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分子生物学细胞。2004年3月；15(3): 1101–1111.
数字对象标识：10.1091/桶。E03-09-0704号
预防性维修识别码：PMC363084型
PMID：14699058

利用表达荧光自噬体标记的转基因小鼠在体分析营养饥饿后的自噬反应

Noboru水岛，*†‡§ 山本昭一， 松井真本，*∥ 吉森田松（Tamotsu Yoshimori），#**和Ohsumi吉诺里*∥
让·格伦伯格，监控编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

大自噬介导细胞质成分的大量降解。它解释了大多数长寿命蛋白质的降解：包括细胞器在内的细胞质成分被隔离在自噬体内，自噬体随后与溶酶体融合，在那里发生降解。尽管自噬可能参与体内平衡、发育、细胞死亡和发病机制，但由于监测方法的局限性，尚未在哺乳动物中进行系统的体内分析。为了了解体内何时何地发生自噬，我们制备了系统表达GFP并与LC3融合的转基因小鼠，LC3是酵母Atg8（Aut7/Apg8）的哺乳动物同源物，是自噬体的标记蛋白。荧光显微镜分析表明，大多数组织中的自噬是由不同的营养饥饿诱导的。在一些组织中，在没有饥饿治疗的情况下，自噬甚至会活跃发生。我们的研究结果表明，自噬的调节依赖于器官，自吞噬的作用并不局限于饥饿反应。这种转基因小鼠模型是研究哺乳动物自噬的有用工具。

简介

真核生物在细胞内有两个主要的蛋白质降解系统。一个是泛素蛋白酶体系统，它解释了大多数短命蛋白质的选择性降解(Hochstrasser，1996年;Hershko和Ciechanover，1998年). 另一个是溶酶体系统。来自细胞内外的蛋白质被输送到裂解室。外源物质和质膜蛋白的降解是由内吞/吞噬过程介导的，而细胞质成分的降解是通过自噬（也称为自噬细胞）实现的。已经提出了三种类型的自噬：大自噬、微自噬和伴侣介导的自噬(Seglen和Bohley，1992年;邓恩，1994;布洛马特等。，1997). 巨自噬被认为是哺乳动物细胞内大多数细胞内蛋白质降解的原因，特别是在饥饿诱导的蛋白质水解过程中(莫蒂莫尔和Pösö，1987年).

大自噬（以下简称自噬）是由一种称为自噬体的独特细胞器介导的。一个称为隔离膜（也称为吞噬细胞）的膜池包围了细胞质的一部分，导致自噬体的形成。自噬体是一种含有未消化的细胞质物质（包括细胞器）的双层膜结构。固存步骤通常被认为是非选择性的。接下来，自噬体的外膜与溶酶体膜融合。各种水解酶供应给自噬体，细胞质衍生的内容物与自噬体内膜一起降解。这种降解结构称为自溶体/自噬体。

自噬被认为是细胞成分正常周转所必需的，尤其是在饥饿时(莫蒂莫尔和Pösö，1987年). 自噬缺陷酵母细胞在饥饿期间迅速死亡(Tsukada和Ohsumi，1993年). 自噬在某些类型的分化/发育中也起着重要作用：自动液位计基因（如下所述）对酵母中孢子的形成至关重要(Tsukada和Ohsumi，1993年)以及黑腹果蝇(尤哈斯等。，2003),盘状网柄菌(奥托等。，2003)，以及秀丽隐杆线虫(梅伦德斯等。，2003). 缺乏自噬基因的植物衰老加速(德林等。，2002;花冈等。，2002). 相反，尽管越来越多的研究表明，自噬可能对胚胎发生期间的细胞死亡很重要，但自噬在哺乳动物中的确切作用尚不清楚(克拉克，1990年)和发病机制(梁等。，1999;西野等。，2000). 此外，还没有进行描述自噬发生的时间和地点的系统分析。这主要是由于缺乏良好的诊断方法。迄今为止，电子显微镜一直是监测自噬的唯一方法。不幸的是，这是一种需要很多技巧和时间的方法，有时仅仅通过形态学很难区分自噬液泡和其他结构。尽管最近产生了一种优雅的转基因小鼠模型来监测泛素/蛋白酶体系统(林德斯滕等。，2003)，我们还没有这样的体内自噬检测系统。

