待确定。

1993年首次突破性地发现了microRNA（miRNA），随后进行了大量研究，在哺乳动物细胞中发现了1000多个不同的miRNA，并表明miRNA在蛋白质翻译点负调控蛋白质表达；因此，它们是细胞过程的基本调节器(安布罗斯五世，2004年). 更重要的是，miRNA谱正在成为许多正常稳态过程的重要贡献者，包括代谢途径(Wilfred BR等人，2007年;Esau C等人，2006年)，细胞应激(S.N.Bhattacharyya等人，2006年)、免疫防御、炎症(Chong-MM等人，2008,Tili E等人，2007年,Liston A等人，2008年)和组织重塑(Davis BN等人，2008年). 更重要的是，miRNA在人类疾病中发挥着关键作用，包括自身免疫、病理性炎症(Schickel R等人，2008年;Mattes J等人，2008年)和肿瘤控制(Wong QW等人，2008年;Varnholt H等人，2008年;Tryndyak副总裁等，2008年;Connolly E等人，2008年). 最近，Pietrzykowski等人发现miR-9对BK通道剪接变异体稳定性的转录后调节是酒精神经适应的基础(Pietrzykowski AZ等人，2008年)Tang等人确定了酒精对肠上皮细胞中miR-212表达的影响(唐毅等，2008); 这些报告表明，miRNA可能在酒精诱导的病理学中发挥作用。microRNA的表达模式及其在肝脏疾病中的作用尚不清楚。

基于脂肪性肝炎的发病机制，我们分析了酒精性和非酒精性脂肪肝可能具有特征性miRNA谱的假设。我们的数据表明，喂食Lieber-deCarli酒精饮食或蛋氨酸-胆碱缺乏（MCD）饮食的动物在miRNA谱上有共同的改变，但它们也有不同的microRNA特征。

材料和方法

动物和实验方案

三个月大的雌性C57BL/6小鼠被安置在一个特定的无病、气候控制的动物设施中，进行12小时的光暗循环，并按照马萨诸塞大学医学院IACUC的规定进行护理。在整个实验期间，所有动物都可以不受限制地接触水。所有小鼠的起始体重为22.6±2.3g。

诱导酒精性肝病，小鼠接受Lieber-DeCarli饮食（Bio-Serv，Frenchtown，NJ）和4.5%（体积/体积）乙醇（32.4%乙醇衍生热量），为期5周；用右旋糖酐-麦芽糖替代酒精衍生的热量，给配对喂养的对照小鼠喂食与酒精喂养的对照鼠等量的热量。在喂食5周的过程中，酒精喂养组（+15±3.38g）和双喂组（+15.6±3.54g）的小鼠体重增加相当。

诱导非酒精性脂肪性肝炎，用甲硫氨酸胆碱缺乏（MCD）饮食或甲硫氨酸胆碱补充（MCS）饮食喂养小鼠5周；后一种对照饮食的成分与MCD饮食相同，但补充了L-蛋氨酸（1.7 g/kg）和酒石酸胆碱（14.48 g/kg）（宾夕法尼亚州伯利恒Dyets公司）。蛋氨酸和胆碱缺乏通过破坏磷脂酰胆碱的转移来阻止肝脏脂质分泌，从而产生脂肪肝(Vance等人，1985年;Yao等人，1988年). 在喂食MCD饮食期间，与喂食MCS饮食（+7.2±2.1g）的对照组相比，喂食MCC饮食的小鼠体重减轻了（−6.7±0.7g）。

生化分析

血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）采用动力学方法测定（ALT液体，Advanced Diagnostics Inc.，新泽西州南普莱恩菲尔德）。如前所述，使用商用试剂盒（甘油三酯TG H R2 994-40491、甘油三酸酯TG H R1 994-40391和脂质校准品996-41791，Wako Chemicals USA Inc.，弗吉尼亚州里士满）测量肝脏甘油三脂水平。

