生物化学杂志。作者手稿；PMC 2013年6月28日提供。
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美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院477933
氨基酸传感在饮食限制介导的寿命中：信号转导激酶GCN2和TOR的作用
美国马萨诸塞州波士顿亨廷顿大道655号哈佛公共卫生学院遗传与复杂疾病系，邮编02115。
1这些作者为这项工作做出了同等贡献。
摘要
DR（饮食限制），即在没有营养不良的情况下减少食物摄入量，与延长寿命、改善新陈代谢适应性和增强多种生物体的抗应激能力有关。DR通常被称为热量限制，这意味着能量摄入减少是其广泛且进化上保守的益处的原因。然而，最近的数据表明，饮食中的氨基酸限制是DR益处的关键调节因素。在果蝇中，必需氨基酸摄入量的失衡被认为是DR长寿益处的基础。在哺乳动物中，减少膳食蛋白质或必需氨基酸摄入量可以延长寿命，改善代谢适应性，增强抗压能力。在本文中，我们回顾了两种进化上保守的信号转导途径，它们负责感应氨基酸水平。eIF2α（真核生物起始因子2α）激酶GCN2（一般氨基酸控制非去抑制2）通过直接结合未带电荷的同源tRNA来感应一个或多个氨基酸的缺失。某些氨基酸的存在，如亮氨酸，允许激活主生长调节激酶TOR（雷帕霉素的靶点）。这两种信号转导途径通过抑制一般蛋白质翻译，同时增加参与恢复稳态的特异性信使核糖核酸的翻译，对氨基酸剥夺做出反应。总之，这些途径可能有助于调节寿命、代谢适应性和抗应激能力。
关键词：氨基酸、饮食限制（DR）、真核细胞起始因子2α（eIF2α）、普通氨基酸控制非去抑制2（GCN2）、雷帕霉素靶点（TOR）
简介
编码氨基酸是蛋白质合成所必需的，但也涉及许多其他基本过程。例如，单碳转移反应需要蛋氨酸，色氨酸是NAD和5-羟色胺生物合成的前体，谷氨酸作为神经递质，许多氨基酸可以在从糖异生到回补的各种过程中充当中间代谢物。虽然低等生物可以从碳骨架和氮合成所有编码（和非编码）氨基酸，但这些生物合成途径中的一些在多细胞生物进化过程中丢失了。因此，人类（以及小鼠和果蝇）必须通过饮食方式获得必需氨基酸。
DR（饮食限制），松散地定义为在没有营养不良的情况下减少食物摄入，克莱夫·麦凯于20世纪30年代首次证明它可以延长大鼠的寿命[1]. 在接下来的几十年里，DR延长了多种物种的寿命，还有许多其他益处，包括延长健康寿命、改善新陈代谢能力和增强抗应激能力。DR发生了大量变化，包括能量代谢、基因表达、蛋白质周转、免疫功能和氧化应激等[2]. 然而，这些变化中的哪些是DR益处的进化保守要求尚不清楚。
DR也被称为CR（热量限制），部分基于啮齿类动物的数据，表明总热量摄入的减少比这些热量的来源更重要（例如碳水化合物比蛋白质）[三]. 先前关于果蝇的数据表明，热量的来源确实很重要，酵母形式的蛋白质热量的减少比碳水化合物热量对延长寿命的贡献更大[4]. 此外，添加回EAA会抵消DR对果蝇寿命延长的益处[5]. 在啮齿类动物中，人们早就知道减少蛋白质或某些氨基酸（即蛋氨酸和色氨酸）的饮食摄入也可以延长寿命[6,7]. 这与DR延长寿命有什么关系尚不清楚，因为DR啮齿动物和限制蛋氨酸摄入啮齿动物之间有很多相似之处，但也有很多不同之处[8].
细胞如何感知氨基酸的可用性，这些机制在传递DR的益处中可能发挥什么作用？细胞已经进化出不同的机制来感知单个氨基酸的缺失以及其他一些氨基酸的存在。氨基酸缺乏通常由替代标记物（一种不带电荷的同源tRNA）检测。未带电荷的tRNA随后通过多种下游机制触发适应性反应以纠正这种情况。在细菌中，这涉及对转录控制的直接影响，而在真核生物中，未带电tRNAs通过与eIF（真核生物起始因子）2α激酶GCN（一般氨基酸控制非去抑制）2的直接相互作用触发信号转导途径。某些氨基酸（如亮氨酸）的存在也可以被感知，从而激活信号转导途径，通过TOR（雷帕霉素靶点）激酶整合对环境线索（包括营养素）的反应。对该途径中上游氨基酸感应机制知之甚少。两种机制都能检测到的氨基酸缺乏的共同输出是抑制一般翻译，但增强（或去抑制）参与恢复同源性的特定mRNA的翻译。GCN2激活和TOR抑制影响翻译的机制也不同。在本综述中，我们将讨论GCN2和基于TOR的氨基酸感应机制、翻译的下游效应以及这些途径如何促进DR的益处，包括抗应激和长寿。
感知氨基酸缺乏：从非带电tRNA到GCN2激酶
无电荷tRNA激活细菌对氨基酸缺乏的严格反应
正如我们所知，蛋白质合成对生命普遍重要，而感知蛋白质、氨基酸组成部分的机制在整个进化过程中都是保守的。在细菌中，营养缺乏激活了严格的反应，所谓严格的反应是因为包括rRNA和tRNA在内的稳定RNA的转录受到严格的抑制[9]. 严格的反应取决于不寻常的核苷酸ppGpp（5′，3′二焦磷酸鸟苷）或pppGpp[10,11]. ppGpp与转录调节因子RelA结合，以启动子特异的方式调节RNA聚合酶活性，下调一些基因，上调其他基因[12]. 虽然在缺乏磷酸盐、碳、铁或脂肪酸的情况下可能会出现严格的反应，但最好理解为对氨基酸缺乏的反应。当细胞内氨基酸含量低时，同源的非带电tRNAs积累，并能与带电tRNA与核糖体A位点的结合竞争。当不带电的tRNA占据A位点时[13]，翻译速度减慢，核糖体相关的ppGpp合成酶RelA被激活[11]. ppGpp与转录调节剂DksA复合后，可以通过与活性位点附近的RNA聚合酶结合并抑制其活性来抑制稳定的RNA转录[14]. 同时，ppGpp/DksA可以激活氨基酸生物合成基因的转录。