我们利用酵母细胞和哺乳动物细胞在分子水平上解剖了自噬途径。在酵母中，酿酒酵母，至少16个APG公司和AUT（自动变速器）已确定自噬体形成所需的基因(Klinsky和Ohsumi，1999年;Ohsumi，2001年;水岛等。，2002年a). 这些自噬相关基因的命名最近被统一为自动液位计(克林斯基等。，2003). 我们发现了两个新的泛素化类共轭体系：一个介导Atg12到Atg5的共轭(水岛等。，1998年a)另一种介导Atg8（Aut7/Atg8）和磷脂酰乙醇胺（PE；市村真一等。，2000). 由此产生的结合物Atg12-Atg5和Atg8-PE在自噬体形成中起作用(铃木等。，2001;野田佳彦等。，2002). 这两个结合系统在哺乳动物中高度保守（水岛等。， 1998年b，2002年b;卡贝亚等。，2000; 谷多等。， 2001，2002). 大多数Atg12-Atg5结合物以与Atg16L（水岛等。， 1999，2003;库马等。，2002). 只有一小部分Atg12-Atg5·Atg16L复合物在其伸长过程中定位于自噬隔离膜，当自噬体形成完成时，复合物从膜上分离(水岛等。，2001). 我们已经证明，小鼠Atg12-Atg5共轭物确实对膜伸长过程至关重要，因为ATG5型-/-胚胎干细胞(水岛等。，2001). LC3是Atg8的哺乳动物同源物之一，也以Atg5依赖的方式靶向隔离膜。然而，即使球形自噬体完全形成，LC3仍留在膜上(卡贝亚等。，2000;水岛等。，2001). 当我们用绿色荧光蛋白（GFP）-LC3标记自噬体时，我们可以通过荧光显微镜看到它们是环状结构(水岛等。，2003)或者在小自噬体的情况下为点(卡贝亚等。，2000). 由于自溶体膜上的LC3少于自噬体，因此自溶体的荧光信号较弱。基于这些观察结果，我们认为LC3可以作为分离膜、自噬体和一些自溶体的良好分子标记(卡贝亚等。，2000).

我们将此方法应用于体内研究，以简单准确地监测自噬。我们产生了GFP-LC3转基因小鼠，并检测了各种组织中自噬的发生。利用这种新的检测系统，我们对饥饿期间的自噬反应进行了全面和定量的分析。

材料和方法

抗体

抗重组大鼠LC3的抗体已在前面描述过(卡贝亚等。，2000). 多克隆抗GFP抗体（用于免疫印迹）和Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG（H+L）抗体购自Molecular Probes（Eugene，OR）。多克隆抗GFP抗体（用于免疫电镜）购自Clontech（加利福尼亚州帕洛阿尔托）。使用兔抗猪弹性蛋白酶抗体（Rockland）、兔抗牛羧肽酶-A抗体（Rock land），兔胰蛋白酶抗血清（Nordic Immunological Labs，Westbury，NY）和羊抗人淀粉酶（胰腺）抗体（The Binding Site Limited，San Diego，CA）进行免疫印迹。兔抗鼠角蛋白抗体购自新泽西州普林斯顿LSL有限公司。

质粒的构建

从pEGFP-LC3中切除了一个1.8kbp的DNA片段，该片段包含大鼠LC3 cDNA与EGFP N端融合（GFP-LC3）和SV40晚期多聚腺苷酸化信号(卡贝亚等。，2000)并插入Sma公司巨细胞病毒即刻早期（CMVie）增强子和鸡β-肌动蛋白（CAG）启动子下游pK-CA6（由Zubair博士善意提供）的I位点(丹羽等。，1991)以产生pCAG-GFP-LC3。

F9稳定转化子的产生

将F9畸胎瘤细胞培养在含有10%胎牛血清（FCS）、5 U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的DMEM中的胶化培养皿上。为了获得稳定的转化子，5×106用10μg线性化pEGFP-LC3（950μF，220 V）电穿孔F9细胞，并在存在0.5 mg/ml基因素（Invitrogen，Carlsbad，CA）的情况下进行筛选。本研究中使用了一个过度表达GFP-LC3的克隆（GLF3）。对于氨基酸饥饿，细胞在含有10 mM HEPES、pH 7.5（不含氨基酸和FCS）的Hanks溶液中培养2 h。

转基因小鼠的产生

3.4-kbpXho公司我和Spe公司从pCAG-GFP-LC3中分离出I片段，并微量注射到C57BL/6N Crj×BDF1受精卵中。将微量注射的卵子转移到假孕寄养雌性的输卵管中。利用引物GFP1（5′-TCCTGTGGTTCGTGACCG-3′）和LC3对60只小鼠进行PCR筛选，以纳入转基因*（5′-TTGCGGAATTCTCCAGC-CGTCTCTCTCGC-3′）。使用另一个引物集（mLC3ex3GT:5′-TGAGC-GAGCTCATCAAGATAATAATCAGGT-3′和mLC3ex 4AG:5′-GTTAGCAT-GAGCTGCCGTCT-3′）扩增LC3基因组的第三内含子作为内部对照。其中8只小鼠转基因阳性。阳性小鼠与C57BL/6N Crj杂交，并保持为GFP-LC3转基因的杂合子。本研究使用了其中一个转基因株系GFP-LC3#53。通过PCR分析或GFP宏观检查（匈牙利布达佩斯生物实验室设备、维护和服务有限公司）对GFP信号进行基因分型。小鼠的照明方案为：光照时间为早上7点至晚上7点，暗照时间为晚上7点至早上7点。本研究中使用的是6至8周龄的GFP-LC3小鼠。为了研究饥饿的影响，小鼠被剥夺食物24或48小时（上午10点至10点）。这些老鼠可以自由饮用水。

