炎症小体调控的复杂分泌程序控制旁分泌衰老

旁分泌衰老是由分泌因子介导的一种稳定的阻滞

我们注意到，与在共培养中进行OIS的细胞相比，正常细胞的阻滞稍有延迟(图2a). 我们假设这种延迟可能归因于旁分泌反应，因为SASP成分（CXCL1、IL-8、CCL-20、ActivinA或VEGFc）的诱导早在RAS激活后2-3天发生(图2b,S3a公司).

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图2

旁分泌衰老是由可溶性因子介导的一种稳定的停滞

（a）在与4OHT共培养激活后7天内，定量IMR90 ER:RAS（中央）和IMR90樱桃细胞（右侧）合并BrdU的百分比。数据是一个具有代表性的实验。中提供了两个独立实验的源数据补充表S8.（b）OIS期间分泌因子产生的动力学。收集IMR90 ER:RAS细胞的条件培养基，并通过ELISA检测CXCL1（左）或IL-8（右）水平。数据是一个有代表性的实验。中提供了两个独立实验的源数据补充表S8.（c）旁分泌衰老是一种稳定的停止。细胞通过转染孔共同培养分离。一周后，将底部的IMR90细胞分裂、播种并单独培养14天。CV（中央）和SA-β-Gal染色（右侧）如图所示。比例尺，50μm。（d）衰老细胞的条件培养基诱导旁分泌衰老。CM实验说明图（左）。CM收集自IMR90载体或IMR90 ER:RAS细胞，在200 nM 4OHT存在下生长7天。通过BrdU染色评估CM对IMR90细胞的影响（右）。数据是第1-3天n=2个独立实验的代表性实验，第4天n=3个独立试验的平均值+/-标准差。第4天（学生t检验）的两个独立实验和统计数据的源数据见补充表S8.（e）接受OIS的成纤维细胞诱导正常邻近成纤维细胞生长停滞。IMR90 ER:RAS细胞在克隆柱体的帮助下被植入正常IMR90-Cherry细胞周围的“簇”中（左）。细胞在有或无200 nM 4OHT的条件下生长7天。在外部区域（IMR90-Cherry）和内部区域（IMR 90-ER:RAS）的连续区域中计算BrdU阳性细胞的百分比。数据是n=3个光场的平均+/-s.d。（f）一项通过条件培养基测试衰老连续转移的实验表明，“第三代”细胞中缺乏SA-β-Gal阳性细胞时，衰老有一定程度的停滞。数据代表n=2个独立实验。比例尺，50μm。

为了测试可溶性因子是否介导旁分泌衰老，我们使用跨孔插入物来确保细胞的物理分离(图2c,步骤3b). 底部的IMR90细胞显示出衰老的形态，当在顶部培养箱中与衰老细胞共同培养时，细胞会停止生长(图S3b). 接下来，我们使用转染孔将正常细胞与IMR90-ER:RAS共培养7天。此时，我们将IMR90细胞分离，单独培养14天(图2c). 经历旁分泌衰老的细胞继续表现出衰老特征，表明传递的表型是稳定的(图2c). RT-PCR分析在跨阱实验中排除了细胞间的交叉污染或RAS癌基因的传播(图S3c).

为了证实衰老细胞分泌的因子足以诱导旁分泌衰老，我们将正常IMR90细胞暴露于表达RAS、RAF或MEK活性形式的IMR90电池的条件培养基（CM）中。而接触对照细胞CM的细胞生长正常，接受来自衰老培养物CM处理的细胞显示BrdU掺入减少，SA-β-Gal染色阳性率更高(图2d,S3d系列). CM退出后，细胞阻滞持续存在(图S3e). 在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs，图S3f).

由于旁分泌衰老似乎依赖于可溶性因子，我们推断其影响应受到空间限制。为了测试这一点，我们种植了一个由正常IMR90-mCherry细胞包围的IMR90-ER:RAS细胞“簇”(图2e). 靠近IMR90-ER:RAS簇的正常IMR90-mCherry细胞（在3个光场中，相当于1 mm）在诱导OIS后显示BrdU掺入减少(图2e). 相反，正常IMR90-mCherry细胞位于离集群较远（>1mm）的位置，不受RAS激活的影响。类似地，当来自经历OIS（“初级”衰老）的细胞的CM触发旁分泌衰老（“次级”）时，来自这些细胞的CM只会减缓正常细胞（“第三”）的增殖，而不会诱导SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞(图2f和S3d系列). 这些数据并不排除细胞间接触或细胞外基质有助于旁分泌衰老，但通过可溶性因子确定了衰老的有限遗传性。