未充电的tRNA通过激活eIF2α激酶触发真核生物的氨基酸饥饿反应
与细菌一样，真核细胞内未带电的tRNAs发出氨基酸耗竭的信号。与细菌不同，酵母有一个专门的不带电荷的tRNA感应分子，即信号转导激酶GCN2[15]. GCN2有一个与HisRS（组氨酸-tRNA合成酶）同源的结构域，该结构域与不带电的tRNA结合[16,17]通过同源二聚和自磷酸化导致激酶活化[15,18]. 除自身外，激活的GCN2只有一个其他已知靶点，即eIF2α。eIF2α的磷酸化阻止了起始蛋氨酸密码子的有效翻译起始。这减缓了大多数mRNA的翻译，同时有利于在5′-UTR（非翻译区）中翻译具有特定调控元件的选择性mRNA。在整体翻译减少的情况下，特定mRNA的选择性翻译上调现象称为翻译去抑制，本综述稍后将对此进行更详细的描述。其中一个这样的去表达mRNA编码GCN4，它是GAAC（一般氨基酸控制）途径的主要效应器，负责激活氨基酸生物合成和转运基因的转录[19,20]. 在哺乳动物中，控制对氨基酸饥饿的转录反应的GCN4同源基因ATF4（激活转录因子4）也同样通过翻译去表达而稳定。
导致GCN2激活的条件
理论上，任何不带电的tRNA都可以结合GCN2的HisRS样结构域。在酵母中，一些导致不带电tRNA积累的条件已经被实验验证可以激活GCN2。这些条件包括氨基酸耗竭、氨酰-tRNA合成酶基因突变或化学抑制，导致组氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸和BCAA（支链氨基酸）亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的tRNA积累[17]. 有趣的是，剥夺一个氨基酸也会导致非同源tRNA的脱乙酰化。例如，营养缺陷酵母的亮氨酸饥饿导致除亮氨酸tRNA外，未带电的丝氨酸和苏氨酸tRNA的积累[21].
在哺乳动物中，当摄入缺乏亮氨酸、组氨酸、色氨酸或赖氨酸等EAA的食物时，GCN2可以在大脑和肝脏（但显然不是肾脏）中迅速激活[22–24]. GCN2也可以通过非饮食性氨基酸消耗被激活[25]. 例如，在创伤或脓毒症等急性应激的情况下，NOS（NO合成酶）产生的NO（一氧化氮）增加会迅速耗尽血液中有条件的EAA精氨酸。色氨酸分解代谢酶IDO（吲哚胺2,3-双加氧酶）局部耗尽胎盘中的EAA色氨酸可使T细胞失能，否则可能对胎儿产生反应。这种有目的的免疫抑制依赖于T细胞中GCN2的表达[26]. 其他氨基酸稳定酶，如天冬酰胺酶，已被联合用作治疗血源性癌症的化疗药物；小鼠对这种药物的反应依赖于GCN2[27]. 模拟氨基酸饥饿也可以通过阻断tRNAs与其同源氨基酸的充电来实现。例如，卤富隆是脯氨酰-tRNA合成酶的竞争性抑制剂[28]可以激活氨基酸饥饿反应在体外和体内[29,30]. 它用于治疗从银屑病（一种自身免疫性疾病）到癌症等多种疾病。
因此，通过饮食、酶或药理学手段消耗必需、非必需或条件性必需氨基酸可以通过增加未带电tRNA物种的浓度和激活GCN2来激活氨基酸饥饿反应。因为GCN2调节对感知到的氨基酸缺乏的适应性变化，缺乏这种蛋白质的小鼠在没有这种挑战的情况下看起来很正常。GCN2反应的主要效应物之一ATF4并非如此，ATF4不仅是对氨基酸不足的反应所必需的，也是对胰岛素的正常合成代谢反应所必需，至少部分通过mTORC[mTOR（哺乳动物TOR）复合物]介导。1[31,32]. 缺乏ATF4的细胞需要过量的非EAA，包括半胱氨酸（或抗氧化剂，如谷胱甘肽或N个-乙酰半胱氨酸）[33]、和ATF4基因敲除小鼠有多种发育异常，并且比对照鼠小[34].
GCN2依赖性氨基酸饥饿反应的特异性
GCN2是四种激酶家族中的一种，它们共享一个共同的靶点Ser51翻译起始因子eIF2α。除了氨基酸缺乏外，葡萄糖缺乏和紫外线照射也能激活GCN2[35]. 其他三种eIF2α激酶在不同组织中被不同的信号激活，从红细胞的血红素缺乏[HRI（血红素调节的eIF2α激酶）]到胰腺β细胞的内质网应激{PERK[PKR（双链RNA依赖性蛋白激酶]样内质网激酶}各种组织中的感染或代谢应激（PKR）。氨基酸饥饿时GCN2介导的eIF2α磷酸化对ATF4等靶点的整体翻译抑制和翻译去抑制并不是唯一的。尽管如此，对适当刺激的每种反应都保持一定的特异性，这可能是额外的、独特的靶点的结果[36]. 例如，PKR除eIF2α外还有其他直接靶点，包括蛋白磷酸酶2A[37]. 虽然GCN2除了eIF2α外没有已知的直接靶点，但细胞暴露于紫外线后，DNA-PK（DNA-dependent protein kinase，脱氧核糖核酸依赖性蛋白激酶）可以以GCN2依赖的方式磷酸化[38].