免疫印迹法

F9细胞裂解物用裂解缓冲液（2%NP-40，0.2%十二烷基硫酸钠，PBS中添加蛋白酶抑制剂）制备。将小鼠组织匀浆化为九份添加蛋白酶抑制剂的冷冻PBS。匀浆在500×克在4°C下持续10分钟。如前所述，对50μg的蛋白质提取物进行SDS-PAGE和免疫印迹(水岛等。，1998年b). 使用LAS-1000化学发光成像系统（日本东京富士胶片公司）对免疫反应带的强度进行量化。

荧光显微镜

通过配备CCD相机（ORCA ER，Hamamatsu Photonics，Hamamatsu，Japan）的荧光显微镜（Olympus IX81，Tokyo，Japan）直接观察表达GFP-LC3的F9细胞。使用U-MGFPHQ反射镜装置进行GFP观察，使用U-MWIG2反射镜装置检查自体荧光。

GFP观察用组织样品制备如下。为了防止在组织制备过程中诱导自噬，用乙醚麻醉小鼠，并立即用4%多聚甲醛（PFA）通过左心室灌注在0.1 M磷酸钠缓冲液（PB；pH 7.4）中进行固定。采集组织并用相同的固定剂进一步固定至少4小时，然后用15%的蔗糖在PBS中处理4小时，再用30%的蔗糖溶液过夜。将组织样品嵌入Tissue-Tek OCT化合物（日本东京樱花精细技术有限公司）中，并保存在-70°C下。使用低温恒温器（CM3050 S，莱卡，迪尔菲尔德，IL）在5–7-μm厚度下对样品进行切片，空气干燥30分钟，并在-20°C下保存，直至使用。

对于免疫荧光显微镜，用2%PFA灌注小鼠10分钟，取出组织并立即浸入蔗糖溶液中。冷冻液的制备如上所述。在用PBS中的4%脱脂乳封闭后，将切片与兔抗小鼠角蛋白抗体孵育1小时，然后将Alexa fluor 568抗兔IgG抗体（1:200稀释）孵育1小时。使用慢褪色光防褪色试剂盒（分子探针）安装样品。

GFP-LC3点的定量分析

在至少五只独立小鼠的五个独立视野中计算每个器官中GFP-LC3点的数量。结果表示为平均值±SD。实验组之间的统计差异概率由学生的t吨测试。

电子显微镜和免疫电子显微镜

如前所述，对F9细胞进行常规电子显微镜检查(吉森等。，2000)，除了在涂胶塑料盖玻片上生长的F9细胞在0.1 M的二羧酸缓冲液（pH 7.4）中预先加入2.5%戊二醛2 h外，按照前面的描述进行形态分析(水岛等。，2001).

对于免疫电子显微镜，如前所述进行预包埋银增强免疫金方法(吉森等。，2000)，稍作修改。将小鼠组织固定在0.1 M PB（pH 7.4）中4%多聚甲醛中4 h。制备6μM的冷冻切片，并在含有0.005%皂苷、10%牛血清白蛋白、10%正常山羊血清和0.1%冷水鱼皮明胶的PB中孵育30 min。然后用抗GFP的兔IgG（稀释500倍）处理组织切片在封闭溶液中过夜。然后，将切片在含有0.005%皂苷的PB中清洗6次，每次10分钟，并用与胶体金（直径1.4 nm）结合的山羊抗兔IgG在封闭溶液中孵育2小时。样品用PB清洗6次10分钟，用1%戊二醛在PB中固定10分钟。清洗后，用银增强试剂盒在20°C的黑暗中增强金标记6分钟。在蒸馏水中洗涤后，细胞在0.5%OsO中后固定4在4°C下保持90 min，在蒸馏水中清洗，用50%乙醇孵育10 min，用2%乙酸铀酰在70%乙醇中染色2 h。样品用梯度系列乙醇进一步脱水并嵌入环氧树脂中。超薄切片用醋酸铀酰和柠檬酸铅双重染色。

结果

GFP-LC3作为自噬膜的标记物

我们之前已经证明GFP-LC3特异性标记自噬隔离膜和自噬体(卡贝亚等。，2000). 虽然一些GFP-LC3在与溶酶体融合后从膜上分离，但GFP-LC2仍对自溶酶体进行弱标记。因此，GFP-LC3可作为自噬膜的特异性标记物。

