生物化学。作者手稿；PMC 2013年5月29日提供。
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蛋白激酶Cα的C2结构域：用定点荧光和自旋标记法解释膜对接表面†
美国科罗拉多州博尔德科罗拉多大学化学与生物化学系，邮编：80309-0215；西班牙穆尔西亚阿帕塔多·德·科雷奥斯4021，邮编：E30080
‡科罗拉多大学。
§穆尔西亚大学。
- 补充资料
补充数据。
GUID:09A02D7B-4214-46B5-8CCB-08C05B78968F
摘要
C2结构域是一个保守的信号基序，触发Ca细胞膜对接2+-依赖方式，但许多C2域的膜对接表面尚未确定。对于蛋白激酶Cα（PKCα）C2结构域与膜的对接，可以提出两种极端模型。在平行模型中，膜对接表面包括Ca2+结合环和阴离子结合位点β-股3–4，以便β-股线与膜平行。在垂直模型中，对接面定位于Ca2+绑定循环和β-股线的取向垂直于膜表面。本研究利用定点荧光和自旋标记绘制PKCαC2结构域的膜对接表面。单个半胱氨酸残基被设计成散布在蛋白质表面所有区域的18个位置，并用作光谱探针的附着位点。环境敏感的荧光素探针确定了Ca的位置2+激活或膜对接触发可测量的荧光变化。钙2+结合被发现引发了整体构象变化，而膜对接在三个钙标记位置引发了最大的荧光素环境变化2+结合环（CBL），从而将这些环定位到膜对接表面。使用一氧化氮自旋探针进行互补EPR功率饱和测量，以确定每个自旋标记突变体的膜深度参数Φ。在三个位置发现了指示膜插入的阳性膜深度参数，均位于Ca2+结合环：CBL 1上的N189，以及CBL 3上的R249和R252。此外，EPR功率饱和表明，阴离子结合位点附近的五个位置部分受到保护，不会与水性顺磁探针发生碰撞，这表明阴离子结合位点位于或靠近头部组层的表面。荧光和EPR结果表明，Ca2+第一钙和第三钙2+结合环直接插入膜的脂质头部区域，阴离子结合位点位于β-第3-4股位于头部组附近。数据支持一个模型，其中β-股线相对于膜表面向平行方向倾斜。
C2结构域是在许多真核生物信号蛋白中发现的一个保守的膜对接基序。这种普遍存在的信号结构域调节的细胞功能包括：（a）膜蛋白磷酸化，（b）脂质衍生第二信使的产生和降解，（c）囊泡和膜的靶向和融合，（d）Ras超家族的G蛋白信号，以及（e）膜蛋白泛素化(1–三). 虽然几乎没有序列相同性，但不同C2域之间的结构相似性是广泛的。已知结构的所有C2域共享一个典型的四域β-片状反平行三明治结构，包括来自synaptotagmin I C2A（SytIA）的C2域(4,5)synaptotagmin I C2A和C2B（SytIA和SytIB）(6)，磷脂酶Cα（可编程逻辑控制器α) (7,8)，胞浆磷脂酶A2（cPLA2) (9–11)，蛋白激酶CβI（PKCβ一）(12)和蛋白激酶Cα（PKCα）(13,14). 已经描述了两种不同的C2域拓扑，I型和II型，它们在β-链连通性(1,7). 对于两种拓扑的典型C2域，膜对接需要结合多个Ca2+离子到位于基序一端的三个链间环。
迄今为止研究的C2域可分为两种不同的机械类别，其中驱动膜对接的力主要是静电力或疏水力。例如，静电相互作用主导突触蛋白I的C2A结构域和传统PKC亚型α的C2结构域的对接反应，β，或γ而胞浆磷脂酶A的C2结构域2船坞主要通过疏水相互作用(15–22). 磷脂特异性研究支持这一分类，因为使用静电对接机制的结构域需要带负电荷的磷脂头部基团，如磷脂酰丝氨酸（PS），而已知使用疏水机制的结构区对接到中性头部基团（如两性离子磷脂酰胆碱（PC））(21,22). 钙2+结合被认为是通过改变蛋白质表面的静电场来调节膜对接，从而有利于静电对接或允许疏水对接(23). 此外，在至少一些膜结合的C2结构域中2+离子不仅由蛋白质氧直接配位，而且也由脂质头基氧直接配基，因此结合的金属离子位于稳定蛋白质-膜界面的高度特异配位阵列的中心(13,14). 因此，Ca2+结合环通常在两种钙中都起重要作用2+绑扎和膜对接。
最近的研究绘制了cPLA的膜对接位点2和SytIA C2域直接连接到其Ca2+绑定循环。cPLA的定点荧光研究2C2域发现Ca2+连接环负责与膜对接，并建议将其插入膜中(24). cPLA的诱变研究2C2结构域确定Ca上的残基2+结合环是对接所必需的，并且可能涉及到渗透到膜中，而其他残留物在膜上β-不需要绞线(19). cPLA的定点自旋标记和EPR功率饱和研究2C2域发现Ca2+结合环1和3直接与膜相互作用，并以高达15º的深度插入双层(25,26). 类似地，SytIA C2结构域的核磁共振研究检测到磷脂诱导的钙残基化学位移2+绑定循环2和3(27). 一项突变研究发现Ca上的多重正电荷2+结合环对膜对接很重要，这三种钙2+离子是膜对接所必需的(15). 定点色氨酸诱变和荧光猝灭研究已经在第三个Ca中鉴定出两个Phe残基2+SytIA C2结构域的结合环，转化为Trp后插入膜(17). 另一项研究交换了cPLA的关键残基2和SytIA Ca2+结合环，从而赋予cPLA的脂质偏好2C2域到SytIA C2域(28). 总的来说，现有证据表明C2域的膜对接表面通常涉及Ca2+绑定循环。