感知氨基酸充足性：TOR信号传导途径的作用
通过TOR整合氨基酸、能量和生长因子信号
我们目前对细胞感知特定氨基酸存在而非缺失的能力的理解是基于涉及TOR丝氨酸/苏氨酸激酶的信号转导级联的遗传和药理学扰动。TOR最著名的是控制细胞大小和增殖，以响应充足的能量、营养素和生长因子的存在。TOR最初被确定为生长抑制细菌复合物雷帕霉素的细胞靶点，从酵母到人类都是保守的。酵母有两种TOR亚型：TOR1和TOR2，它们的功能不同。哺乳动物细胞有一个单一的TOR激酶mTOR，它存在于两个结构和功能不同的多蛋白复合物中：mTORC1和mTORC2。mTORC1被雷帕霉素急性抑制，对营养素水平敏感，而mTORC2既不容易对营养素敏感，也不被雷帕霉素急性抑制[39].
mTORC1的激酶活性受其与Ras相关GTPase Rheb（脑中富含Ras同源物）的关联调节。在其GTP结合形式中，Rheb直接激活mTORC1。Rheb特异性GAP（GTPase激活蛋白）是TSC（结节性硬化症复合物）2蛋白，其功能是与其结合伙伴TSC1和TBC1D7的异源三聚体[40,41]. TSC1–TSC2–TBC1D7复合物是mTORC1信号传导的关键负调控因子，涉及其大多数上游调控因子，如生长因子、胰岛素和能量水平[42]. mTORC1信号传导最具特征的下游效应器包括4E-BP1和4E-BP2（eIF4E-Binding蛋白1和2），以及p70核糖体蛋白S6K1和S6K2（S6激酶1和2中）。这些蛋白质被mTORC1直接磷酸化，因此通常用作TOR活性的标记[43].
选择氨基酸调节TORC1信号
氨基酸水平调节蛋白质合成和自噬蛋白质分解。支持mTORC1在这种调节中作用的证据来自细胞培养研究，其中mTORC1-底物S6K和4E-BP的磷酸化与翻译控制和氨基酸刺激时自噬的抑制有关[44–48]. 在大鼠脂肪细胞中，向培养基中添加氨基酸会刺激S6K磷酸化，这对雷帕霉素治疗很敏感[46]. 在CHO（中国仓鼠卵巢）细胞中，氨基酸的退出导致S6K和4E-BP1的快速去磷酸化，并消除生长因子刺激S6K活性的能力。重新添加缺乏亮氨酸或精氨酸的单一氨基酸缺失混合物分别使S6K活性降低90%或70%[45]. 有趣的是，单独重新添加亮氨酸或精氨酸都无法刺激S6K活性。在不同环境和细胞类型下进行的类似研究，包括H4IIE肝癌、L6肌肉和胰腺β细胞，揭示了有关单个氨基酸对TOR活性调节特性的重要细节。所有人都同意亮氨酸的突出作用[47,49–51]. 然而，在某些情况下，精氨酸刺激S6K活性[52]而在其他BCAA中（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）在刺激4E-BP1磷酸化方面具有相似的效力[47]. 非EAA谷氨酰胺也可以调节亮氨酸和精氨酸刺激的mTORC1信号，尽管在不同的细胞类型中方向不同。在大鼠肠上皮细胞和肌源性C2C12细胞中，谷氨酰胺分别拮抗精氨酸和亮氨酸介导的mTORC1激活[52–54]. 在分离的大鼠肝细胞中，亮氨酸和谷氨酰胺可增加mTORC1信号[50]. 在HeLa细胞中，谷氨酰胺和亮氨酸之间的相互作用被归因于由SLC7A5（溶质载体家族7成员5）/SLC3A2（溶质载体家族3成员2）组成的异二聚双向氨基酸反转运蛋白，其调节谷氨酰胺的同时流出和亮氨酸和其他EAA的内流[55]. 有趣的是，在之前对多种细胞类型进行的一项研究中，发现亮氨酸和谷氨酰胺通过增强谷氨酰胺水解和2-酮戊二酸（α-酮戊二酸酯）的产生而协同激活mTORC1信号[56].
在酵母营养缺陷型中，缺失亮氨酸（以及程度较低的赖氨酸和组氨酸）可逆地抑制Sch9（S6K的酵母同源物）的TORC1依赖性磷酸化。环己酰胺对蛋白质合成的抑制导致细胞内游离氨基酸的积累，亮氨酸的积累多于其他氨基酸，并增加Sch9磷酸化[57]. 总之，这些观察结果与亮氨酸在TOR激活中的首要地位跨越进化边界是一致的。
桥接亮氨酸传感和TOR激活之间的间隙
与GCN2途径不同，对TOR激活的氨基酸感应许可性直接负责的最上游机制，甚至是发生这种情况的亚细胞隔室，仍未得到解决。TOR本身似乎不像GCN2那样结合氨基酸或类似tRNAs的替代物。许多候选物被提议作为氨基酸激活TOR的中间产物。一些初步研究表明TSC1/TSC2在氨基酸传感中发挥作用。然而，芽殖酵母不含TSC蛋白，哺乳动物TSC1或TSC2-null细胞对氨基酸提取仍然敏感，这表明氨基酸独立于TSC1/TSC2向mTORC1发出信号[40,58]. hVps34（人类空泡蛋白排序34）也被提议参与氨基酸传感。这种III类PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶）通过氨基酸参与mTORC1的调节，可能通过其对囊泡运输的影响和/或通过生成激活mTORC2所需的膜室[59,60].