令人担忧的是，外源性过度表达的GFP-LC3可能抑制或激活表达细胞中的自噬活性。我们用培养细胞测试了这种可能性。我们生成了稳定过度表达GFP-LC3的F9畸胎瘤细胞(图1). 过表达GFP-LC3的水平是内源性LC3水平的10倍以上(图1B). 在氨基酸饥饿2小时后，在这些细胞中观察到许多环状GFP-LC3结构，证实了GFP-LC2即使在过度表达时也能作为自噬体标记物发挥作用(图1A). 我们已经证明内源性LC3以两种不同的形式存在(卡贝亚等。，2000). 当自噬被诱导时，胞质LC3-I转化为第二种形式，LC3-II，其与自噬体结合，并可能与磷脂酰乙醇胺结合（PE；Kabeya等。，未发布的结果）。通过SDS-PAGE可以清楚地区分这两种形式的LC3，LC3-II的数量与自噬体的数量高度相关(卡贝亚等。，2000). 使用F9稳定细胞系，我们证实当细胞在富含营养的培养基中培养时，GFP-LC3的过度表达不会影响内源性LC3-II/LC3-I比率(图1B). 饥饿2小时后，LC3-I向LC3-II的转化在该细胞系中也正常。接下来，我们通过电子显微镜和形态分析对这些细胞进行了检查(图1C). 在富含营养的培养基中，野生型F9细胞和过度表达GFP-LC3的F9细胞中观察到极少的自噬空泡（自噬体和自溶体）。然而，在氨基酸饥饿后，两种细胞系中自噬液泡的体积增加到细胞质总量的～2%，并且没有显著差异。这些结果表明，GFP-LC3的过度表达并不影响自噬活性。

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GFP-LC3的过度表达并不影响F9细胞的自噬状态。（A） 过度表达GFP-LC3的F9细胞在Hanks溶液中培养指定时间，并通过荧光显微镜直接观察。棒材，10μm。（B） 将野生型F9细胞和过度表达GFP-LC3的F9细胞在氨基酸饥饿2h前后制备总细胞裂解物，并使用抗LC3抗体进行免疫印迹分析。定量内源性LC3-I和LC3-II的谱带强度。显示了LC3-II/LC3-1比率。（C） 通过电子显微镜和形态计量学分析检测野生型F9细胞和在氨基酸饥饿2h前后过度表达GFP-LC3的F9细胞。自噬液泡总面积与细胞质总面积之比如图所示。

GFP-LC3转基因小鼠的制备

由于外源性表达的GFP-LC3是自噬膜的理想分子标记物，因此我们在组成型CAG启动子的控制下生成了表达GFP-LC3.的转基因小鼠系。获得了八个转基因小鼠系，其中一个系GFP-LC3#53用于本研究。该转基因株系未见异常。GFP-LC3在产前阶段表达，如之前报道的绿色小鼠中的情况(奥卡比等。，1997). 在成年小鼠中，GFP-LC3几乎在我们检测的所有组织中都表达(图2). GFP-LC3的表达水平与脑内内源性LC3的水平相当，而GFP-LC2在其他组织中过度表达。特别是，GFP-LC3在心脏、肝脏、胰腺和骨骼肌中的表达水平远高于内源性LC3。这种过度表达与F9 GFP-LC3稳定转化子中的表达相当(图1B). 从6~8周龄的4%PFA灌注小鼠中取出各种器官。制备并检查了常规冰冻切片。

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GFP-LC3转基因小鼠中GFP-LC2的表达。对25毫克的每个组织匀浆进行SDS-PAGE，并用抗GFP和抗LC3抗体进行免疫印迹分析。

肝脏

我们首先检查了肝脏，因为自噬是该组织中最常见的分析方法。在喂食小鼠的肝细胞中，GFP-LC3信号在细胞质中广泛检测到，很少有点状点(图3A). 饥饿24小时后，GFP-LC3点的数量普遍增加，大多数呈杯状和环状结构(图3、B和C). 为了证实这些GFP阳性结构确实代表了隔离膜和自噬体，我们使用抗GFP抗体进行了免疫电子显微镜检查。银增强的金颗粒与隔离膜相关联(图3D)和自噬体(图3E). 这些观察结果证实，GFP-LC3可作为转基因小鼠自噬膜的标记物。