旁分泌衰老类似于完全衰老反应

接下来，我们共同培养IMR90-mCherry和IMR90-ER:RAS细胞，并使用经过彻底验证的抗体通过HCA监测衰老标记物和效应器的表达(图S1c-e). RAS激活后，IMR90-ER:RAS细胞在共培养中显示出较高的DNA和氧化损伤，CDKIs，p16的表达上调^墨水4a和第21页^CIP1级和IL-8，SASP的一种成分(图3a，顶部中心）。共同培养的正常细胞（IMR90-mCherry）也显示氧化和DNA损伤水平增加，p16活化^墨水4a，第21页^CIP1级和IL-8表达，提示衰老的完全传递(图3a，右上角）。在与接受OIS的IMR90-MEK:ER细胞共培养的正常细胞中观察到类似的衰老特征诱导(图S4a).

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图3

旁分泌衰老依赖于p16^墨水4a/Rb和p53/p21^CIP1级肿瘤抑制网络

（a）IMR90-Cherry细胞与IMR90ER:RAS细胞在存在或不存在200 nM 4OHT的情况下共同培养。4OHT处理7天后，对细胞进行IF。显示每个标记物的IMR90 ER:RAS（顶部，中心）或IMR90樱桃细胞（顶部，右侧）阳性的百分比。数据是一个具有代表性的实验。中提供了两个独立实验的源数据补充表S8。底部显示有代表性的图片。比例尺，30μm。（b）IMR90、IMR90 ER:RAS或IMR90细胞与IMR90载体或IMR90-ER:RAS细胞一起在Transwells中培养7天，在200 nM 4OHT和0.5%FBS存在下的mRNA表达谱。该图显示了OIS细胞与旁分泌衰老之间的相关性。（c）基因变化超过2倍的层次聚类，集中在一个聚类中，定义了OIS和旁分泌衰老之间的等效性。（d）衰老相关信号的GSEA¹⁸在经历旁分泌衰老的IMR90细胞中。（e）从经历旁分泌衰老的IMR90细胞中提取的特征在小鼠PANIN中富集⁴⁴和人类锯齿状无柄腺瘤（SSA）³⁶.NES，归一化富集分数；FDR，错误发现率。（f）旁分泌衰老依赖于p53/p21^CIP1a公司和第16页^墨水4a路径。用所示的siRNA转染IMR90细胞。第二天，加入来自IMR90 ER:RAS或IMR90载体细胞的CM。添加CM后2天通过BrdU掺入评估IMR90 ER:RAS细胞的增殖（右）。数据为平均值±标准差，n=3个独立实验。源数据和统计数据（学生t检验）见补充表S8转染不同siRNA的IMR90细胞接受IF作为敲除效率的对照（中心）。

全球基因表达揭示了经历OIS的IMR90细胞与旁分泌衰老之间的高度相关性(图3b和S4b系列). 无监督分层聚类将OIS和旁分泌衰老分组(图3c)和与衰老相关的转录特征¹⁸在旁分泌衰老期间显著上调(图3d). 此外，qRT-PCR证实CDK抑制剂和SASP在旁分泌衰老过程中被诱导(图S4c和表S1).

为了了解旁分泌衰老是否通常与衰老相关，我们比较了旁分泌衰老和MEK激活诱导的OIS¹⁹观察到上调基因的显著重叠(图S4d). 此外，我们还获得了一个“旁分泌衰老”特征，并使用基因集富集分析（GSEA）来研究其与衰老转录体的关联。不同类型的人和小鼠细胞在经历复制性、致癌基因或应激诱导的衰老时，表现出丰富的“旁分泌衰老”特征(图3e和S4e、f). 其中，接受OIS的HMEC细胞表达了关键的SASP成分，这表明旁分泌衰老的发生类似(图S4g). “旁分泌衰老”特征也与小鼠胰腺上皮内瘤变（PanIN）和人类锯齿状固着腺瘤（SSAs，图3e,S4f系列)，两者都富含衰老细胞的病变。为了研究旁分泌衰老是否依赖于与OIS相同的遗传网络，我们敲除了IMR90细胞衰老的关键效应器，并将其暴露于衰老细胞的条件培养基中，或与经历OIS的细胞共同培养。这些实验表明，旁分泌衰老的停止依赖于p16的激活^墨水4a，第21页^CIP1级和p53(图3f,第4小时).