两个独立的小组使用互补的生物化学和遗传学方法表明，小GTPase的Rag家族是mTORC1检测氨基酸所必需的[61,62]. Rag GTPases是酵母Gtr1p和Gtr2p GTPases的同源物，作为专性异二聚体发挥作用，调节Gap1氨基酸通透酶和微自噬。Rags在mTORC1信号传导及其对细胞生长的调节中的关键作用进一步被证明体内中的实验果蝇属其中，组成活性RagA导致细胞和翅膀尺寸增加的苍蝇，而显性阴性RagA则导致翅膀尺寸减小的苍蝇[62]. 哺乳动物Rags也存在于具有一个Gtr1p样（RagA或RagB）和一个Gtr2p样（RagC或RagD）伴侣的异二聚体中[63]. 与Rheb GTPase不同，纯化的Rag GTPase不能刺激mTORC1激酶活性在体外[62].
相反，Rag介导的mTORC1激活涉及复合物向溶酶体外膜的募集，在溶酶体外膜中，mTORC2可以与其激活物Rheb相互作用[61,64]. Rag异二聚体通过称为“Ragulator”的蛋白质复合物固定在溶酶体膜上[64,65]并被氨基酸激活。以GTP结合形式存在的RagA/B与以GDP结合形式出现的RagC/D构成活性异二聚体，其通过与Raptor（mTOR的调节相关蛋白）的相互作用将mTORC1招募到溶酶体膜。Ragulator复合物在功能上与酵母EGO复合物相似，因为它与Gtr1p和Gtr2p相互作用，并在液泡膜上调节向TOR发送的氨基酸信号[57,64]. 因此，mTORC1复合物的空间调控已成为氨基酸介导控制的一个重要方面[66].
溶酶体/液泡是蛋白质降解和氨基酸循环的主要场所，含有高浓度的游离氨基酸。基于mTORC1在溶酶体膜细胞质表面的定位和激活，提出了相关的氨基酸感应机制，以感应溶酶体而非细胞质游离氨基酸池[64]. 一果蝇属针对可能参与向TOR发送氨基酸信号的溶酶体成分的siRNA（小干扰RNA）筛选揭示了V-ATP酶（空泡ATP酶）的需求，这在哺乳动物细胞中得到了证实[67]. 虽然V-ATP酶的ATP酶活性是氨基酸允许信号传递所必需的，但V-ATP酶在细胞质和溶酶体之间的氨基酸运输中不起作用。然而，V-ATPase似乎在Rag-Ragulator相互作用的上游发挥作用，在这种相互作用中，氨基酸刺激五聚体Ragulatorcomplex对RagA和RagB的GEF（鸟嘌呤核苷酸交换因子）活性[68]. 为了进一步支持溶酶体游离氨基酸库的重要性，用放射性标记的氨基酸刺激氨基酸保护细胞，使其快速出现在溶酶体中[67].
从表面上看，这种以溶酶体为中心而非以细胞质为中心的氨基酸传感观点似乎与先前的研究相矛盾，该研究将亮氨酸-tRNA合成酶确定为负责mTORC1激活的细胞内亮氨酸传感器[69]. 针对亮氨酸-tRNA合成酶的siRNA使HEK（人类胚胎肾）-293T细胞无法磷酸化S6K，以响应亮氨酸或异亮氨酸的提取和再刺激。与亮氨酸允许的mTORC1激活的要求一致，亮氨酸-tRNA合成酶也定位于溶酶体膜的细胞质表面，与Rag GTPase相互作用，并具有针对RagD的GAP活性，在亮氨酸存在下促进活性GDP-结合形式。其刺激mTORC1的能力依赖于亮氨酸结合，但不依赖于其对亮氨酸tRNA充电的能力。然而，游离亮氨酸的亚细胞定位，以及其他TOR许可氨基酸（如精氨酸）是否通过类似机制发挥作用，仍有待观察。
GCN2的机制——与基于TOR的翻译控制的比较
mRNA的翻译是细胞中最需要能量的过程之一。因此，它必须与细胞能量和编码氨基酸的可用性相结合。对能量或氨基酸不足的直接反应是抑制翻译。与此同时，细胞增加了与代谢适应有关的特定信息的翻译，例如控制氨基酸生物合成和转运基因表达的转录因子。这个过程被称为平移去压制。正如GCN2和TOR通路通过不同的机制感知氨基酸一样，它们完成翻译抑制和去抑制的方式也不同().