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肝脏对饥饿的自噬反应。（A–C）在（A）或饥饿24小时（B和C）后从GFP-LC3转基因小鼠制备肝脏样品，并用4%多聚甲醛固定。用荧光显微镜分析冰冻反应。C组显示了诱发率最高的病例。棒材，10μm。（D和E）饥饿24小时的GFP-LC3小鼠肝细胞中GFP-LC2的定位。从饥饿24小时后的GFP-LC3转基因小鼠制备肝脏样品，并用4%多聚甲醛固定。使用抗GFP抗体通过银增强免疫金电子显微镜检查GFP-LC3的定位。图中显示了杯状隔离膜（D中的箭头）和双膜自噬体（E中的箭头所示）。棒材，1μm。

通过GFP-LC3染色测定的饥饿诱导的自噬活性在单个小鼠之间存在差异（例如。，图3，B与C). 我们量化了10只独立小鼠中GFP-LC3阳性结构的数量，发现饥饿24小时的小鼠肝脏中的GFP-LC3-阳性结构数量略有但显著增加（参见图7). 然而，饥饿48小时后，自噬水平几乎恢复到基础水平。

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定量分析饥饿期间GFP-LC3点的形成。计算GFP-LC3点的数量并除以相应的面积。为了分析骨骼肌，使用了横切面。由于肾小球和胸腺皮质由多种细胞组成，因此未计算足细胞和胸腺上皮细胞中GFP-LC3点的实际密度。这个Y（Y）-轴表示GFP-LC3点的数量（×104/毫米2). 每个值代表至少五只小鼠的平均值±SD。*p<0.05和**p<0.01。

肌肉组织

我们检查了腓肠肌，发现了非常明显的饥饿反应：饥饿24小时后，肌原纤维之间和核周区域显著诱导了许多GFP-LC3点。我们还发现，有一群肌肉纤维显示的斑点要少得多。我们假设这可能反映了肌肉纤维类型的差异，因为之前已经报道过慢收缩和快收缩肌肉中蛋白质降解的差异调节(Li和Goldberg，1976年;Frayn和Maycock，1979年;达尔曼等。，1986;Vary和Kimball，1992年). 我们比较了快速抽搐趾长伸肌（EDL）和慢速抽搐比目鱼肌。在EDL肌肉中，饥饿前观察到极少数GFP-LC3点。然而，饥饿24小时后，肌原纤维之间和核周区域出现许多小GFP-LC3点(图4，A和C). 免疫电子显微镜显示，肌原纤维之间有许多用银增强的金颗粒标记的自噬体(图4F，箭头）和瓣周区域(图4G，箭头）。饥饿48小时后，EDL肌肉的自噬水平与24小时时几乎相同或略有下降。

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肌肉组织自噬。（A和B）指示饥饿期后指长伸肌（EDL）和比目鱼肌（B）横切面的GFP图像。棒材，10μm。（C和D）饥饿24小时后EDL肌的纵切面（C）和饥饿48小时后比目鱼肌的纵截面（D）。星号表示原子核。棒材，10μm。（E） 饥饿0、24和48小时时心脏肌肉的GFP图像。棒材，10μm。（F和G）24小时饥饿后腓肠肌的免疫电镜分析。与GFP-LC3相关的自噬体（箭头）在肌原纤维（F）和核周区（G）积聚。棒材，1μm。（H） 24小时饥饿小鼠心肌的免疫电镜分析。肌原纤维之间产生一簇自噬体（箭头所示）。双箭头表示包裹线粒体的自噬体。棒材，1μm。

相比之下，在缓慢切换的比目鱼肌中，饥饿24小时后很少诱导自噬(图4B). 饥饿48小时后观察到中度自噬。GFP-LC3点在比目鱼肌和EDL肌中的定位不同。大多数GFP-LC3点出现在肌纤维的外围，尤其是核周区(图4、B和D). 即使在饥饿48小时后，肌原纤维之间也很少检测到斑点。

饥饿期间，心脏肌肉也出现剧烈变化。喂食小鼠的心肌显示出极低水平的自噬(图4E). 在48小时饥饿期间，自噬体的数量和大小增加。在48小时时，荧光显微镜很容易识别出许多大型环状结构。免疫电镜显示细胞质中产生了许多自噬体(图4H箭头所示），这些自噬体经常包裹线粒体(图4H，双箭头）。

胰腺

胰腺外分泌部的腺泡细胞有许多含有多种蛋白酶（前体）的酶原颗粒。尽管在饥饿治疗前出现了一些GFP-LC3点，但它们相对较小。饥饿24小时后，酶原颗粒的大小和数量减少(图5A). 此外，饥饿期间，许多自噬体在重叠或围绕酶原颗粒区域的顶端区域生成(图5A). 饥饿24小时后，GFP-LC3结构足够大，可以识别为环形结构。免疫电子显微镜也证明了这种尺寸差异。在喂食状态下，观察到大的酶原颗粒和小的GFP-LC3阳性自噬体(图5B). 相比之下，在饥饿24小时后，检测到较大的自噬体和自溶体，其中一些确实包裹着酶原颗粒(图5B). 在饥饿24小时期间，蛋白酶（如胰蛋白酶、淀粉酶、弹性蛋白酶和羧肽酶）的数量减少(图5C). 因此，饥饿期间大量诱导自噬与酶原颗粒的丢失相关，这表明胰腺腺泡细胞中的酶原颗粒可能会被自噬降解。饥饿48小时后，大多数酶原颗粒消失，自噬体的产生也减少（见图7).