SASP的多组分介导旁分泌衰老

接下来，我们使用培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC，图4a). 无偏定量蛋白质组学在覆盖范围的广度和检测基因表达谱中不明显的蛋白质表达变化的能力方面提供了几个优势(图4b). 其中最热门的是趋化因子、TGFβ家族配体或VEGF(图4c和表S2为了确定哪些因子介导旁分泌衰老，我们收集了78种化合物，以其受体或SASP激活的关键下游通路为靶点(表S3). 用药物库处理的正常IMR90细胞暴露于来自OIS细胞的CM，48小时后评估BrdU掺入。在部分损害阻滞的化合物中，有几个以VEGFR2/FLT3、TGFBR1和CCR2受体为靶点(图4d和表S3). 这些化合物被证实以剂量依赖的方式抑制旁分泌衰老，但CCR2抑制剂表现出双相作用(图4e). 通过使用RNAi敲低CCR2或TGFβ受体ALK4、ALK5（也称为TGFBR1）和ALK7的表达，我们证实了它们的作用(图4f，g). 这些结果表明，衰老细胞分泌的多种因子介导旁分泌衰老。

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图4

SASP的多种成分参与旁分泌衰老

（a）概述蛋白质组学方法的图表。（b）接受OIS的细胞分泌体mRNA和蛋白表达的比较。总体皮尔逊相关系数为0.64。诱导蛋白的相关性较低，为4倍以上（红线，皮尔逊相关性=0.15）。这表明SASP成分（例如MMP7、IGFBP5、IGFBP 6、THBS1、THBS2和IL6ST）在转录后上调。（c）2个正向和反向SILAC实验图。在至少2/3的实验中，显著的变化是彩色的。（d）筛选抑制旁分泌衰老的化合物。IMR90成纤维细胞在含有78种药物的CM中生长。2天后，测定BrdU掺入量，用二甲基亚砜处理IMR90并在IMR90 ER的CM中生长：RAS−4OHT；+，用二甲基亚砜处理IMR90，并在IMR90 ER:RAS+4OHT的CM中生长。灰色区域表示无药物对照中BrdU值的120%的任意截止值（+）。标记了针对VEGFR2和/或FLT3（橙色）、CCR2（绿色）或TGFBR1（棕色）的超过截止值的抑制剂。数据为平均值±标准差，n=3个独立筛板。（e）IMR90细胞与指定的CM和药物（浓度10μM至10 nM）培养2天。增殖通过BrdU掺入进行评估。图表显示了两个独立实验中的一个代表性实验。（f）感染的IMR90细胞用CM处理，并用CV（顶部）评估生长。数据是两个独立实验中的一个代表性实验。针对CCR2的IF显示为所用shRNAs效率的控制（底部）。比例尺，10μm。（g）TGFβ家族受体的敲除部分挽救旁分泌衰老。用指示载体感染的IMR90细胞用衰老或对照细胞的CM处理，并在10-14天后通过CV（左上）和SA-β-Gal染色（左下）评估衰老。通过qRT-PCR（右）测量击倒效率。数据是两个独立实验中的一个代表性实验。中提供了两个独立实验的源数据补充表S8.比例尺，50μm。

TGFβ途径介导旁分泌衰老

我们还询问了化合物库中影响RAS诱导衰老的能力(图S5a,表S3). 除了被鉴定为影响旁分泌衰老的化合物外，“自分泌衰老筛选”表明，抑制IL-1R信号也可以阻止OIS(图5a和S5a系列). 两种筛选的比较表明，TGFBR1抑制剂对“旁分泌”而非“自分泌”衰老的影响更为显著(图5a). 事实上，尽管GSEA揭示了TGFβ1信号与OIS和旁分泌衰老的关联(图5b)，大多数TGFβ依赖基因在旁分泌衰老过程中比OIS更显著上调(图5c).