氨基酸传感与平移控制的集成感知细胞内氨基酸涉及两种信号转导机制：GCN2感测许多氨基酸的缺失，TOR通路感测特定氨基酸的存在。两者都通过不同的机制抑制一般翻译和取消特定信息的翻译。
GCN2的转化调节
翻译起始发生在AUG起始密码子与Met-tRNA配对时我遇见（引发剂蛋氨酸-tRNA），与eIF2和GTP一起是所谓三元复合物的一部分。随后水解eIF2结合的GTP，并从43S核糖体中释放eIF2-GDP。GCN2对eIF2α亚基的磷酸化抑制了eIF2B对GDP/GTP的交换，降低了三元复合物的可用性，从而抑制了大多数mRNA翻译的启动。
然而，一些mRNAs包含短上游ORF（开放阅读框）或µORF（微ORF），它们根据eIF2α磷酸化状态影响下游全长ORF的翻译。在µORF翻译之后重新启动翻译需要三元复合体的重新结合。这取决于三元复合物的浓度（以及eIF2α磷酸化状态）和到下一个AUG密码子的扫描距离/时间。在到达下一个AUG起始密码子之前，增加µORF之间的距离会增加三元络合物结合的机会[70]. 在非饥饿条件下，在第一个µORF后重新启动翻译相对有效，降低了下游全长ORF翻译的机会。在氨基酸保护条件下，第一个µORF后的重新启动效率较低，增加了核糖体扫描过后续µORFs并在全长ORF下游重新启动翻译的可能性。因此，µORF之间的距离和核糖体再启动的时间是mRNA翻译去表达的关键因素，例如GCN4号机组细胞内氨基酸饥饿时。ATF4通过类似机制稳定[71]这表明从酵母到哺乳动物细胞的这种简单而优雅的翻译控制机制得到了保护。
mTOR的翻译调控
mTORC1途径通过磷酸化和抑制cap依赖性mRNA翻译阻遏物4E-BP1最直接地控制蛋白质合成。大多数细胞mRNA的翻译是通过这种常见机制启动的，包括在5′7-甲基-GTP帽上组装eIF4F（包括eIF4E、eIF4G和eIF4A）。eIF4F是在mRNA上装载小核糖体亚单位所必需的。4E-BP通过抑制eIF4F复合物的形成来抑制翻译[72]. mTORC1对4E-BP的磷酸化导致其与eIF4E分离，促进cap依赖性翻译[40]. 雷帕霉素或更有效的抑制剂Torin 1对mTORC1的急性抑制分别使蛋白质合成减少约30%或60%，而不影响eIF2α磷酸化状态[25]. Torin 1抑制几乎所有（99.8%）细胞mRNA的翻译，但对5′-UTR中含有5′TOP（末端寡嘧啶）基序的mRNA的抑制程度最大。重要的是，这类mRNA编码所有核糖体蛋白和主要翻译因子，因此影响细胞的蛋白质合成能力。Torin-1介导的翻译抑制需要4E-BP，并在缺乏这些蛋白的细胞中丢失[25].
mTORC1还通过S6K磷酸化间接调节翻译。Thr上的磷酸化389向核糖体蛋白S6激活S6K，核糖体蛋白质S6是40S核糖体的一个组成部分，对快速增殖细胞的翻译至关重要。它还磷酸化许多其他下游靶点，包括eIF4B、eEF2K（真核翻译延伸因子2激酶）和SKAR[72]. S6K靶点的磷酸化可以通过多种直接和间接机制促进翻译，包括调节eIF4B募集、抑制PDCD4（程序性细胞死亡蛋白4）介导的eIF4A抑制、通过SKAR对一些mRNA信息的依赖性翻译以及核糖体生物发生的调节[73,74]. 氨基酸调节S6K和4E-BPs磷酸化的能力已在先前的研究中得到证实[47].
尽管mTORC1抑制抑制cap依赖性翻译，但它也选择性地抑制不依赖cap结合进入核糖体的mRNA的翻译。从概念上讲，这与GCN2激活后的平移去抑制类似。然而，与µORF不同的是，它依赖于5′-UTR中的IRES（内部核糖体进入位点）进行cap-independent核糖体募集。含有IRES的mRNA不仅对Torin 1抑制mTORC1具有抗性，而且事实上在这种条件下翻译效率更高[25]. 含有IRES的mRNA通常参与应激反应，例如NRF2（NF-E2-related factor 2），它是氧化/亲电应激第二阶段反应中基因的主要转录调控因子。尽管由于IRES依赖机制导致整体蛋白质合成减弱，但NRF2在氧化应激期间翻译上调[75,76]. 然而，NRF2是否在氨基酸饥饿或mTORC1抑制时翻译性去表达尚待阐明。
蛋白质缺乏预计会同时抑制mTOR和激活GCN2。当mRNA cap-binding和翻译起始分别被mTORC1阻遏和GCN2激活所抑制时，如何才能发生有效的翻译去表达？一种可能性是受GCN2/eIF2α控制的mRNA缺乏TOP基序，限制了mTORC1/4E-BP抑制对cap-binding的影响。另一种可能性是，含有IRES的mRNA也含有µORF；CAT1（阳离子氨基酸转运体1）就是这种mRNA的一个例子[77]. 尽管eIF2α磷酸化，IRES介导的翻译去表达也可能发生。例如，XIAP（X连锁凋亡抑制因子）的翻译通过依赖于eIF5B的eIF2α非依赖性翻译启动机制进行[78]. 因此，翻译去抑制可能取决于特定5′-UTR内的特征，以及GCN2和TOR活性的状态。
通过GCN2和TOR协调氨基酸饥饿反应