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胰腺外分泌细胞自噬。（A） 显示了指示饥饿期的GFP图像（顶部面板）和相应的差分干涉对比度（DIC）图像（底部面板）。棒材，10μm。（B） 胰腺腺泡细胞的免疫电镜分析。饥饿前，可以观察到大的酶原颗粒和小的自噬液泡（箭头所示）（左图）。饥饿24小时后，自噬体的大小增大，在自噬体内观察到一些酶原颗粒（右图中的双箭头）。棒材，1μm。（C） 饥饿期间胰腺蛋白酶的数量减少。在24小时饥饿前后从三只独立的小鼠制备匀浆，并使用抗胰蛋白酶、抗淀粉酶、抗lastase和抗羧肽酶抗体进行免疫印迹分析。以抗tubin抗体作为对照。

肾

肾脏肾小球中观察到点状GFP-LC3点(图6A). 肾小球由三种细胞类型组成：内皮细胞、内脏上皮细胞（足细胞）和系膜细胞。带有GFP-LC3点的细胞分布模式表明这些细胞是足细胞。通过免疫电子显微镜，在具有特征性足突的足细胞中观察到典型的GFP-LC3标记的自噬体(图6B). 有趣的是，足细胞自噬的基础水平相对较高，饥饿会进一步增强自噬(图7).

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组织在饥饿前表现出高水平的自噬。（A） 喂食小鼠肾小球的GFP荧光。棒材，10μm。插图：其他区域的高倍图像。棒材，2μm。（B） 使用抗GFP抗体对足细胞进行免疫电子显微镜检查。箭头表示自噬体。棒材，1μm。（C） 喂食老鼠的胸腺皮层。图示GFP荧光、抗细胞角蛋白染色和合并图像。棒材，10μm。（D） 胸腺皮质的免疫电子显微镜。箭头表示基质上皮细胞中的自噬体。棒材，1μm。（E） 喂食小鼠晶状体上皮细胞的GFP图像。棒材，10μm。插图：其他部分的高倍图像。上皮细胞中的一些GFP-LC3阳性结构被检测为环状和杯状。棒材，1μm。（F） 晶状体的免疫电子显微镜。箭头和星号分别表示自噬体和晶状体纤维。棒材，1μm。

我们还观察到饥饿小鼠肾小管中的特定GFP-LC3点和环形结构（我们的未发表结果）。然而，GFP-LC3的表达水平并不高，并且在小管中存在自发荧光信号。由于很难精确量化点的数量，我们将小管分析排除在本研究之外。

胸腺

在胸腺中，在皮质和髓质均呈星状的基质细胞中观察到许多GFP-LC3点(图6C). 由于抗细胞角蛋白抗体染色阳性，这些细胞被鉴定为上皮网状细胞。小的GFP-LC3点存在于网状细胞的细胞体和突起中。免疫电镜证实，淋巴细胞包围的网状细胞含有GFP-LC3阳性自噬体(图6D). 值得注意的是，即使没有饥饿治疗，胸腺上皮细胞也会发生自噬。我们量化了大脑皮层中GFP-LC3点的数量，发现撤食不会进一步诱导这些细胞的自噬（参见图7). 因此，无论营养状况如何，胸腺上皮细胞中的自噬都是构成活性的。髓质的这种模式几乎相同。然而，我们没有对髓质进行定量分析，因为该区域有一些自体荧光（参见图9). 此外，新生儿胸腺自噬更为活跃（我们未发表的观察结果）。

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GFP-LC3和自发荧光信号之间的区别。对大脑额叶皮层（A）和胸腺髓质（B）的样品进行绿色（左侧面板）和红色（中间面板）荧光分析。合并的图像显示在右侧面板中。显示GFP特定信号（箭头）和自动荧光信号（箭头方向）。神经元样细胞（A）和基质细胞显示自体荧光。在非转基因小鼠的样品中也观察到类似的自体荧光信号。棒材，10μm。