传统PKC蛋白保守C2结构域的膜对接表面尚未绘制出来，尽管通常认为它包括Ca2+绑定循环。含有两个Ca的配合物中PKCαC2结构域的晶体结构为这些环的参与提供了证据2+离子和PS头群类似物(13). 在这种结构中，PS头部组磷酸盐直接与结合态Ca配位2+并联系Ca2+绑定循环。此外，在另一个裂缝中还发现了一种无机磷酸根离子，这导致了一种假设，即该位点提供了第二个头基结合位点，尽管它位于Ca2+绑定循环(13). PKCαC2结构域的最新晶体结构支持该模型，因为观察到PS头部基团与Ca结合2+结合位点和阴离子结合位点(14).说明了由此提出的PKCαC2结构域的平行对接方向，其中该结构域通过其两个结构域之一与膜接触β-板材，以便β-股线大致平行于膜表面。此平行方向至少允许一个Ca2+结合环和阴离子结合位点直接接触膜的头部区域，并由六种赖氨酸的存在支持β-股(13). 其中四种赖氨酸被提议与PS磷脂头部基团相互作用(14). 发现单个赖氨酸的突变对膜对接几乎没有影响，这可能被认为不利于平行取向，但这一结果并不排除平行模型，因为单个碱基的去除可能不足以阻止对接(29). 平行方向与，其中β-股线与膜没有接触。现有数据无法确定平均方向相对于膜表面是平行、垂直还是中间（倾斜）。
提出了PKCαC2结构域与膜对接的模型。所示为MOLSCRIPT图(43)PKCαC2结构域的晶体结构(13)根据两个不同的假设定向。（A） 该并行模型提出，域的方向是β-股线大致平行于膜，使Ca2+结合位点和晶体磷酸结合位点β-链3–4与脂质头部组相互作用(13). （B） 垂直模型表示相反的极端，其中β-股垂直于膜表面和钙2+只有绑定站点负责对接。
本研究利用位置定向光谱学(30)开始直接绘制PKCαC2域的膜对接面，并解析对接的平行和垂直模型(). 利用定点突变技术，将半胱氨酸残基工程化到散布在蛋白质表面的位置。这些半胱氨酸被用作自旋标记和荧光团的附着位点，并测定了每个半胱氨酸取代、自旋标记附着和荧光团偶联对膜对接亲和力的影响。随后，荧光和EPR光谱研究利用共价偶联的荧光素和氮氧化物探针来识别与膜相互作用的位置。综合结果表明，Ca2+结合环直接插入膜的头部组层，而具有阴离子结合位点的蛋白质表面位于或靠近膜表面，有利于结构域朝平行方向倾斜的模型。
方法和材料
试剂
使用的脂质是1-棕榈酰-2-油酰基-锡-甘油-3-磷酸胆碱（磷脂酰胆碱，PC）和1-棕榈酰-2-油酰基-锡-阿凡提极性脂质中的甘油-3-磷酸丝氨酸（磷脂酰丝氨酸，PS）。使用的荧光笔为N个-[5-（二甲氨基）-萘-1-磺酰基]-1,2-二十六烷基-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺（丹酰-PE，dPE），N个-来自分子探针的（德克萨斯红磺酰基）-1,2-二十六烷基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（德克萨斯红-PE，TRPE）和5-碘代乙酰胺荧光素（5-IAF）。使用的一氧化氮自旋探针为1-氧基-2,2,5,5-四甲基-Δ三-多伦多研究化学品公司的吡咯烷-3-甲基甲硫磺酸盐（MTSSL）镍（II）乙二胺-N个,N个通过加热17 mM EDDA和17 mM Ni（OH）合成了′-二乙酸（NiEDDA）2在水溶液中搅拌至60°C，直到溶液澄清。将透明溶液在室温下培养过夜，然后过滤所得蓝色溶液并在25°C下风干。如前所述，小的单层磷脂囊泡（SUV）是通过使用微尖声波仪（Misonix）以最大功率超声5分钟制备的，而大的单层磷脂微泡（LUV）则是通过在微型萃取器（Avanti Polar Lipid）中的100 nm膜挤压制备的(26,31). 溶液和塑料制品按规定脱钙(32).
蛋白质生产
使用两种不同的双链定点突变方法产生半胱氨酸变体。最初，按照制造商的方案使用Stratagene QuikChange定点突变试剂盒。随后，发现罗氏扩展长模板法更有效，并用于构建大多数突变体。后一过程中使用的酶是罗氏膨胀高保真聚合酶和罗氏膨胀长模板聚合酶的1:1混合物。除聚合酶混合物外，其余步骤遵循罗氏试剂盒中的PCR反应建议。所有诱变性寡核苷酸都包含半胱氨酸密码子以及一个沉默突变以创建限制酶位点(33). 突变质粒最初通过限制性内切酶消化鉴定，并通过DNA测序确认。
半胱氨酸变体的纯化遵循与野生型PKCαC2结构域相同的一般方案(13,22). 简言之，在凝血酶蛋白水解去除His标签并通过第二个镍柱去除游离标签之前，用His标签表达变体并用镍亲和柱分离(22). 使用了两种不同的标记方案。除非另有说明，否则所有步骤均在25°C下进行。在第一个标记方案中，在第二个镍柱之后，将蛋白质储备分为两半，分别用5-IAF和自旋标记进行标记，使用大约100的蛋白质浓度μM和标签的10倍摩尔过量。标记反应在200μM三[2-羧甲基]-膦盐酸盐（TCEP）可减少二硫键二聚体的形成。通过在3 mL Amicon超滤池中重复洗涤，通过连续稀释去除未反应标签（~1 mM），直到计算浓度小于10 nM。在第二个标记方案中，在蛋白质纯化的第一个亲和步骤中，将20 mL细胞裂解液加载到2 mL镍柱上，然后通过添加80μL 37.9 mM自旋标记，然后在25°C下孵育1小时。镍树脂每10-15分钟彻底混合一次，以确保蛋白质和自旋标记完全平衡。洗脱、凝血酶裂解和第二个镍柱的操作与之前相同。通过色氨酸吸收和SDS-PAGE凝胶测定蛋白质浓度和纯度(34,35). 通过在SDS-PAGE凝胶上运行标记的蛋白质并分别在用考马斯亮蓝R250染色之前和之后测量相关带的荧光素荧光与考马斯吸光度的比率来确定标记效率。在基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪上运行自旋标记蛋白，以确定标记效率，并通过在25°C下用5 mM DTT或5 mM TCEP还原20分钟来确认标记的去除。