为什么在真核生物中单独的氨基酸感应途径会一起进化？他们是多余的还是各自扮演不同的角色？两者之间的联系是什么？通过TOR途径的氨基酸传感可能主要是为了协调有关充足营养素（包括氨基酸）、能量和其他有利于生长的环境条件的信息。亮氨酸和其他BCAA富含多种蛋白质。在哺乳动物中，它们也是唯一一种游离氨基酸，饭后外周血中的游离氨基酸含量与饮食中的含量成比例增加（其余17种氨基酸保留在肠道和肝脏中，并以受控方式释放）[79]. BCAA的这些质量可能有利于作为所有氨基酸可用性的替代标记。
基于GCN2的单个氨基酸缺陷传感可能因不同原因而发展。饮食中氨基酸缺乏是常见的，必须迅速检测，以避免从生长减慢到脂肪肝等负面影响[80]. 氨基酸缺乏的蛋白质来源包括大米（EAA赖氨酸含量低）、酪蛋白（色氨酸和蛋氨酸限制）和明胶（完全缺乏色氨酸）。针对单个氨基酸代谢途径的异种抗代谢产物（例如tRNA合成酶抑制剂）也可能在自然界广泛存在。有趣的是，酵母可以生成全部20种编码氨基酸，因此当氨基酸缺失时（例如在最小生长介质中），酵母不会激活GAAC反应[81]. 然而，当个别氨基酸不足或存在tRNA合成酶抑制剂时，它们确实会激活反应。因此，与基于TOR的反应相比，基于GCN2的GAAC反应可能在不同的选择压力下进化，尽管两者都能优化生长潜力并优先考虑代谢需求以适应环境条件。
通过GCN2和TOR对氨基酸缺乏的反应是否协调？在酵母中，GCN4翻译在雷帕霉素以GCN2和TOR1依赖方式抑制TOR后被解除[82]. 从机制上讲，TOR抑制可能减少GCN2的抑制性磷酸化，从而促进eIF2α磷酸化和GCN4翻译去抑制。GCN4也是雷帕霉素抑制TOR的转录反应的主要效应器，其规模相当于标准转录激活物和TOR底物GLN3[83,84]. GCN4和GLN3共同调控的基因包括那些参与氮同化、氨基酸转运、氨基酸生物合成和其他转录激活物的基因。
哺乳动物细胞培养和动物模型中也存在GCN2和mTOR之间的相互作用，尽管相互作用的方向似乎与酵母不同。在人类淋巴细胞白血病细胞系中，用L-天冬酰胺酶（一种在培养基中降解天冬酰胺并激活GCN2的酶）处理，以剂量依赖的方式抑制其靶点S6K和4E-BP1的mTORC1磷酸化[85]. 同样，暴露于各种选择性抑制特异性tRNA负载的氨基酸醇（包括L-组氨酸醇、L-亮氨酸醇、L-苯丙氨酸醇和L-蛋氨酸醇）的人T淋巴细胞中S6K活性降低[86]. 这两项研究都表明GCN2和mTORC1信号之间存在串扰，未带电的tRNA启动信号转导的变化。
小鼠的遗传证据也与mTORC1阻遏上游发生的GCN2激活相一致。为了应对饮食中的亮氨酸缺乏或天冬酰胺酶治疗，肝脏和胰腺中靶向S6K和4E-BP1的mTORC1磷酸化减少，这取决于GCN2激酶[24,27]. 通过胰岛素受体磷酸化的增加，亮氨酸缺乏的饮食也改善了肝脏中的胰岛素信号传导，通过胰岛素耐受测试，改善了全身胰岛素敏感性[87]. 然而，在缺乏亮氨酸饮食的GCN2基因敲除小鼠中，肝脏中的mTOR信号增加，胰岛素敏感性的改善消失。有趣的是，在缺乏亮氨酸的饮食中，GCN2基因敲除小鼠也会因SREBP（甾醇调节元件结合蛋白）1c依赖性脂肪生成基因的表达增加而发生肝脂肪变性，包括Fasn公司（脂肪酸合成酶），载脂蛋白C4（载脂蛋白C-IV）和G6pd公司（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶），在肝脏中受mTORC1控制。这表明一种模型，在该模型中，未能抑制mTORC1会导致SREPB1c靶点的不适当激活[88,89]. 该模型潜在的复杂性在于，亮氨酸剥夺本身被预测会通过GCN2依赖机制降低mTORC1活性。尽管如此，这些发现与通过药理或饮食方式激活GCN2可以抑制mTORC1活性的模型一致。
GCN2通过什么机制抑制哺乳动物中的mTORC1？三个ATF4转录靶标可能有助于降低GCN2激活下游的mTORC1信号传导。GADD34（生长抑制和DNA-损伤诱导蛋白34）是一种磷酸酶，可清除TSC2上的抑制性磷酸盐，从而抑制mTORC1，同时降低GCN2反应，从而清除Ser上的磷酸盐51eIF2α的[90]. 4E-BP1型[91]和TSC激活物/mTORC1阻遏物REDD1（在发育和DNA损伤反应中调节1）[92]在内质网应激时，ATF4也可以在转录水平上调mTORC1活性，尽管其在GCN2磷酸化eIF2α后影响mTORC2活性的能力尚未得到证实[27].
氨基酸传感在DR益处中的作用
膳食蛋白质/氨基酸调节和寿命
自20世纪30年代发现减少食物摄入可以延长实验啮齿动物的寿命以来，DR一直与衰老研究密切相关[1]. 今天，我们知道DR的益处存在于多种生物中，并且在自然界具有多效性。这些益处包括增强新陈代谢适应能力和提高对多种形式急性应激的抵抗力，包括热休克和外科缺血/再灌注损伤。尽管如此，对多种模式生物的寿命延长研究最多，也可能是对其多效性益处的最好理解。
经典地说，DR被描述为食物摄入减少而没有营养不良。DR不是一种单一的干预措施，但它相当松散地描述了在饮食组成和食物摄入时间方面广泛存在的各种干预措施[93]. 尽管有许多研究旨在剖析DR的营养基础，但与限制特定的大量营养素（如蛋白质）相比，总热量摄入减少的相对贡献尚未达成共识[4].