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图5

TGFβ信号转导在旁分泌衰老中的作用

（a）比较旁分泌屏幕和自分泌屏幕。自分泌屏幕已进入补充图S5A.（b）转化生长因子β靶基因在OIS和旁分泌衰老过程中的GSEA。。（c）一组转化生长因子β靶基因在OIS和旁分泌衰老中的qRT-PCR。数据为平均值±标准差，n=3个独立实验（d）通过qRT-PCR（bars）在OIS期间诱导TGFβ配体。SILAC实验中的诱导用蓝色表示。数据为平均值±标准差，n=3个独立实验（e）用CM和10μg/ml抗体处理IMR90细胞2天。生长通过BrdU掺入（右）进行评估。p-SMAD2/3阳性细胞百分比显示（左）。数据为平均值±标准差，n=4个独立实验。使用Student t检验计算p。pSMAD 2/3统计：ActivinA p=0.0037；转化生长因子βp=0.91；骨形态发生蛋白2 p=0.52；激活素A/TGFβp=0.0029；激活素A/TGFβ/BMP2 p=0.040；TGFβ抑制剂II p值0.0007。对于BrdU，统计数据：ActivinA p=0.009905573；转化生长因子βp=0.282677043；骨形态发生蛋白2 p=0.233112557；激活素A/TGFβp=0.000723521；激活素A/TGFβ/BMP2 p=0.002428509；TGFβ抑制剂II p=4.44×10⁻⁵。源数据位于补充表S8.（f）TGFBR1抑制剂可部分防止旁分泌衰老。IF对抗磷酸化SMAD2/3。比例尺，10μm。代表性图片（左）。按照指示处理IMR90细胞。墨水4b和CDKN1a公司用qRT-PCR测定表达（右）。数据为平均值±标准差（n=3个独立实验，p，学生t检验）。pSMAS2/3统计：抑制剂I p=4.49×10⁻⁵; 抑制剂II 4.53×10⁻⁵.INK4B统计：抑制剂I p=0.00083；抑制剂II p=0.010。CDKN1A统计：抑制剂I p=0.00054；抑制剂II p=0.00014。源数据提供于补充表S8.（g） 碱性5删除抑制Kras^G12D系列-PANIN中的驱动OIS。显示所用小鼠菌株的图表（左上角）。GSEA显示PANIN中TGFβ激活（左下角）。Ki67和SA-β-Gal染色（中央）和定量（右侧）显示Pdx1-cre克拉^G12D系列/+ 转化生长因子βR1^{飞行/飞行}老鼠。比例尺，100μm。箱线图表示第一和第三个四分位数（n=5只老鼠/条件）。内线显示中间带。晶须延伸到最高或最低的观测值。对于使用Mann-Whitney计算的两个实验，p=0.0184。

TGFBR1型受体结合多个TGFβ家族配体²⁰虽然TGFβ1也被诱导，但TGFβ和BMP分支的其他配体，包括BMP6、BMP2、InhibinA和GDF15，在衰老过程中受到更剧烈的上调(图5d,5亿美元). BMP样配体和TGFβ样配体通过激活不同的SMAD家族成员发出信号。在经历旁分泌衰老的细胞中，SMAD2/3和SMAD1/5的磷酸化上调(图5e,S5c系列)，证实TGFβ信号的两个分支参与衰老。BMP2对衰老的影响已有报道²¹我们进一步确认(图S5d). 此外，以TGFβ1、激活素A（抑制素A的同型二聚体）和骨形态发生蛋白2为靶点的阻断抗体的结合，部分缓解了旁分泌衰老过程中观察到的阻滞(图5e). TGFBR1抑制剂阻止SMAD2/3磷酸化(图5f和第5版)减缓旁分泌衰老(图5f). 这些影响与p15受损相关^墨水4b和第21页^CIP1级诱导(图5f,5克)与以前的观察结果一致²².

我们接下来研究TGFβ信号是否影响衰老体内我们使用了携带条件Pdx1驱动激活Kras等位基因（Kras）的小鼠^G12D系列)²³.克拉^G12D系列是胰腺中的一个强效癌基因，但其致瘤特性受到其引起OIS的能力的限制，如在癌前PanIN病变中观察到的²⁴GSEA显示TGFβ信号与这些PanIN损伤相关(图5g，左下角）。Pdx1-cre克拉^G12D系列小鼠与缺乏TGFβR1的条件等位基因杂交(转化生长因子βR1^{飞行/飞行})²⁵(图5g，左上角）。观察到的病变Pdx1-cre克拉^G12D系列/+小鼠具有OIS特征，增殖低，SA-β-Gal染色阳性(图5g). OIS在年减弱Pdx1-cre克拉^G12D系列/+ 转化生长因子βR1^{飞行/飞行}损伤(图5g). 重要的是Pdx1-cre克拉^G12D系列/+ 转化生长因子βR1^{飞行/飞行}小鼠在不到3个月的时间内死于胰腺癌和皮肤癌的混合瘤，而Pdx1-cre克拉^G12D系列/+动物进展为胰腺癌，潜伏期超过一年^26,27.