配体结合分析
在Photon Technology International QM-2000–6SE荧光光谱仪上，在由20 mM组成的标准分析缓冲液中，在25°C下进行平衡荧光实验N个-（2-羟乙基）-哌嗪-N个′-2-乙基磺酸（HEPES），pH 7.4，KOH，100 mM KCl。所有平衡荧光实验的激发和发射狭缝宽度分别为4和8 nm。
为了确定半胱氨酸变体以及荧光素和自旋标记蛋白的膜亲和力，在磷脂滴定中使用荧光共振能量转移（FRET）监测膜对接。对于游离半胱氨酸和自旋标记蛋白，在供体、固有色氨酸和含有受体丹酰-PE的囊泡之间测量FRET。自旋标记C2结构域（0.5μM） 与1 mM EDTA、2 mM Ca预混合2+（净1 mM游离钙2+)在标准分析缓冲液中。通过在25°C下用5 mM DTT将自旋标记蛋白孵育20分钟来生成游离半胱氨酸蛋白，以减少自旋标记Cys二硫键，从而确保标记和未标记样品尽可能相同。随后，对由PC/PS/dPE（72.5%：22.5%：5%）组成的SUV进行滴定，并通过使用激发和发射波长的dPE发射增加来监测蛋白-膜FRETλ前任=284 nm和λ相对长度单位分别=520 nm。从蛋白质数据中减去dPE直接激发产生的荧光。对于荧光素标记的蛋白质，在供体、荧光素探针和含有受体Texas Red-PE的囊泡之间监测FRET。荧光素标签的C2结构域（0.5μM） 与1 mM EDTA、2 mM Ca预混合2+（净1 mM游离钙2+)和标准分析缓冲液中的5 mM二硫苏糖醇（DTT）。对由PC/PS/TRPE（74.3%:24.7%:1%）组成的SUV进行滴定，并使用荧光激发波长和发射波长监测荧光素发射的减少，从而监测蛋白-膜FRETλ前任=492 nm和λ相对长度单位分别为520纳米。为了控制由于光损伤引起的荧光素猝灭，含有标记Ca的单独试管的荧光2+在稀释校正后，从脂肪滴定数据中减去饱和C2结构域。在该分析条件下，膜亲和力几乎与PS摩尔分数无关(22)，表明当膜被C2结构域负载时发生的亲和力变化很小。
所有配体结合数据均采用单独立位点方程进行非线性最小二乘分析(等式1):
式中ΔF类最大值表示计算的最大荧光变化，x个表示总磷脂浓度，以及K（K）D类表示脂质结合的表观宏观平衡解离常数。
配体结合对荧光素发射的影响
测定钙的影响2+以及荧光标记结构域上的膜，添加饱和钙后标记蛋白的荧光发射的变化2+并监测囊泡。具体而言，荧光素标记的结构域（~0.5μM） 在含有1 mM EDTA和5 mM DTT的分析缓冲液中培养。饱和Ca2+（2 mM），然后是SUV（3:1 PC/PS或纯PC；250–500μM） 最后，连续添加过量EDTA（10 mM），每次添加后监测荧光素发射光谱(λ前任=492纳米；λ相对长度单位=505–550纳米）。在没有钙的情况下，相对于载脂蛋白的荧光强度测量荧光变化2+和囊泡。计算百分比变化时，使用518 nm处的最大发射值。减去纯PC膜的荧光变化，以消除非特异性膜对接的影响。
为了更仔细地研究膜对接对荧光素探针的影响，荧光素探头具有两个可滴定基团，可以作为一个单阴离子或二阴离子存在，通过收集激发光谱，在没有和存在囊泡的情况下测定单阴离子/二阴离子的摩尔比(λ前任=400–525纳米；λ相对长度单位=600 nm）和发射光谱(λ前任=437纳米；λ相对长度单位=475–600 nm）。当荧光素探针从水溶液移动到极性较小或阴离子较多的环境时，单阴离子和阴离子之间的平衡向单阴离子转移。根据发射光谱估算了膜对接后单阴离子/双离子摩尔比的变化，使用：
哪里我x个表示相对荧光发射强度x个波长（550 nm处的单阴离子峰和517 nm处的阴离子峰），Ca2+表示添加Ca后的强度比2+，PC/PS表示在饱和Ca下添加膜时的强度比2+，mono表示纯单阴离子的强度比，di表示纯双离子的强度比(36). 该比率变化的范围从零开始延伸（当膜结合状态显示出与游离Ca相同的比率时2+-被占领的蛋白质）统一（当膜结合状态为纯单阴离子时）。
EPR测量
所有EPR谱都是在配备X波段环盖谐振器（Medical Advances）的Bruker ESP300E光谱仪上获得的。对于连续波功率饱和实验，将样品加载到透气TPX毛细血管（Medical Advances）中，并将测量值作为微波功率的函数。实验在25°C的标准分析缓冲液中进行。自旋标记蛋白质（40–100μM） 用饱和钙预先平衡2+（2mM）和挤出的PC/PS（3:1）LUV（36mM总脂质）。实验是在没有或存在顺磁剂的情况下进行的，顺磁剂将根据其与自旋标记的碰撞速率改变共振的弛豫速率和饱和度。所用的三种条件是：（i）氮气、（ii）空气（含环境氧气）和（iii）氮气在10 mM NiEDDA存在下的平衡。以下方程用于拟合数据，以确定P的最佳拟合值1/2，将谐振振幅降低到其不饱和值的一半所需的微波功率(37):
哪里A类是中心（m）的一阶导数峰间振幅1=0）共振，C类是一个比例因子，对是微波功率，以及ε是饱和共振均匀性的度量。在这种情况下，C类,ε、和对1/2是可调整的参数。最适合对1/2然后使用含氧样品的值计算氧碰撞参数（∏氧气)使用：
式中ΔH（H）是中心共振的一阶导数峰-峰线宽。可以为NiEDDA碰撞参数（∏日本经济发展署). 这个对1/2（DPPH）和ΔH（H）（DPPH）值是从α，α′-二苯基固体样品中获得的-β-苦味酸肼（DPPH）(38). 最后，根据碰撞参数，可以计算薄膜深度参数Φ(37):
对于只有一次确定碰撞和深度参数的位置，使用一般误差传播方程计算误差(39).