在酵母中，除了删除TOR1或Sch9、抑制谷氨酰胺合成酶和雷帕霉素处理外，还可以通过限制培养基中的天冬酰胺、谷氨酸或蛋氨酸来延长时间寿命[94]. 不幸的是，蠕虫是另一种特征鲜明的模式生物，其长寿和DR的遗传特征尤为突出，缺乏净化饮食和饥饿能够延长成年人的寿命，这使得这些问题难以解决。
在果蝇中，通过滴定蛋白质的唯一来源酵母提取物来减少热量，比等热量减少蔗糖提供更大的寿命延长[4]. 在以限制性蔗糖/酵母为基础的优化长寿饮食中添加回纯化的EAA会缩短寿命，而添加回EAA减去蛋氨酸（或较低程度的色氨酸）不会延长寿命[5]. 也许最出乎意料的是，在DR方案的基础上单独添加蛋氨酸（而不是其他单独的EAA）可以消除DR的一个众所周知的负面后果，即降低生育率。虽然胰岛素样肽信号减少与长寿有关[5]，在DR和EAA加回条件下，GCN2或TOR的状态仍有待报告。
在啮齿类动物中，许多研究报告了饮食蛋白质限制和DR可以适度延长寿命[95]. 然而，由于蛋白质和碳水化合物很容易相互转化，DR和蛋白质限制性研究的解释都很复杂体内另一种不同的方法是减少个体膳食EAA，即色氨酸和蛋氨酸。目前尚不清楚为什么只有这两种动物在啮齿类动物身上进行了长寿测试。就色氨酸而言，有证据表明，至少一部分受色氨酸限制的大鼠的最大寿命延长，衰老相关表型延迟[7,96]. 这些研究中潜在的机制假说涉及到色氨酸下游代谢产物5-羟色胺的减少。同样，蛋氨酸限制已被证明可以延长雄性大鼠和小鼠的寿命[6,8].
有趣的是，色氨酸和蛋氨酸是酪蛋白中含量最少的两种EAA（按重量计），酪蛋白是一种常用于实验啮齿类动物的纯净饮食中的蛋白质。因此，使用酪蛋白作为唯一蛋白质来源的DR方案，在一定程度上受到限制，对这两种EAA来说将变得有限。事实上，DR和单独的蛋氨酸限制有许多重叠的表型，包括减少肥胖、延长最大寿命、增加肝脏对乙酰氨基酚毒性的抵抗力、降低胰岛素和IGF1（胰岛素生长因子1）水平以及降低甲状腺激素[8]. 尽管如此，也存在差异，未来的研究将有必要探讨每种机制的益处是从根本上不同的还是重叠的机制中获得的。
据我们所知，其他氨基酸限制饮食尚未进行延长寿命的测试，但已经证明可以带来许多其他益处。例如，蛋氨酸限制通过改变脂肪生成/脂肪分解平衡，有助于肥胖抵抗[97]，缺亮氨酸可提高胰岛素敏感性[87]色氨酸缺乏可保护肾脏和肝脏免受手术性缺血/再灌注损伤[29]. 缺乏GCN2的小鼠没有后两种益处。
GCN2和TOR在蛋白质/氨基酸限制性益处中的作用
TOR和/或GCN2信号转导途径在蛋白质或特定氨基酸限制下调节寿命、代谢适应性和抗应激性方面发挥什么作用？有充分证据表明，通过基因或药物操作减少TOR信号可以延长多种生物体的寿命。例如，TOR1的缺失延长了酵母的寿命，雷帕霉素治疗延长了啮齿动物的寿命[98]. 对TOR下游靶点、酵母中的Sch9和啮齿动物中的S6K进行基因消融也可以延长寿命[99,100]. 在苍蝇中，4E-BP在DR时上调，可能有助于核编码线粒体电子传递链成分的翻译去表达[101]. 因为DR可以减少对下游靶点（包括S6K和4E-BP）的TOR信号，这可能是其长寿效应的主要机制().
DR益处中的氨基酸感应途径模型通过饮食或药物干预调节GCN2或TOR通路的活性可以带来益处。并非所有干预都必然带来所有益处。虚线表示间接或假设的影响；实线表示已知或直接影响。在某些情况下，酵母/哺乳动物的基因名称都会分别显示。AMPK，AMP-活化蛋白激酶。
除了GCN2在短期色氨酸缺乏导致的外科应激抵抗中的重要作用外[29]在DR或长寿文献中，很少有关于这种氨基酸复制感应激酶的潜在作用的文献。鉴于啮齿类动物的氨基酸限制或苍蝇的氨基酸不平衡导致寿命延长的既定模型，再加上数据表明GCN2激活在氨基酸缺乏时抑制mTOR活性的能力，这可能令人惊讶。可能是哺乳动物eIF2α激酶的冗余，以及mTOR抑制的多条额外途径，可能会在许多环境中消除GCN2的特定遗传需求。尽管如此，通过饮食或抗代谢途径激活GCN2似乎是未来研究的一个富有成效的领域，包括转化控制在下游益处中的作用().