组织病理学分析

福尔马林固定石蜡包埋肝脏切片用苏木精和伊红染色，以评估脂肪性肝炎的组织学特征。组织病理学分析以盲法进行。

细胞因子测量

使用Pierce探照灯多重细胞因子阵列（Pierce Biotechnology，Inc.，Woburn，MA）测定血清TNFα水平。

微小核糖核酸分析

使用有机和固相萃取法从snap冷冻肝脏中分离出总RNA米尔Vana miRNA分离试剂盒，用于保存miRNA（Applied Biosystems/Ambion，Austin，TX，目录号1560），并通过分光光度法进行定量（BioPhotometer，Eppendorf，Westbury，NY）。使用miRNA微阵列服务，在LC Sciences LLC（德克萨斯州休斯顿）对肝脏总RNA（5μg）样本进行miRNA谱分析。所选区域的miRNA探针布局如所示补充表1。阵列中的所有探针序列（MRA#1002）均基于Sanger miRBase Release 8.1，它代表更新的验证小鼠miRNA序列。样本随机配对，用Cy3染料（绿色）或Cy5染料（红色）标记RNA；在相同的实验中，旋转颜色以提供无颜色偏差的分析。将标记的RNA与含探针芯片杂交，该芯片检测到Sanger miRBase Release 10.1中列出的miRNA转录物。Cy3和Cy5提供了个体样本中不同miRNAs表达水平的信息，该比率反映了相应样本之间miRNAs的差异表达。Lieber-deCarli和MCD饮食喂养组的代表性Cy3、Cy5和Cy3/Cy5比率图如所示补充图1.根据5%和25%低强度井的中位数计算背景；空白井被排除在背景计算之外。计算中排除了识别系统染料偏差的探针。经过背景减除、归一化和检测评估后，给出了信号。

统计分析

每个实验组有3-6只小鼠。使用Student t检验进行microRNA微阵列分析，使用非参数Kruskal-Wallis检验和Mann-Whitney检验确定所有其他参数的统计显著性；数据在p<0.05时具有统计学意义。

结果和讨论

酒精性和非酒精性脂肪肝的实验模型具有肝脂肪变性、脂代谢受损、促炎激活和肝损伤的特征

酒精性和非酒精性脂肪性肝炎具有多种特征，如脂肪变性、炎症，有时还伴有纤维化，从而导致肝脏损伤和进展为肝衰竭(Day等人，2005年;Tsukamoto等人，2008年). 本研究的目的是通过使用Lieber-DeCarli（酒精性）和MCD（非酒精性）饮食诱导脂肪肝模型，确定酒精性和非酒精性脂肪肝在miRNA表达水平上是否具有相同的相似性。

喂食含酒精的Lieber deCarli饮食(Lieber等人，1965年)C57Bl6小鼠导致肝脂肪变性(图1A)肝甘油三酯升高(图1B)与配对喂养的动物相比。血清ALT水平升高表明，富含酒精的饮食会导致肝脏损伤(图1C)并产生促炎状态，表现为血清TNFα水平升高(图1D)与不含酒精的同类产品相比。这些特征与人类酒精性肝病的特征非常相似(McCullough等人，1998年); 因此，我们得出结论，Lieber-deCarli饮食诱导小鼠出现酒精性肝病特征。接下来，我们比较了利伯·德卡利酒精饮食喂养动物的血液酒精水平（BAL）。如所示图1E，在富含右旋糖酐-麦芽糖的Lieber-deCarli对饲动物的血液中未检测到酒精。相反，喂食含酒精Lieber-deCarli饮食的动物血液中检测到酒精。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms497557f1.jpg

Lieber-deCarli和蛋氨酸-胆碱缺乏（MCD）饮食喂养的特点是肝脏脂肪变性、脂肪代谢受损、肝脏损伤和促炎激活。用Lieber-deCarli或甲硫氨酸-胆碱缺乏饲料喂养C57Bl6小鼠，分别建立ASH和NASH模型。肝切片用H&E染色并进行形态学分析（A）；分析血清甘油三酯（B）、丙氨酸氨基转移酶（C）、TNFα（D）和酒精（E）水平。在面板A中，显示了n=6/组中的代表图像。在面板B-E中，数据显示为6只小鼠/组的平均值±SD；*表示与双喂养对照组相比p<0.05；#表示与MCS对照组相比p<0.05。

对于非酒精性状态性肝炎模型，我们给C57Bl6小鼠喂食缺乏蛋氨酸-胆碱的食物；这种饮食习惯在肝病研究中得到了很好的应用，以产生脂肪肝(山口等，2007年,2008; Rahman等人，2008年）。喂食MCD导致肝脏脂肪变性(图1A)肝甘油三酯升高(图1B)与补充蛋氨酸-胆碱（MCS）的饮食动物相比。此外，MCD饮食导致血清ALT水平升高(图1C)和TNFα(图1D)分别表示肝损伤和炎症。这些数据表明，含酒精的Lieber deCarli和MCD饮食都会导致脂肪性肝炎。