结果
半胱氨酸突变体的分离
采用定点突变将18个半胱氨酸残基引入PKCα的C2结构域，该结构域不含内源性半胱氨酸。为了最大限度地减少荧光素或自旋标记引起的结构扰动，半胱氨酸取代被放置在侧链β-碳是暴露在晶体结构中的完全溶剂(13). 所选的18个位置跨越C2域曲面的所有区域。变异体表达于大肠杆菌并使用通过凝血酶裂解去除的6X-His标签纯化至同质性。为了引入荧光和EPR的光谱探针，将每个蛋白制剂分成两半，并与5-碘乙酰胺荧光素（5-IAF）或1-氧基-2,2,5,5-四甲基-Δ反应三-吡咯烷-3-甲基甲硫磺酸盐（MTSSL），然后去除未反应的探针。在此，荧光素和自旋标记半胱氨酸侧链，如，分别缩写为F1和S1。除非另有规定，否则将标记的蛋白质储存在20 mM HEPES、pH 7.4和100 mM KCl的25°C标准缓冲液中。
半胱氨酸突变和探针附着对膜亲和力的影响
进行膜对接测量以确定半胱氨酸突变的影响以及两种标记对C2结构域膜亲和力的影响。使用两种不同的荧光共振能量转移（FRET）分析来量化膜亲和力。对于未标记的半胱氨酸和自旋标记的蛋白质，在作为供体的C2结构域的四种固有色氨酸和含有小摩尔分数的作为受体的丹酰化磷脂酰乙醇胺（dPE）的PC/PS/dPE（72.5%:22.5%:5%）囊泡之间测量FRET。对于荧光标记蛋白，在作为供体的蛋白结合荧光素和作为受体的含有少量德克萨斯红磷脂酰乙醇胺（TRPE）的PC/PS/TRPE（74.3%：24.7%：1%）囊泡之间测量FRET。半胱氨酸取代和自旋标记附着对钙膜结合的代表性影响2+-占用的C2域如所示.将膜滴定到含有Ca的样品中2+-饱和C2结构域，FRET信号增加，直到所有蛋白质对接。
半胱氨酸取代、自旋标记（S1）和荧光标记（F1）蛋白质的代表性膜结合滴定。（A） 将由PC/PS/dPE（72.5%：22.5%：5%SUV）组成的膜泡滴定到含有代表性Ca的样品中2+-负载蛋白：野生型（闭合圆）、N206C（开放圆）、N206S1（开放方形）、R252C（开放菱形）或R252S1（打开倒置三角形）。在监测丹磺酰基排放的同时，通过激发Trp来测量蛋白质的内在供体Trp残基和膜的受体丹磺酰PE之间的蛋白质-膜FRET。（B） 将由PC/PS/TRPE（74.3%：24.7%：1%SUV）组成的膜泡滴定到含有代表性荧光素标记Ca的样品中2+-负载蛋白质：K230F1（开环）、N189F1（开方块）或R252F1（开菱形）。通过激发荧光素测量蛋白质结合荧光素和膜结合德克萨斯红PE之间的蛋白质-膜FRET，同时监测FRET导致的排放减少。（A）和（B）的实验条件：25°C；20 mM HEPES，pH 7.4，100 mM KCl，1 mM游离Ca2+, ~0.5μM蛋白。实心曲线表示使用计算的最佳拟合等式1：最适合的表观离解常数(K（K）D类)这些和其他改性蛋白质的获得总结如下使用（A）中的程序确定野生型C2域的（B）中的虚线。
总结了表观膜离解常数，K（K）D类，对于所有修饰的蛋白质。对膜亲和力的影响在某种程度上与所附探针的大小有关。在选择的18个半胱氨酸取代位置中的15个，游离半胱氨酸侧链和自旋标记侧链对膜亲和力的影响相对较小，产生K（K）D类值在原生值的3倍以内。这些小扰动对应于ΔΔ的自由能变化克< 1RT公司在剩余的三个位置，游离半胱氨酸侧链（K165C、H174C和R252C）和自旋标记半胱氨酸支链（K165 S1、H174 S1和R252 S1）将膜亲和力从3倍降低到6倍，对应于ΔΔ克~ 1–2RT公司与较小的中性自旋标记相比，更笨重的阴离子荧光素的耦合通常产生更大的扰动。在18个标记位置中的12个位置，游离半胱氨酸侧链和荧光素标记侧链都产生了3倍于天然的膜亲和力，但在其余6个位置，荧光素附着使膜亲和力降低了3倍以上（M186F1、N189F1、K211F1、R216F1），或使膜亲和力增加了3倍（K181F1、Q280F1）相对于本机。最大的扰动是观察到荧光素标记的蛋白R216F1的亲和力降低了28倍，该蛋白接近Ca2+结合位点，是唯一一个亲和力变化超过6倍的修饰。观察到54个修饰中有53个修饰对亲和力的改变小于6倍，即使其中一个子集必须位于膜对接表面，这与之前的发现一致，即C2结构域的蛋白-膜界面对MTSSL和荧光素探针的扰动远不如典型的蛋白-蛋白界面敏感(24,26). 这种不寻常的可塑性可能源于磷脂调节其位置和构象以适应显著的侧链修饰的能力。扰动的小尺寸表明，修饰的蛋白质通常会以天然的深度和方向与膜对接。
表1
| 突变 | 位置 | 未标记的b条Cys突变体 | 标记为c（c）MTSSL公司 | 标记为d日荧光素 |
|---|
| （野生型） | | (11 ± 1)μM（M） | | |
| K165C型 | β1 | 63 ± 6 | 49 ± 5μM（M） | 12 ± 1μM（M） |
| H174C型 | β2 | 40 ± 4 | 40 ± 3 | 4.5 ± 0.5 |
| K181C型 | β2 | 4.5 ± 0.4 | 8.2 ± 0.7 | 1.7 ± 0.2 |
| M186C型 | β2–β3（CBL1）一 | 24 ± 1 | 25 ± 2 | 60 ± 10 |
| N189C型 | β2–β3（CBL1） | 12 ± 1 | 3.9 ± 0.1 | 60 ± 10 |
| N206C型 | β3–β4 | 12 ± 1 | 11±1 | 5.4 ± 0.2 |
| K211C公路 | β4 | 16 ± 3 | 19±1 | 51 ± 2 |
| R216C型 | β4–β5（CBL2） | 11 ± 1 | 30 ± 6 | 310 ± 20 |
| N224C型 | β5 | 12 ± 1 | 8.6 ± 0.5 | 12.8 ± 0.2 |
| K230摄氏度 | β5–β6 | 16 ± 2 | 16 ± 2 | 7 ± 1 |
| S234C型 | α1 | 9 ± 1 | 7 ± 1 | 4.4 ± 0.7 |
| S241C型 | β6 | 17 ± 2 | 14 ± 2 | 12.6±0.3 |
| 249C兰特 | β6–β7（CBL3） | 29 ± 5 | 17 ± 4 | 26 ± 6 |
| R252C型 | β6–β7（CBL3） | 50 ± 1 | 35±1 | 13.5 ± 0.4 |