炎症小体的激活控制SASP的生成

由于SASP的多个成分执行旁分泌衰老，我们寻找协调其表达的因素。我们筛选了诱导IL-6和IL-8的因子，确定IL-1α是最强大的诱导剂之一(图S6a). IL-1α信号转导与衰老中IL-6和IL-8的调节有关²⁸一项更彻底的分析确定IL-1α是多种SASP成分的有效诱导剂(图6a、b). 此外，IL-1α的表达可引起OIS中SASP样反应的表型复制细胞(图6c，左）。尽管表达抑制素A或转化生长因子β的细胞诱导了一些SASP成分，如IL-8或CCL2(图S6b)，他们没有模仿SASP(图6c，中间）。抑制TGFBR1并不影响IL-1α诱导的分泌体(图6c，右侧）。此外，虽然IL-1α的抑制部分阻止了TGFβ诱导IL-8或CCL2，但相反的情况并非如此(图S6b)表明IL-1在控制SASP中的作用比TGFβ信号更为显著。

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图6

炎症小体调节衰老分泌小体

（a-b）用表达IL-1α的载体或对照物感染IMR90细胞，并对所示的SASP成分进行IF。比例尺，30μm。（b）（a）的量化。（c）IL-1α激活SASP样反应。IMR90细胞被表达RAS的逆转录病毒感染^G12伏，IL-1α或抑制素A。当指示使用4μM TGFBR1抑制剂II时。CM用于探测趋化因子和细胞因子抗体阵列。（d）IL1R通路的基因集富集分析（GSEA）在接受OIS（左）和小鼠PANIN（右）的IMR90细胞的基因表达谱中。FDR，错误发现率；NES，标准化浓缩分数。（e）qRT-PCR分析显示IL1R信号传导相关的一组基因的表达。数据是两个独立实验中的一个代表性实验。（f）IB，在CM中具有针对IL-1α和IL-1β的抗体，所述CM收集自IMR90 ER:RAS（RAS）或IMR90载体细胞（vector），用200nM 4OHT和0.5%FBS.Pro，前体形式孵育7天；垫子，成熟形状。（g）OIS期间炎症小体的激活。IMR90 ER:RAS细胞（左）和SSA（中）和PANIN（右）小鼠模型显示Caspase 1活性增加。数据为平均值±标准差，n=4、3、6和8个不同样本，分别用于对照组（胃肠道）、SSA、对照组（胰腺）和PanIN。（h）IMR90 ER:RAS细胞在200 nM 4OHT存在或不存在的情况下培养，用识别炎症组分的抗体进行IF。下面一行显示了对IMR90 ER:RAS细胞+4OHT的控制，无主ab（无ab）。比例尺，10μm。（i）IMR90 ER:RAS或IMR90载体细胞在200 nM 4OHT和0.5%FBS的存在下用10μM Caspase-1抑制剂或20μM IL1R拮抗剂培养7天。之后，对细胞进行处理，并对不同SASP成分进行qRT-PCR。数据为平均值±标准差，n=3个独立实验。实验数据也显示在图S6j.

GSEA表明，IL-1信号与培养液和培养液中的旁分泌衰老和OIS相关体内(图6d和S6c-d系列). OIS期间还诱导了IL-1信号分子（如IRAK家族激酶）(图6e,S6e系列). IL-1α和IL-1β被合成为前体。特别是，在炎症小体（由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1和几个适配器分子组成的多蛋白复合物）处理前，IL-1β原是不活跃的^29,30接受OIS的细胞分泌经过处理的成熟形式的IL-1α和IL-1β，表明炎症小体激活(图6f). 事实上，接受OIS的IMR90细胞显示Caspase1活性(图6g，左）。炎症小体在OIS期间也被激活体内：Braf中^V600E型-驱动小鼠SSA³¹在克拉斯^G12D系列-驱动性PanIN病变(图6g，中间和右侧）。炎症组分的蛋白水平，如Caspase 1、ASC（也称为PYCARD）和NLPR3（但非NLPR1）在OIS期间上调(图6h,S6f系列)mRNA水平无明显变化(图S6g)，表明蛋白质稳定。接受OIS的细胞分泌NLPR3和Caspase1，这是Caspase1依赖性非常规分泌的特征(图S6h)³²最后，用Caspase 1或IL-1R抑制剂治疗(图6i,S6i系列)但不是TGFBRI抑制剂(图S6j)，减弱了OIS期间SASP组分的表达，表明炎症小体的激活是SASP的原因而非作用。

炎症体和IL-1信号增强衰老

异位IL-1α表达抑制IMR90细胞(图7a)导致衰老(图7b)伴随氧化和DNA损伤增加，以及p53和p21的诱导^CIP1级(图7c,S7a公司). 相反，IL-1受体或炎症组分的敲除部分阻止了OIS(图7d). 使用靶向IRAK家族下游适配器分子的siRNAs扩展了这些结果(图S7b-d). Caspase 1抑制剂治疗部分阻止了p21的诱导^CIP1级OIS期间观察到的细胞周期阻滞(图7e)同时使用shRNAs抑制IL-1R信号(图7f,S7e公司)或阻断针对IL-1α和IL-1β的抗体(图S7f)也影响旁分泌衰老。