透镜

晶状体的前表面覆盖着一层上皮细胞。在赤道地区，这些上皮细胞转化为晶状体纤维。虽然GFP-LC3在晶状体上皮细胞中的表达水平相对较低，但在这些细胞中观察到了一些GFP-LC三点(图6E). 其中一些大得足以被识别为杯状和环状结构(图6E，插图）。GFP-LC3标记的自噬体在晶状体上皮细胞中常见，但在晶状体纤维中不常见(图6F). 自噬体广泛存在于外上皮细胞中，不仅限于赤道地区的过渡部位。与胸腺上皮细胞一样，晶状体上皮细胞中的自噬也具有组成活性，不依赖于营养条件（参见图7)

其他组织

除胰腺腺泡细胞外，其他外分泌腺细胞，如胃主细胞和精囊细胞，表现出中度的基础自噬水平，而营养饥饿会进一步加剧自噬（我们的未发表结果）。II型肺泡细胞也显示点状GFP-LC3斑点，饥饿后斑点数量增加（我们未发表的结果）。尽管GFP-LC3高表达，但在大脑、卵巢、睾丸和脂肪细胞中未观察到GFP-LC3-点（我们未发表的结果）。

器官饥饿反应的定量比较

我们量化了每个器官中GFP-LC3阳性结构的数量。不同器官对饥饿的反应模式不同(图7). 我们大致将这些反应分为五种模式。在第一种模式中，在48小时饥饿期间，自噬被越来越多地诱导。心脏是这个群体中最好的例子。比目鱼肌（缓慢抽搐）显示出类似的模式，但水平要低得多。第二组由EDL肌肉（快速抽搐）、腓肠肌（主要是快速抽搐；阿里亚诺等。，1973)足细胞的自噬在最初的24小时饥饿期间显著诱导，然后持续。第三组包括肝脏和胰腺，在第一次饥饿24小时时会诱导自噬，但在接下来的24小时饥饿期间会恢复到几乎基本水平。第四组表现出组成型活性模式，如胸腺上皮细胞和晶状体上皮细胞中所见。在这些细胞中，在饥饿处理之前观察到活跃的自噬，饥饿不会进一步增强自噬。第五种模式是即使在48小时饥饿治疗后也不会诱导自噬。大脑显示出这种模式（我们尚未公布的结果）。这些结果表明，自噬在小鼠中并不均匀发生，并表明自噬的调节是器官特异性的。

组织中LC3-I转化为LC3-II

用野生型小鼠通过免疫印迹内源性LC3来评估每个组织中的自噬活性(图8). 在骨骼肌、心脏和胰腺中，在24小时饥饿期间，LC3-I转化为LC3-II是明显的。肾脏和肝脏中的LC3-II水平也略有增加。相比之下，在大脑中几乎没有检测到转换。这些结果与形态学检查结果一致。

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在饥饿24小时期间，小鼠组织中LC3-I转化为LC3-II。从三只喂食小鼠和三只24小时饥饿小鼠制备组织匀浆，并使用抗LC3抗体进行免疫印迹分析。指示LC3-I和LC3-II的位置。

讨论

一种新的自噬监测方法

我们描述了一种监测体内自噬的新方法。迄今为止，体内自噬活性的评估仅通过电子显微镜的形态计量分析实现。相比之下，我们使用GFP-LC3转基因小鼠的方法有几个优点。首先，这是一个简单快捷的过程。它使我们能够在短时间内检查许多样品。由于自噬活动是动态的，因此分析大量样本以获得具有统计意义的结果可能很重要。其次，GFP-LC3标记自噬体是特异性的。我们的免疫电镜检查表明GFP-LC3仅定位于自噬膜，而不定位于其他膜结构(卡贝亚等。，2000). 因此，这项技术对于通过电子显微镜准确鉴定结构模糊的自噬空泡非常有用。我们还证实GFP-LC3的过度表达不会影响内源性自噬过程。第三，我们不仅可以很容易地观察到自噬体在细胞中的分布，还可以观察到自吞噬活性细胞在组织中的分布。第四，常用的荧光技术，如多色染色和三维重建是可行的。第五，如果我们从转基因小鼠中制备原代培养物，可以在不进行任何染色的情况下实时观察活细胞。

然而，应仔细解释荧光图像。一些细胞，如神经元(图9A)胸腺基质细胞（尤其是髓质；图9B)显示像脂褐素一样的自发荧光点结构。我们通过两种方法将特定的GFP-LC3信号与这些自荧光信号区分开来。首先，将转基因小鼠的样品与野生型同窝鼠的样品进行比较尤为重要。只有转基因动物才能检测到特定的GFP信号。其次，GFP-LC3信号不得使用其他荧光滤光片组检测，如罗丹明和Cy5(图9). 真正的GFP-LC3信号应由GFP或FITC滤波器组专门检测。此处显示的所有荧光图像（除了图9)我们相信通过这些程序可以消除非特定的绿色信号。此外，我们无法从GFP-LC3表达极低的细胞检测中得出任何结论。这些细胞包括内分泌胰腺细胞（胰岛细胞）、血细胞（包括红细胞）和I型肺泡细胞。然而，这种检测不需要强表达，因为在GFP-LC3表达水平低的细胞中，自噬现象明显可见，例如晶状体上皮细胞。