| K268C型 | α2 | 11.8±0.8 | 11.0 ± 0.5 | 7.4 ± 0.3 |
| S272C型 | β8 | 9.3 ± 0.6 | 8.8 ± 0.6 | 20 ± 3 |
| Q280C型 | α3 | 12.5 ± 0.9 | 11.0 ± 0.9 | 3.0 ± 0.4 |
| Y286C型 | C端 | 19 ± 1 | 19 ± 1 | 10.5 ± 0.4 |
重点关注至少一种修饰（半胱氨酸取代或探针偶联）使膜亲和力相对于野生型变化3倍以上的九个位置()，在三个Ca上观察到扰动位置密度最高2+绑定环（CBL1、CBL2、CBL3）。五个Ca之一2+结合环位置产生大的28倍亲和力损失（R216F1），而其中三个位置产生3至6倍亲和力损失（M186F1；N189S1和F1；R252C和S1）。相比之下，在Ca以外的其余13个位置2+结合环，只有5个分散在蛋白质表面，修饰后膜亲和力变化高达3-6倍(). 钙的高密度2+干扰膜对接的结合环修饰与先前对其他C2结构域的研究一致，表明这些环不仅结合Ca2+但也使大多数直接的蛋白质膜接触(15,17,19,24–28,40). 然而，Ca2+与PKCαC2结构域结合的膜紧密耦合(22); 因此，钙修饰引起的膜亲和力损失2+结合环原则上可能由钙的损失引起2+亲和力，而不是来自蛋白质-膜界面的直接扰动。在Ca外观察到膜亲和力变化的五个位置2+绑定循环增加了更多的模糊性。由此可见，由表面修饰引发的膜亲和力变化模式并不能最终确定膜对接部位的位置。为了更好地绘制出这个功能关键表面，荧光素和自旋标记蛋白被用于光谱研究，旨在检测钙离子探针环境的变化2+绑扎和膜对接。
钙的荧光分析2+-触发的构象变化
荧光素的荧光强度受到质子化状态的强烈调制，对当地环境条件（包括pH值和介电常数的变化）很敏感(36,41). 识别Ca中涉及的C2域区域2+-触发的构象变化，钙的影响2+在没有膜的情况下测定每种蛋白质的荧光素发射。三种荧光标记蛋白质的代表性结果如所示、和总结了所有18种蛋白质的排放变化。在七个标记位置，Ca2+添加对荧光素发射的影响最小，产生的变化不超过20%（参见). 然而，在9个位置，在Ca上观察到显著的20-40%的荧光素发射减少2+添加（K165F1、H174F1、M186F1、N189F1、N206F1、K230F1、S234F1、K268F1、Y286F1）。钙2+结合对K211F1和R216F1位置的影响最为显著，其中观察到70–90%的荧光素发射增加（参见中的K211F1). 值得注意的是，钙的作用2+与C2域的绑定在大部分域中分布良好。对这些发现最简单的解释是Ca2+-触发的构象变化是全局的，而不是局部的。
钙在代表性蛋白质中触发的荧光素（F1）发射强度变化2+绑扎和膜对接。图中显示了每个荧光标记的载脂蛋白（开环）的荧光发射光谱，以及连续添加饱和钙产生的光谱2+（2 mM，正方形），然后是膜囊泡（3:1 PC/PS SUV，250–500μM总脂质，闭合圆圈），最后过量EDTA（10 mM，开放三角形）。对于每个荧光标记的蛋白质，使用载脂蛋白的发射光谱对生成的其他光谱进行归一化。实验条件：25°C；20 mM HEPES，pH 7.4，100 mM KCl，5 mM DTT，~0.5μM蛋白。钙2+-膜触发荧光素强度变化总结如下用于这些和其他荧光标记蛋白。
表2
| 荧光素标记位点 | 位置 | Δ发射一添加后
| Δ单/双离子b条添加PC/PS后的比率 |
|---|
| 钙2+ | 个人电脑/个人电脑 |
|---|
| K165C型 | β1 | −25 ± 9% | −3 ± 1% | 2.2 ± 0.7% |
| H174C型 | β2 | −22 ± 1% | −1 ± 1% | 2.3 ± 0.1% |
| K181C型 | β2 | −8 ± 2% | −5 ± 3% | 1.2 ± 0.5% |
| M186C型 | β2–β3（CBL1） | −35 ± 5% | −20 ± 3% | 37 ± 4% |
| N189C型 | β2–β3（CBL1） | −43 ± 3% | −23 ± 2% | 45±3% |
| N206C型 | β3–β4 | −29 ± 1% | −22 ± 2% | 17.1±0.3% |
| K211C公路 | β4 | 90 ± 10% | −30 ± 4% | 7.9 ± 0.5% |
| R216C型 | β4–β5（CBL2） | 71 ± 3% | −49 ± 4% | 10 ± 1% |
| N224C型 | β5 | −12 ± 2% | −3 ± 1% | 3 ± 1% |
| K230摄氏度 | β5–β6 | −33 ± 2% | −22 ± 2% | 27 ± 2% |
| S234C型 | α1 | −29 ± 9% | −24 ± 3% | 4±2% |
| S241C型 | β6 | −8 ± 2% | −4 ± 2% | 4.5 ± 0.7% |
| 249C兰特 | β6–β7（CBL3） | −6 ± 1% | −60 ± 10% | 36 ± 2% |
| R252摄氏度 | β6–β7（CBL3） | −5 ± 1% | −67±7% | 37 ± 1% |
| K268C型 | α2 | −24 ± 1% | −2 ± 1% | 0.6 ± 0.2% |
| S272C型 | β8 | −18 ± 2% | −3 ± 1% | 5 ± 1% |
| Q280C型 | α3 | −18 ± 1% | −7 ± 2% | 7 ± 1% |
| Y286C型 | C端 | −36 ± 5% | −15 ± 2% | 4 ± 1% |
膜对接表面的荧光分析
为了识别位于膜对接表面上的标签位置，将膜添加到Ca2+-测定了被占领蛋白及其对荧光素释放的影响。总结了中具有代表性的突变体的结果和整个场景对于九种蛋白质，添加PC/PS囊泡（3:1）的效果最小，改变荧光素发射不超过20%。对于六种蛋白质，观察到中间的荧光素发射减少了20-30%，而对于其余三种蛋白质，检测到超过40%的发射损失。荧光发射强度的降低与探针转移到极性较小或阴离子较多的环境相一致，但不能证明这一点(36). 值得注意的是，三个最大的排放量减少都发生在第二和第三Ca的标签位置2+结合环（R216F1、R249F1、R252F1），表明这些环参与蛋白质-膜对接界面。在第一个Ca上的两个标签位置观察到六个中间排放减少2+结合环（M186F1，N189F1），以及具有阴离子结合位点的蛋白质表面上的四个位置（N206F1，K211F1，K230F1，S234F1）。