酒精性和非酒精性脂肪肝显示不同的microRNA表达谱

接下来，我们量化了喂食Lieber-deCarli酒精饮食或MCD饮食的动物及其各自对照组的肝脏中已知和预测的microRNA的表达。如所示图2microRNA探针的聚类显示，在对照健康动物的肝脏中表达了多个microRNA。在喂食Lieber-DeCarli饮食的动物中，大多数肝脏microRNA的表达水平相似(图2A)或蛋氨酸-胆碱缺乏饮食(图2E)与相应的饮食控制相比(补充图1). 我们发现，与配对喂养的对照组相比，在Lieber-deCarli喂养后，2%的已知microRNA的表达水平发生了变化(图2B). 同样，与MCS饮食控制组相比，喂食MCD饮食的动物中有4%的microRNA被调节(图2F). 在因脂肪性肝炎而改变表达水平的基因中，在Lieber deCarli酒精饮食喂养期间，1%的已知miRNA上调，1%下调(图2B)而喂食MCD导致已知microRNA上调3%，下调1%(图2F).图2C、D显示了ASH模型中microRNA的表达模式，该模式受到显著调节（p<0.05(图2C)或p<0.01(图2D)); MCD饮食模型中的类似信息如所示图2G，H我们进一步观察到，根据脂肪性肝炎的病因，三种microRNA的表达存在差异：喂食含酒精饮食导致miR-182、miR-183和miR-199a-3p的下调，而喂食MCD饮食导致这三种microrRNA的上调（表3）。相反，酒精性和非酒精性脂肪性肝炎中miR-705和miR-1224的表达增加（表3）。这些数据表明，酒精性和非酒精性脂肪性肝炎可调节肝脏中microRNA的表达。此外，在酒精性和非酒精性脂肪肝模型中发现了microRNA表达的相似性和不同特征。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms497557f2.jpg

脂肪性肝炎调节肝脏microRNA的表达。

使用miRNA微阵列分析肝脏microRNA表达。A组和D组显示了与相应对照组相比，喂食Lieber-deCarli（A）和MCD（D）日粮期间改变的microRNA百分比。面板B和E显示了Lieber-deCarli饮食中分别在p<0.05和p<0.01时microRNA表达的热图。C组和F组显示MCD饮食喂养中microRNA的表达分别为p<0.05和p<0.01。在面板B、C、E和F（图中n=3）中，黑色表示无变化，红色表示上调，绿色表示下调基因表达；颜色的强度与变化的程度有关。

脂肪性肝炎，无论是酒精性还是非酒精性病因，都是一个重大的临床挑战；对脂肪性肝炎发病机制的基本原理和细节的确定是紧急的，可能会影响疾病管理。到目前为止，对脂肪性肝炎发展过程中的事件顺序还没有明确的认识，基于病因的诊断、管理和疾病预测方法正在兴起。在这里，我们使用ASH和NASH动物模型研究了脂肪性肝炎的microRNA谱，发现了这些疾病的共同特征和独特的microRNA-signatures。

我们发现SH的变化与有限数量的已知微小RNA的变化有关。根据我们的结果，我们预测miR-182、miR-183、miR-199a-3p、miR-705和miR-1224表达水平的综合变化提供了SH的特征。更重要的是，我们确定了每个microRNA谱在SH发病机制方面的特异性。我们发现，酒精（Lieber-deCarli饮食）诱导的脂肪性肝炎导致几种microRNA的下调，包括miR-27b、miR-214、miR-199a-3p、miR-182、miR-183、miR200a和miR-322。人们认为，microRNA可以控制多个，有时甚至数千个靶mRNA的表达(安布罗斯2004). 哺乳动物的microRNAs通常通过抑制翻译来负向调节基因表达，可能通过影响mRNA的稳定性和/或翻译过程本身(Wong等人，2008年;Varnholt等人，2008年;Tryndyak等人，2008年). 由于microRNA抑制蛋白质表达，我们预测一些microRNA的表达受损会导致靶蛋白过度表达。例如，组蛋白去乙酰化酶抑制迅速改变miR-27水平(Scott等人，2006年)ASH中miR-27表达受损可能是由于表观遗传学事件在酒精作用中的作用(Choudhury M等人，2008年;Shukla等人，2008年). miR-214是肝脏衰老的标志(Maes等人，2008年). TGFβ抑制miR-200a表达(Gregory等人，2008年)与此相关的是，ASH中TGFβ信号转导增加(Tsukamoto等人，1990年). 此外，miR-200家族（包括miR-200a）的表达受损导致ZEB1和ZEB2蛋白上调(Gregory等人，2008年). 与miR-200a的下调一致，我们发现Lieber-deCarli酒精饮食喂养动物中ZEB1表达增加；MCD饮食喂养小鼠的miR-200a没有变化，其ZEB1表达与配对喂养对照组相当（数据未显示）。miR-200a也调节刺猬信号(Katoh等人，2008年)对小鼠和人类酒精性肝病的严重程度有影响(Jung等人，2008年). miR-322紧密调节表皮生长因子受体的功能(Ramasamy等人，2007年)影响肝细胞增殖(Zhang等人，1999年)在酒精性肝病模型中，它是保护肝脏免受酒精诱导损伤和对细菌内毒素致敏的关键(Deaciuc等人，2002年). 有趣的是，miR-182、miR-183和miR-199a-3p在NASH模型中上调，而在ASH中下调。据报道，miR-182在真性红细胞增多症粒细胞中上调(Bruchova等人，2008年)miR-183在结直肠癌中过度表达(Bandrés等人，2006年)，表明它们尚未确定的靶基因很可能是肿瘤抑制剂。