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图7

IL-1信号调节衰老

（a）IMR90按指示感染，CV测量增殖。（b）SA-β-Gal染色。比例尺，50μm。（c）如果使用指示的抗体。数据是一个具有代表性的实验。中提供了两个独立实验的源数据补充表S8.（d）IMR90 ER:RAS按指示感染，细胞生长通过CV分析（右）。qRT-PCR显示敲除效率（左）。数据是两个独立实验中的一个代表性实验。（e）IMR90 ER:RAS细胞如图所示被树突化。BrdU合并和p21^CIP1级检测表达。数据为平均值±标准差，n=3个独立实验。使用Student t检验计算p。对于BrdU，IL1R inh p=5.30×10⁻⁵; Casp inh I p=0.013；Casp inh II p=0.013。对于p21，IL1R inh p=6.73×10⁻⁶; Casp inh I p=1.42×10⁻⁵; 酪蛋白抑制剂II p=0.00047。源数据提供于补充表S8.（f）IL1R的敲除可防止旁分泌衰老。IMR90细胞感染并按指示进行治疗。10-14天后，对细胞进行SA-β-Gal染色。数据为代表性实验。中提供了两个独立实验的源数据补充表S8.（g-i）抑制IL-1R可减少衰老和免疫清除体内.（g）Nras公司^G12伏或Nras^G12V/D38A转座子和转座子酶通过水动力注射共同传递到小鼠肝脏。用载体或药物治疗小鼠12天。（h）Nras的量化-（顶部），p21^{Cip1号机组}-（中央）和第16页^墨水4a-（底部）肝切片上的阳性细胞。学生的t检验（n=5只小鼠/条件）：携带者/Nras^G12伏与IL1R/Nras相比^G12伏，*P<0.0150，承运人/Nras^G12伏与抑制剂组合/Nras相比^G12伏，**P<0.002，p21：载波/Nras^G12伏与IL1R/Nras相比^G12伏，*P<0.0341，承运人/Nras^G12伏与抑制剂组合/Nras相比^G12伏，*P<0.0116，p16：携带者/个体^G12伏与抑制剂组合/Nras相比^G12伏，*P<0.01。1、Nras交付^G12V/D38A和车辆治疗。2-7交付Nras^G12伏.治疗方法：2、载具；3、IL1R抑制剂；4、CCR2抑制剂；5、VEGFR2抑制剂；6、TGFBR1抑制剂；7、4种抑制剂的组合。数据为平均值±标准误差。（i）Nras的H&E和IHC代表性图片，第2页^密码1和第16页^墨水4a.比例尺，100μm。

接下来，我们利用了一种模型，该模型通过稳定的转座子介导的致癌Nras（Nras）转移在小鼠肝脏中诱导OIS^G12伏). 该模型用于显示衰老的肝细胞进行免疫介导的清除（指定为“衰老监测”），这对抑制肿瘤很重要¹²使用该模型，我们测试了阻断IL-1和其他SASP成分是否影响肝细胞衰老。注射Nras后^G12伏转座子，小鼠每天用指定的化合物治疗12天(图7g). 转导6天后，Nras表达阳性的细胞百分比相似(图S7g)注射后12天，用IL-1R抑制剂或药物组合（靶向IL-1R、VEGFR2、CCR2和TGFBR1）治疗的小鼠的百分比更高，反映出免疫系统对衰老肝细胞的清除减少和/或衰老抑制。为了分析对衰老的影响，我们测量了p16^墨水4a和第21页^{Cip1号机组}水平，观察到IL-1R抑制剂或药物联合治疗降低了衰老肝细胞的百分比(图7h，i和S7小时). 用IL-1R抑制剂治疗也导致NRas阳性细胞显著增殖(图S7i). 使用IL-1α中和抗体进一步证实了抑制IL-1的作用(图S7j). 总之，上述结果强调了IL-1信号和SASP调节与衰老的相关性体内.

细胞培养

从ATCC中获得HEK293T和IMR90细胞。细胞按照说明进行维护⁴⁵HMEC-hTert细胞在乳腺上皮细胞生长培养基（PromoCell）中培养。在添加10%FBS的乳腺上皮细胞生长介质（PromoCell）中进行IMR90和HMEC的共培养。我们使用0.02μm无孔细胞培养插入物（Nunc-Thermo）进行跨周共培养实验。使用番石榴Viacount试剂（Millipore）和番石榴石细胞仪（Millipore）测定细胞数量和细胞活力。

逆转录病毒和慢病毒感染

逆转录病毒和慢病毒感染如前所述进行^45,46.