当质子化状态改变时，荧光素的激发光谱和发射光谱都会发生特征波长偏移，这些光谱变化为环境变化提供了一种灵敏的检测器。以上说明了与芳香体系相关的两个可滴定基团。在中性pH的水环境中，荧光素主要以阴离子形式存在，而在极性较小或阴离子较多的环境中，单阴离子更为普遍。与单阴离子相比，二阴离子具有不同的激发和发射最大值，以及更高的量子产率(36). 因此，探针与膜的相互作用将平衡点移向单阴离子，从而触发大的光谱偏移。
说明了添加膜对荧光标记Ca的激发和发射光谱的影响2+-被占领的蛋白质。K165F1蛋白无显著影响(，上部），同时观察到R252F1蛋白的特征波长和强度变化(，较低），表明二阴离子转化为单阴离子。对于每个荧光素标记的蛋白质，表示当Ca2+-饱和蛋白质粘附在膜上。比例变化按比例缩放，0%表示膜对接时没有变化，而100%表示荧光素在膜对接时完全转化为单阴离子。表明对接后12个蛋白质的单阴离子/阴离子比率没有显著变化（≤10%）；因此，大多数标记位点都没有与膜发生可检测的相互作用。两种蛋白质在单阴离子/阴离子比率中表现出中间（15-30%）的增加，而四种蛋白质在对接时表现出该比率的大幅增加（35-45%）(，下部）。表现出最大效应的四个荧光素位置局限于第一钙和第三钙2+结合环（M186F1、N189F1、R249F1、R252F1），而在具有阴离子结合位点的蛋白质（N206F1、K230F1）的表面上观察到两种中间效应。这些结果以及上述最大的发射强度变化表明2+结合环支配着膜对接表面，具有阴离子结合位点的蛋白质表面可能与膜发生弱相互作用。然而，荧光素探针可以检测到长距离的构象变化，或者它的大尺寸可以让它从蛋白质表面通过水相投射到膜表面。由此可见，荧光方法可能高估了膜对接表面的面积。因此，使用了一种互补的EPR方法来生成对接表面的独立地图。
荧光素质子化状态的变化由膜对接触发。显示了在膜泡（3:1 PC/PS SUV，250-500μM总脂质）。在添加囊泡之前，将光谱归一化为最大荧光。对于激发光谱，λ相对长度单位=600 nm，对于发射光谱，λ前任=437纳米。单阴离子的存在由470 nm处的激发肩部和550 nm处的发射肩部表示。实验条件：25°C，20 mM HEPES，pH 7.4，100 mM KCl，5 mM DTT，1 mM游离Ca2+, ~0.5μM蛋白。
膜对接表面的EPR分析
为了进一步分析膜对接表面的位置，进行了EPR测量，以确定与膜直接相互作用的位置。该方法分析了与蛋白质耦合的自旋标签与其他两个顺磁性探针碰撞的相对速率：非极性氧分子（O2)主要存在于膜和两性离子NiEDDA络合物中，主要存在于水相中。EPR功率饱和实验如图所示测量O2和NiEDDA碰撞参数∏氧气和∏NiEDDA公司分别用于计算膜深度参数Φ=ln（∏氧气/Π日本经济发展署). 深度参数的正值与膜渗透有关，而负值表示暴露于水溶液中(26,37).
自旋标记（S1）蛋白质的EPR功率饱和以确定溶剂和膜暴露。用饱和钙预先平衡自旋标记蛋白2+和3:1 PC/PS囊泡驱动膜对接。随后，通过在测量中心共振（m1=0）在三种不同条件下：与N平衡2（开放圆圈），与环境O平衡2（开平方），或与N平衡2和NiEDDA（闭合三角形）。实验条件：25°C；20 mM HEPES，pH 7.4，100 mM KCl，2 mM Ca2+，36 mM总脂下3:1 PC/PS LUV，约40–100μM蛋白。
总结了18种蛋白质的功率饱和测量结果，包括它们的O2和NiEDDA碰撞参数及其膜深度参数。测量的∏氧气碰撞参数范围为0.15至0.38，在第一和第三Ca上的位置观察到四个最大值中的三个2+结合环（N189S1、R249S1、R252S1），表明这些环与O的碰撞率很高2来自膜相关池。剩余的大∏氧气在蛋白质（K268S1）相对端的位置观察到该值；此位置可能位于O附近2蛋白质内部的结合位点。∏日本经济发展署碰撞参数范围从0.11到1.76，相差16倍，表明NiEDDA的碰撞率范围比O的更广2.最低的三个∏日本经济发展署在第一个和第三个Ca上的相同三个位置观察到值（0.1到0.32+表现出高∏的结合环氧气数值（N189S1、R249S1、R252S1），提供了强有力的证据，证明这些环路与膜相关，在那里它们与O快速碰撞2并避免与NiEDDA发生碰撞。中间∏NiEDDA公司在第一个和第二个Ca上的两个位置观察到值（0.6到1.02+结合环（M186S1、R216S1）和具有阴离子结合位点的表面上的五个位置（N206S1、K211S1、S234S1、S241S1、Q280S1）。最高∏日本经济发展署值（1.1至1.8）位于其余八个位置，包括阴离子结合位点对面的所有五个位置（K165S1、H174S1、K181S1、N224S1、S272S1）。总之，这些结果表明第一和第三钙2+结合环最深入地渗透到膜中，膜部分地屏蔽了具有阴离子结合位点的表面，使其免受与NiEDDA的碰撞。
表3
| 自旋标签站点 | 位置 | 一Π氧气 | b条Π日本经济发展署 | c（c）Φ |
|---|
| 第165位 | β1 | 0.25 ± 0.04 | 1.49 ± 0.01 | −1.77 ± 0.06 |
| 第174页 | β2 | 0.26 ± 0.04 | 1.76 ± 0.01 | −1.92 ± 0.07 |
| K181C型 | β2 | 0.23 ± 0.06 | 1.13 ± 0.02 | −1.6 ± 0.2 |
| M186C型 | β2–β3（CBL1） | 0.17 ± 0.03 | 0.8 ± 0.1 | −1.6 ± 0.2 |
| N189C型 | β2–β3（CBL1） | 0.38 ± 0.01 | 0.17 ± 0.04 | +0.8 ± 0.2 |
| N206C型 | β3–β4 | 0.19 ± 0.01 | 1.0 ± 0.1 | −1.7 ± 0.1 |