我们观察到，在非酒精性脂肪性肝病模型中，Lieber-deCarli酒精饮食诱导了5种microRNA的上调，而MCD饮食则导致17种microRNAs的过度表达。在Lieber-deCarli饮食喂养期间上调的所有microRNA中，其中两个，包括miR-705和miR-1224，在喂食MCD饮食时也上调。迄今为止，没有关于miR-705和miR-1224的功能和/或靶点的信息；与桑格研究所microRNA数据库（网站）中包含的许多其他microRNA一样，这两种microRNA有一个确定的序列，但等待它们的确认体内功能和生理作用。酒精性和非酒精性脂肪肝之间microRNA表达的差异可能是由于不同的诱导损伤模型所致，然而，与富含酒精的饮食相比，MCD饮食的损伤程度更大。同样可以想象的是，仅在喂食MCD的动物中观察到体重减轻，而在喂食酒精的动物中没有观察到体重减少，这可能会导致两种肝损伤模型之间microRNA的差异。在这些条件下，酒精对肝脏microRNA谱影响的具体机制尚待确定。

迄今为止，有明确的迹象表明，miRNA在已知的导致脂肪性肝炎发展的病理过程的每一个步骤中都发挥作用，包括脂质代谢(Wilfred等人，2007年;以扫等人，2006年)，肝细胞应激反应(Bhattacharyya等人，2006年)以及通过调节先天免疫和适应性免疫控制炎症(Chong等人，2008年;Tili等人，2007年;Liston等人，2008年). 此外，TGFβ是一种有效的纤维化因子（Seki等人，2008），在pri-miRNA到pre-miRNA步骤调控一组特定的miRNA，以调节细胞可塑性和可能的肿瘤发生(Davis等人，2008年). 据报道，一些miRNA在确立肝脏肿瘤发生中起作用(Wong QW等人，2008年;Varnholt H等人，2008年;Tryndyak副总裁等，2008年;Connolly E等人，2008年); 因为许多肝脏肿瘤之前都有晚期脂肪性肝炎(Bugianesi等人，2002年;Morgan等人，2004年)miRNA谱可能对肝癌的癌前阶段具有预测价值。最近的报告表明，酒精诱导的大脑和肠道病理可以控制在miRNAs水平(Pietrzykowski等人，2008年;Tang等人2008); 我们的数据为酒精摄入（Lieber-deCarli饮食模型）或MCD缺乏诱导的脂肪肝肝损伤期间肝脏特异性microRNA谱提供了新的见解。更令人兴奋的是，miRNAs正在成为癌症、哈特病和病毒性疾病的治疗靶点(Barbarotto等人，2008年;van Rooij等人，2008年;Sall等人，2008年). 最近报道了使用微小RNA抗原将其输送到肝脏的方法，人们对基于miRNA的肝病治疗策略抱有很高的期望(Krutzfeldt等人，2005年); 我们关于正常肝脏和脂肪性肝炎发展过程中microRNA谱基线状态的新数据有助于更好地理解这一未来的治疗工具。

总之，我们的结果提供了关于酒精性和非酒精性静止性肝炎的microRNA特征的新信息，并为肝病研究提供了新的途径。

​

表1

Lieber-deCarli和MCD饮食喂养后肝脏microRNA的变化

微小RNALieber-deCarli饮食蛋氨酸及胆碱缺乏饲料
182下调监管上调监管
183下调监管上调监管
199a-3页下调监管上调监管
705上调监管上调监管
1224上调监管上调监管

补充材料

补充图S1和表S1

补充图1。microRNA微阵列的质量控制：

用Cy3（绿色）或Cy5染料（红色）标记肝脏microRNA（5μg/样品），并与含探针芯片杂交（序列符合Sanger miRBase Release 10.1）。显示了Lieber-deCarli和MCD日粮喂养组的Cy3、Cy5和Cy3/Cy5比率的代表图。Cy3和Cy5提供了关于单个样品中不同miRNA表达水平的信息，并且该比率感测到相应样品之间miRNA的差异表达。

单击此处查看。（2.9M，pdf）

致谢

这项工作得到了NIH的资金支持（1R01DK075635和5R01AA008577）

缩写

中高音丙氨酸氨基转移酶
MCD公司甲硫氨酸胆碱缺乏
MCS公司补充蛋氨酸-胆碱

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