质粒

表达靶向p16的shRNAs的pRetroSUPER（pRS）质粒^墨水4a、p53或p21^CIP1级和pBABE-Ras^V12版本pLNC-ER:RAS和pLNC-MEK:ER已在前面描述过⁸通过从pCMV6 IL-1α（Origene）克隆其cDNA，获得了编码IL-1α的MSCV puro逆转录病毒质粒。基于pGIPZ的靶向ALK4、ALK5、ALK7、IL1R1、CASP1、ASC和TP53的shRNA载体来自SIGMA。

BrdU掺入、生长曲线、集落形成分析和衰老相关β-半乳糖苷酶染色

这些方法已在其他地方介绍过^45,46.

条件培养液

2×10⁶将指示的细胞接种在10厘米的培养皿中，并在DMEM 0.5%FBS中与200 nM 4OHT孵育7天。孵育后，收集条件培养基（cm），以5000克离心，并通过0.2μm孔径过滤器过滤。CM与DMEM 40%FBS以3:1的比例混合，生成含有10%FBS的CM。

siRNA的转染

使用3.5%的HiPerFect转染试剂（QIAGEN）溶液，用30 nM siRNA反向转染IMR90成纤维细胞。AllStars打乱siRNA作为阴性对照。有关siRNA的列表，请参阅表S5.

基因表达分析

按照说明进行RT-qPCR⁴⁷使用的引物集和TaqMan基因表达分析（应用生物系统）列于表S6.

微阵列分析

在全球基因表达研究中，cRNA与人类基因1.0 ST阵列（Affymetrix）杂交。在EMBL进行微阵列数据处理和分析。使用稳健多芯片平均值（RMA）对数据进行归一化，并使用微阵列线性模型（LIMMA）识别差异表达基因。使用Benjamini-Hochberg假发现率（BH）<0.05的截止值来确定重要基因。所有分析均在R（v2.13.0）中进行。

基因集富集分析（GSEA）

我们使用GSEA（v2.07）检测基因集和基因表达之间的关联。我们用对数对基因进行排序₂从LIMMA对比中获得的折叠变化。预分类的GSEA是使用规模为5-1200个基因的精选分子特征数据库（v3.0）进行的(http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp). 为了定义“旁分泌衰老”特征，选择了上调>2倍的基因。

免疫荧光和高含量分析

如前所述执行IF⁴⁷使用中列出的抗体表S7使用自动高通量显微镜（IN Cell Analyzer 1000或2000，GE Healthcare）进行图像采集。如其他地方所述，进行了高含量分析（HCA）^45,47,48简单地说，使用IN细胞分析仪1000或IN细胞分析仪2000自动外荧光仪（GE Healthcare）为每个场采集两个或三个对应于DAPI、一级抗体/Alexa Fluor 488-二级抗体和Cherry的荧光图像。获得的细胞不少于1000个。使用IN Cell Investigator软件（v1.7；GE Healthcare）进行HCA。DAPI染色鉴定细胞。然后使用顶帽分割法对细胞核进行分割。设置衣领分割例程来定义细胞段。为了确定分析蛋白的细胞表达或检测樱桃标记细胞，测量指定核区域（目标核强度）内参考通道（Alexa Fluor 488或樱桃）中像素的平均强度。每个细胞被分配一个核强度值，用于设置阈值过滤器。阈值过滤器使用直方图进行数据可视化。为了设置过滤截止值，测量对照细胞的表达以确定阴性人群，然后分析阳性对照(图S1a). 因此，软件将每个细胞的分析蛋白或信号的表达分为阳性或阴性(图S1b). 常规分析核强度的平均值和等效结果。测试用于分析的抗体（shRNAs或siRNAs）以评估其特异性(图S1c-e).

质谱法

这是按照中所述进行的⁴⁹

分泌蛋白的鉴定

为了识别分泌蛋白，使用分泌蛋白数据库的0到3级和Gonzalez及其同事的“分泌”或“SPTM”分类进行过滤^50,51该标准要求将蛋白质标注为0到2级、“分泌型”或同时标注为“SPTM”和0或1级。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1分析

50μg细胞提取物或200μg胰腺或结肠组织蛋白提取物与WEHD-AFC底物孵育2小时（细胞）或6小时（组织），并在微板阅读器中测量，在400 nm激发，505 nm荧光发射。

抗体阵列

使用ImageJ软件（NIH）对人类趋化因子或人类细胞因子V阵列（Ray Biotech，Inc）进行处理和量化。

蛋白质印迹分析

如前所述，对蛋白质提取物进行处理和分析⁴⁵.