| K211C型 | β4 | 0.17 ± 0.02 | 0.8 ± 0.1 | −1.5 ± 0.3 |
| R216C型 | β4–β5（CBL2） | 0.18 ± 0.04 | 0.84 ± 0.05 | −1.6 ± 0.2 |
| N224C型 | β5 | 0.24±0.04 | 1.20 ± 0.01 | −1.63 ± 0.09 |
| K230摄氏度 | β5–β6 | 0.26±0.04 | 1.3 ± 0.1 | −1.7 ± 0.2 |
| S234C型 | α1 | 0.15 ± 0.06 | 0.88 ± 0.01 | −1.74 ± 0.07 |
| S241C型 | β6 | 0.22 ± 0.07 | 0.76 ± 0.03 | −1.3 ± 0.2 |
| 249C兰特 | β6–β7（CBL3） | 0.30 ± 0.01 | 0.11 ± 0.01 | +1.0 ± 0.1 |
| R252C型 | β6–β7（CBL3） | 0.3 ± 0.1 | 0.3 ± 0.1 | +0.14±0.09 |
| K268C型 | α2 | 0.32 ± 0.09 | 1.68 ± 0.01 | −1.7 ± 0.1 |
| S272C型 | β8 | 0.28 ± 0.03 | 1.71 ± 0.01 | −1.83 ± 0.05 |
| Q280C型 | α3 | 0.2 ± 0.2 | 0.6 ± 0.1 | −1.4 ± 0.3 |
| 第286年 | C端 | 0.26 ± 0.04 | 1.34 ± 0.01 | −1.64 ± 0.09 |
膜深度参数Φ提供了最清晰的直接膜插入画面。仅在第一和第三Ca的相同三个位置观察到Φ的正值2+绑定环（N189S1、R249S1、R252S1）。这些正Φ值都是由于暴露于膜溶解O的增加而产生的2和减少对含水NiEDDA的暴露，是膜渗透的特征。第一和第三Ca中的位置N189S1和R249S12+结合环表现出最大的正Φ值（分别为0.8±0.2和1.0±0.1），因此插入膜最深。将R252S1放置在第三个Ca中2+结合环的Φ值较小，但仍为正值（0.14±0.09），表明该位置更靠近水相。其余15个位置的Φ值均低于−1.2，表明这些位置部分或完全暴露于水溶液中，并且不会显著渗透到膜中。荧光和EPR数据表明，Ca2+结合环作为与钙的主要膜对接部位2+结合环1和3穿透膜的头部组区域。阴离子结合位点β-股线3–4位于头部区域的表面处或附近。
讨论
当Ca2+与PKCα的C2结构域结合，在蛋白质表面检测的18个荧光素标记位置中的11个位置观察到荧光发射变化。因此，钙的结构或静电效应2+结合在很大一部分蛋白质上传递。最简单的解释是Ca2+绑定通过β-股。以前对synaptotagmin I的C2A结构域的研究表明，Ca2+结合只引起Ca内的局部构象变化2+绑定循环(5)表明Ca2+两个域的激活机制可能不同。PKCαC2结构域发现的另一种解释是Ca2+结合通过暴露的侧链和附近溶剂分子的细微重排，触发了蛋白质表面大区域的整体静电变化。荧光素发射对局部静电和pH值高度敏感，可以检测到细微变化。然而，这种长距离静电效应的可能性较小，因为实验是在接近生理强度（100 mM KCl）的离子强度下进行的。因此，Ca2+绑定可能会触发全局构象变化。
跟随Ca2+结合后，活化的PKCαC2结构域停靠在膜上。目前的研究结果对直接接触膜的蛋白质表面区域提出了严格的限制。结合脂质亲和力、荧光和EPR测量结果，提出了PKCαC2结构域的膜对接面和取向模型，如图所示和模型反映了所有直接膜插入都局限于Ca的总体结论2+结合环，使环位置N189、R249和R252穿透膜的头部组层。该模型还提出，具有阴离子结合位点的结构域的表面位于或靠近膜表面(和). 这些约束表明，总的来说，域与β-几乎平行于膜平面定向的线束(,、和). 以下讨论分析了与膜对接深度和方向相关的脂质亲和力、荧光和EPR结果。
膜对接引发的大荧光和EPR效应的位置。所示为MOLSCRIPT(43)PKCαC2畴晶体结构在相对于膜头组和烃层的拟定方向上的带状图。图表显示了18个Cys取代的位置，突出了大的膜亲和力、荧光或EPR变化的位置。（A） 膜亲和效应。半胱氨酸取代、自旋标记附着或荧光素偶联改变膜对接亲和力>3倍的位置以黑色显示；其他位置显示为灰色，几乎没有变化。（B） 荧光素发射效应。荧光素在膜对接时表现出较大的发射损失（>40%）或单阴离子/二阴离子摩尔比（>25%）的较大增益的位置以黑色显示；显示中间发射损失（20-30%）或单阴离子/二阴离子比率增加（15-30%）的位置被画出阴影；其他残留物以灰色显示。（C） EPR功率饱和效应。对于每个自旋标记蛋白，膜深度参数Φ=ln（∏氧气/Π日本经济发展署)根据膜探针O的碰撞速率比确定2和水性探针NiEDDA。Φ值为正值的位置表示膜渗透（Φ>0），以黑色显示；对与NiEDDA（∏）碰撞具有中等防护能力的位置日本经济发展署=0.6–1.0）；其他残留物以灰色显示。
推导了膜结合PKCαC2结构域相对于膜表面的取向。所示为纯脂类模型膜(44,45)孤立的PKCαC2结构域的晶体结构已经对接(13). 由于存在结晶水，膜的头部组层显示出较高的重原子密度，其中一些突出显示（小空间填充分子），而中心碳氢化合物层显示出较低的原子密度。对于蛋白质表面上的每个标记位点，使用INSIGHT II（Biosym Technologies）程序在晶体结构上建模一个一氧化氮自旋标签（球状和棒状，用球体表示氮）。大多数自旋标签都被赋予了g+，克+二面角被认为是最常见的(46)除了那些限制二面角以适应EPR数据的情况（M186S1、N189S1、N206S1、R216S1、K230S1、S234S1、R2、49S1和R252S1）。图中还显示了双结合Ca2+离子（黄色大球体）2+直接接触膜的结合环1和3，以及在链3-4的阴离子结合位点中结合的磷酸根离子（红色）。
C2结构域修饰（半胱氨酸取代、自旋标记或荧光素偶联）引发的膜亲和力变化总结如下这种方法可以控制光谱标记对膜对接的影响，原则上也可以帮助识别对接中涉及的残留物。在中突出显示侧链修饰使膜亲和力改变3倍以上的位置。这些最大的膜亲和力变化发生在散布在蛋白质大多数表面的九个位置上，这表明膜对接涉及一种全局构象变化，变构将遥远的位置耦合到膜对接位置。在三个Ca上观察到扰动位置的最高密度2+结合环，当天然侧链被修饰时，五个测试位置中的四个显示出改变的膜亲和力。然而，剩下的五个扰动位置位于Ca之外2+蛋白质表面不同区域的结合环。因此，尽管膜亲和力效应与三种钙的重要性一致2+在膜对接中的结合环，它们不能最终确定膜对接面的位置。