在酵母中，GCN4的稳定与时间和复制寿命的延长有关[102,103]. 在复制寿命模型中，通过敲除大量60S核糖体亚基中的任何一个或用小分子抑制60S亚基的生物发生来延长寿命[102]. 通过减少60S亚单位，翻译起始变得低效，模拟了GCN2激活和eIF2α磷酸化对下游GCN4稳定的影响。因此，GCN4的转录重编程可能在延长寿命中发挥作用，无论它是否在GCN2激活或其他过程中稳定。
除了翻译控制外，GCN2和TOR还控制许多其他过程，这些过程也可能有助于DR的益处，包括自噬、能量代谢、免疫功能和食物摄入。自噬是一种适应性过程，它提供生物物质（氨基酸和脂质）来维持合成代谢过程[104]在营养物质耗尽的条件下，包括DR.mTORC1，通过磷酸化抑制ULK1复合物来负向调节自噬[43]. 在酵母中，氨基酸耗尽时需要GCN2和GCN4来诱导自噬[105,106]. DR还导致至少部分由mTORC1调节的代谢途径发生变化，包括脂肪酸合成、糖酵解和通过转录因子HIF1α（低氧诱导因子1α）和SREBP的磷酸戊糖途径[89,107]. GCN2也会影响脂肪代谢。除了激活氨基酸生物合成和运输外，GCN2还需要抑制亮氨酸缺乏时肝脏中的脂肪酸合成[88]. 尽管GCN2的这种特殊功能独立于ATF4，但该转录因子在GCN2依赖效应中的更广泛作用仍有待探索。
免疫功能，包括自身免疫，对多细胞生物的寿命和衰老相关疾病有重大影响。在局部色氨酸被色氨酸-钙化酶IDO消耗后激活GCN2是减少T细胞增殖和诱导对脾内凋亡细胞等非预期靶点耐受的一种策略[26]或异基因胎儿。脯氨酸-tRNA合成酶抑制剂小分子卤富隆激活氨基酸饥饿反应[28]，防止炎症Th17细胞分化[30]. 雷帕霉素对mTOR的抑制也可以通过抑制T细胞增殖而诱导耐受，但在先天免疫激活的情况下却具有自相矛盾的促炎作用[108,109].
最后，GCN2和mTOR都可以通过不同的机制参与对食物摄入的行为控制。亮氨酸的中枢给药激活下丘脑mTOR并减少食物摄入[110]. 缺乏一种或多种EAA的饮食会导致对集中在不同大脑区域APC（前梨状皮层）的食物摄入的厌恶[111]. 当饮食中氨基酸缺乏或立体定向注射竞争tRNA合成酶的氨基酸醇衍生物时，GCN2在APC中迅速激活，导致tRNA不带电积累[三,23]. 尽管如此，缺乏GCN2的小鼠在几天到几周的时间里仍然表现出对不完整饮食的厌恶[24,29,88]这表明了氨基酸剥夺感测的冗余机制。未来的研究将需要阐明厌食（如果有的话）对限制氨基酸摄入的益处的作用。
氨基酸饥饿反应的药理激活剂作为DR模拟物？
DR模拟物可以粗略地定义为模拟DR某些有益方面的干预措施，例如延长寿命、在高脂肪饮食或增强抗应激能力的挑战下维持代谢适应性。二甲双胍和雷帕霉素都能延长啮齿动物的寿命，因此被认为是DR模拟物[98,112] (). Halofuginone是一种脯氨酸-tRNA合成酶抑制剂，通过模拟脯氨酸剥夺来激活氨基酸饥饿反应。与短期EAA剥夺一样，卤富隆能够以依赖GCN2的方式增加对肾缺血/再灌注损伤的抵抗力[29]. 这证明了激活GCN2并刺激氨基酸饥饿反应的化合物可能具有与限制饮食蛋白质/氨基酸类似的益处。尽管如此，由于tRNA合成酶抑制的靶向效应，这种抗代谢产物和其他同类药物是有毒的。更可取的是DR模拟物，它可以直接激活GCN2激酶而不抑制tRNA充电，或者通过mTOR途径选择性地抑制氨基酸感应。我们对氨基酸传感机制的理解可能会提高识别这种化合物在人体中潜在有益用途的可能性。
致谢
我们感谢布伦丹·曼宁（Brendan Manning）、克里斯·海恩（Chris Hine）和米切尔实验室（Mitchell laboratory）的成员在提交文本之前对文本的批判性反馈。
基金
作者的工作部分由美国国立卫生研究院老龄问题研究所（批准号AG036712）、美国糖尿病、消化和肾脏疾病研究所（授权号DK090629）、基因与环境跨学科培训（批准号T32 ES016645）、美国老龄研究联合会（American Federation for Aging Research）资助，埃里森医学基金会和格伦医学研究基金会。
使用的缩写
| 空气污染指数 | 梨状前皮质 |
| ATF4型 | 激活转录因子4 |
| BCAA公司 | 支链氨基酸 |
| 博士 | 饮食限制 |
| 欧洲账户管理局 | 必需氨基酸 |
| 4E-BP公司 | eIF4E-结合蛋白 |
| 电子标签 | 真核起始因子 |
| GAAC公司 | 一般氨基酸控制 |
| 间隙 | GTPase激活蛋白 |
| 全球通信网络 | 一般氨基酸控制不可脱抑制 |
| HisRS公司 | 组氨酸-tRNA合成酶 |
| IDO公司 | 吲哚胺2,3-双加氧酶 |
| 红外线 | 内部核糖体进入位点 |
| mTOR公司 | 雷帕霉素的哺乳动物靶点 |
| mTORC公司 | mTOR复合体 |
| NRF2级 | NF-E2相关因子2 |
| ORF公司 | 开放式阅读框 |
| 微米ORF | 微型ORF |
| 巴基斯坦卢比 | 双链RNA依赖性蛋白激酶 |
| Rheb公司 | 脑中富含Ras同源物 |
| 小干扰RNA | 小干扰RNA |
| S6K系列 | S6激酶 |
| SREBP公司 | 固醇调节八元结合蛋白 |
| 顶部 | 末端寡嘧啶 |
| 任务大纲 | 雷帕霉素靶点 |
| TSC公司 | 结节性硬化综合征 |
| UTR公司 | 非翻译区域 |
| 质子泵 | 液泡ATP酶 |
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