使用的实验Pdx1-核心KrasG12D/+老鼠

实验是根据英国内政部的规定进行的。携带条件Pdx1-Cre KrasG12D/+等位基因的小鼠^23,52与携带条件敲除ALK5/TGBR1等位基因的小鼠杂交²⁵用Ki67抗体对来自6周龄小鼠的福尔马林固定石蜡包埋小鼠胰腺切片进行染色。计算每个PanIN中Ki67阳性细胞的总数和每个PanIN的总细胞数，并计算每个PanIN中Ki67阴性细胞的百分比。计算每只小鼠的平均得分，并将这些得分绘制在方框图上。在6周龄小鼠胰腺冰冻切片上进行SAβ-gal染色，并使用组织学方法评估染色强度和每个PanIN染色的比例。使用公式∑（0×无染色）+（1×低强度）+（2×高强度）计算。计算每只小鼠的平均得分，并将这些得分绘制在方框图上。对每个基因型的5只小鼠（3只雄性和2只雌性）进行评估。使用Mann-Whitney检验来比较基因型，从而评估统计学显著性。

体内肝细胞衰老实验

将VEGFR2/Flt3/c-Kit抑制剂（Calbiochem 676500）溶解在2%乙醇、5%吐温80、20%聚乙二醇400和73%等渗氯化钠溶液中，并以4 mg/kg体重每天口服两次。IL1-R拮抗剂（Calbiochem 407616）溶于等渗氯化钠溶液中，每2周腹腔注射一次^第每天服用200mg/kg体重。RS102895（Sigma R1903）是一种CCR2拮抗剂，以10mg/kg/天的剂量通过饮用水施用。从TGF-βRI激酶抑制剂（Calbiochem 616452）中制备3.4mM二甲基亚砜储备溶液。每天两次皮下注射100微升1至10倍稀释的PBS。对于每个抑制剂，使用四只C57bl6小鼠和四只对照动物（年龄4-6周，均为雄性）。治疗从第-2天开始，一直持续到第12天。在第0天，流体动力学尾静脉注射基于转座子的Nras表达质粒和睡美人13转座酶的表达质粒¹²执行。第12天，处死动物并收集肝脏。样品固定并进行IHC分析。使用Axio成像仪M2（蔡司）进行显微镜分析。在每个小鼠肝脏的两个肝切片上对五个高倍视野进行计数（每个视野200×，>200个计数细胞）。

小鼠皮肤样品的IHC

4周龄野生型或K5-Sos Egfr^wa2型/+小鼠（Egfr亚型杂合子³³)用于实验（男女比例相等）。从尾部分离出正常皮肤或乳头状瘤样本，在4%PFA中固定过夜，然后嵌入石蜡进行IHC分析。

人类结肠样本的IHC

海德堡国家肿瘤中心组织库（项目编号841）经伦理委员会批准（编号206/2005，德国海德堡医学院），提供了来自9名无柄锯齿状腺瘤（SSA）患者的假名人类FFPE组织样本，这些样本均经内窥镜切除。在3μm切片上进行IHC。如前所述，在自动免疫染色器（美国亚利桑那州图森市Ventana Medical Systems Ventana-BenchMark XT）上进行BRAF V600E特异性IHC（克隆VE1）⁵³设置包括用细胞调节剂1预处理60分钟，用未稀释的VE1杂交瘤上清液在37°C孵育32分钟，用文塔纳扩增试剂盒（目录号760-080）增强信号。对于Ki-67（克隆MIB-1，Dako，1:400）和p21WAF1/Cip1（克隆SX118，Dako，1:25），使用碱性缓冲液（pH 9，Dako，Glostrup，Denmark）检索抗原。后一种染色是使用Techmate™500+自动染色系统（Dako）和Avidin–Biotin Complex方法进行的。使用虚拟显微镜（Spectrum™版本11.0.0.725，图像示波器v11.0.2.725，Aperio Technologies，Vista，CA，USA）计算每个区域肿瘤基质中的p21和Ki-67阳性细胞核。为了进行统计评估，使用非参数Wilcoxon秩和检验确定并比较p21与KI-67的比率。

我们感谢M.Stampfer、G.Nuñez和D.Escors提供的试剂，感谢T.Bird、S.Forbes、V.Episkopou、T.Rodríguez、P.Schirmacher、S.Parrinello、M.Narita、G.Peters和D.Beach对手稿的建议和批判性阅读。我们还感谢海德堡国家肿瘤中心组织库提供结肠组织。MRC的核心支持以及MRCT、CRUK和AICR的拨款资助了J.Gil实验室的研究。J.Gil还得到了EMBO青年研究员计划的支持。