膜对接的荧光分析结果总结如下这突出了荧光素探针在发射强度和单阴离子/阴离子比方面变化最大的位置。钙上荧光素标记位点的膜对接对发射强度的影响最大2+结合环2和3（R216F1、R249F1和R252F1），其中在对接时观察到强度下降超过40%。在第一钙和第三钙上的标记位置观察到对接对荧光素单阴离子-二阴离子平衡的最大影响2+结合环（M186F1、N189F1、R249F1和R252F1），其中单阴离子/阴离子比率在膜结合后增加超过35%。因此，膜对接引发的最大环境变化都局限于三种钙2+结合环，并且变化方向与荧光素插入到极性较小或阴离子较多的膜环境中一致，在该环境中，发射强度降低，单阴离子/二阴离子比增加。除了局限于钙的巨大影响外2+在具有阴离子结合位点的表面上的四个位置（N206F1、K211F1、K230F1、S234F1）观察到结合环、较小的荧光素发射变化（20–30%）或单阴离子/阴离子比偏移（15–30%）。这些较小的、由膜引发的环境变化可能表明，膜对接表面扩展到Ca以外2+结合环包括阴离子结合位点，或者可能表示变构构象变化从膜对接表面传递到远端位置。关于荧光方法的一个注意事项是，半胱氨酸偶联荧光素探针的尺寸很大，远大于它所取代的任何天然侧链。因此，荧光方法可能会高估膜对接表面的尺寸，只要笨重的疏水荧光素探针能够从溶剂暴露位置延伸到膜表面。因此，用EPR提供的信息补充荧光提供的信息是有用的，特别是因为一氧化氮自旋探针比荧光素探针小得多，干扰也小得多。
EPR方法的结果总结如下，突出显示了膜插入的自旋标记深度参数（Φ）最大的位置。该深度参数由关系式Φ=ln（∏氧气/Π日本经济发展署)，这与自旋标记碰撞与膜溶解氧（∏）的比率有关氧气)与Ni-EDDA（∏）水溶液的自旋标签碰撞日本经济发展署) (26,37). 结果表明，第一和第三Ca上的三个位置2+将结合环插入膜中，而其余位置部分或全部暴露于水溶剂中。具体来说，第一个Ca上的N189S12+结合环和第三Ca上的R249S1和R252S12+结合环表现出较高的氧碰撞速率、较低的Ni-EDDA碰撞速率以及膜穿透的正深度参数特征(). N189S1和R249S1的Φ值（分别为Φ=+0.8±0.2和+1.0±0.1）显著大于R252S1（Φ=+0.14±0.09），表明后者在膜中的埋深较小。通过与先前确定的Φ与膜深度相关的标准曲线进行比较，深度参数Φ可以转换为膜穿透的近似距离(26). 这样的比较表明，自旋标记的N189S1和R249S1侧链插入到与双层碳氢化合物核心的界面处或附近的极性头部组层中，而自旋标记的R252S1侧链条位于靠近水溶剂的极性顶部组层中。然而，应该注意的是，自旋标记侧链的灵活性给这一分析带来了不确定性；因此，深度分配是定性的。剩余的15个位置均显示出高度负的深度参数，表明部分或全部溶剂暴露，但7个位置显示出较低的氧碰撞速率，以及与Ni-EDDA水溶液（M186S1、N206S1、K211S1、R216S1、K234S1、S241S1、Q280S1）碰撞的部分屏蔽。最简单的模型是将这些残基放在膜外但靠近膜，它们位于双层的氧梯度之外，但在空间上受到保护，不会与大型Ni-EDDA络合物发生碰撞。
总的来说，EPR结果提供了强有力的证据，表明只有Ca2+结合环直接穿透膜。在天然C2结构域中，极性和带电荷的N189、R249和R242侧链最有可能与头基层内的极性和阴离子基团相互作用。结果还将阴离子结合位点置于或靠近膜表面，从而使β-如图所示，相对于膜表面的平行方向。建议方向的详细模型如所示这种几乎平行的取向类似于基于脂质头基与蛋白质结合的Ca对接的假设预测的取向2+离子和阴离子结合位点(13,14). 模型表明K230和S234位置的荧光素和自旋标记探针的膜对接效应可能通过与β3–β4级间环，比K230和S234更靠近膜表面。
PKCαC2结构域观察到的近平行膜对接方向与之前观察到的cPLA对接角度有显著不同2C2域，偏离平行方向(19,24,26). 在这两个模型中，三个Ca2+结合环支配着与第一钙和第三钙的膜对接表面2+穿过膜的束缚环。然而，cPLA的渗透2进入膜的C2结构域明显更大，因为其自旋标记侧链的膜深度参数范围高达Φ=+3.1±0.5(26)与迄今为止观察到的PKCαC2结构域的Φ=+1.0±0.1的上限相比。这些在相同条件下测量的对比穿透深度与两个C2域的对比膜对接机制一致(21,22)：cPLA2C2结构域通过与膜芯碳氢化合物区域的疏水相互作用对接，而PKCαC2结构域则与头部区域的负电荷相互作用。此外，解放军2C2结构域缺乏PKCαC2结构域在钙结合环外的第3-4条上所具有的阴离子结合位点。
本研究中观察到PKCαC2结构域的近平行对接方向()留下的可能性是电子如前所述，阴离子结合位点与脂类头基上一种重要的生物磷酸盐相互作用(13,14). 在本文所使用的条件下，该站点似乎不会直接渗透到可能接触头部组磷酸盐的头部组区域。相反，该位点可能会从膜中抽出一部分脂质来结合其头部组，或者该位点可能仅在特定的信号状态下才渗透到头部组区域。例如，该位点可以通过其结合的信号脂质的出现，或通过全长PKC酶的其他结构域内触发的信号构象变化，被驱动进入头群层。或者，该位点可以与全长PKCα不同结构域上的磷酸化氨基酸相互作用，该结构域被磷酸化激活(42)或者用不同的蛋白质。需要进一步研究以确定磷酸盐结合位点是否发挥重要的生物学作用。
致谢
作者感谢福克实验室的内森·马尔伯格对EPR测量的有益讨论和帮助。
脚注
†由NIH Grant GM R01-63235（向J.J.F.）和DGESIC Grant PB98-0389（向J.C.G.F.）提供支持。
支持信息可用
载脂蛋白（apo）、钙（Ca）中18个自旋标记蛋白中每一个的EPR谱2+-占据态和膜结合态表示为支持信息可通过互联网免费获取网址：http://pubs.acs.org.
工具书类
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