自噬作为饥饿反应

使用GFP-LC3转基因小鼠，我们对每个组织的饥饿自噬反应进行了系统分析。尽管人们对肝脏自噬非常关注，但我们发现几乎所有组织都会诱导自噬。然而，不同器官对饥饿的反应模式不同(图7). 体内自噬调节的机制尚不清楚。血浆氨基酸水平下降会导致自噬，而激素控制也应该存在。我们的结果表明，饥饿反应的各种模式表明，自噬的调节并不一致，而是依赖于器官。

尽管自噬在不同器官中的调节不同，但大多数器官都会因营养缺乏而诱导自噬。这表明自噬的主要作用是饥饿反应。肝脏是负责在饥饿期间回收细胞质成分以向其他组织提供营养的主要器官。然而，饥饿是否会在体内诱导肝脏自噬仍存在争议。据报道，自噬没有改变或轻微诱导(莫蒂莫尔等。，1983)或在饥饿时下调(德瓦尔等。，1986). 我们发现喂食和24小时禁食状态之间存在微小但显著的差异。然而，24小时的SD非常大，这表明肝脏中的自噬活性在单个小鼠中存在很大差异（图​（图3三和​和7）。7). 即使在饥饿24小时后，一些小鼠仍表现出几乎基本水平的自噬，尽管自噬在同一小鼠的其他器官（如肌肉）中明显诱导。因此，肝脏自噬的调节可能比其他器官的调节更复杂。需要对控制喂养方案进行进一步的实验，以更详细地描述肝脏自噬的饥饿反应。

相反，在饥饿期间，肌肉的变化更为明显。特别是，快速抽搐的肌肉会对饥饿做出剧烈反应。如先前测量体质量退化的研究所示，参与补品构建和姿势维持的慢开关肌肉在饥饿期间得到更好的保护(Li和Goldberg，1976年;Frayn和Maycock，1979年). 肌纤维中的蛋白质降解一直是一个有争议的问题，但最近的共识是泛素蛋白酶体系统负责肌原纤维的降解，而溶酶体参与非肌原纤维细胞质蛋白质和细胞器的降解(Attaix和Tailandier，1998年). 在本研究中，我们仅在细胞质中检测到GFP-LC3标记的自噬体，并且在其内部找不到完整的肌原纤维(图4). 然而，这一观察并不排除自噬参与肌原纤维降解的可能性。例如，自噬体可能包裹部分降解的肌原纤维。

有趣的是，即使在48小时的食物戒断后，大脑中也没有观察到自噬。大脑可能不会因这种食物戒断治疗而挨饿；其他器官可以向大脑提供营养物质（葡萄糖和酮体）。因此，可能需要更严厉的治疗（例如缺血性损伤）来诱导大脑自噬。

自噬体大小调节

通过对小鼠组织的荧光显微镜检查，我们能够分析自噬体的分布和大小。如果自噬体的大小大于1μm，则可见环状结构。我们观察到自噬体的大小在不同的培养细胞系中不同。在我们检测的细胞系中，胚胎干细胞产生最大的自噬体（水岛等。， 2001，2003)，其次是F9细胞和成纤维细胞（我们未发表的观察结果）。相反，HeLa细胞中的自噬体很小，只能以点的形式检测到(卡贝亚等。，2000). 在小鼠组织中也观察到这种变化。形成大型自噬体的细胞包括肝细胞、心肌细胞（饥饿48小时），有时还包括晶状体上皮细胞。喂食状态下，胰腺腺泡细胞中的自噬体相对较小，但饥饿后会生成较大的自噬体。相反，骨骼肌、足细胞和胸腺上皮细胞即使在饥饿后也会产生小的自噬体。因此，自噬体的大小不是随机的，必须以细胞谱系和营养条件依赖的方式进行调节。

器官降解和自噬

据报道，饥饿啮齿动物的酶原颗粒数量减少(内瓦莱恩和贾尼根，1974年;本达扬等。，1985;北川和小野，1986年). 所谓的分泌颗粒与溶酶体直接融合的缩颈是经典的降解途径。然而，由于在腺泡细胞中检测到了自噬体样结构，自噬被认为是一种可能的降解机制。在这项研究中，我们清楚地证明了在饥饿期间，自噬体出现在胰腺腺泡细胞的顶端，并隔离了一些酶原颗粒。虽然我们不知道在分子水平上这些酶原颗粒是否具有任何特异性，但在酶原颗粒重叠或周围区域大量诱导自噬体可能是颗粒有效降解的原因。其他外分泌细胞（如胃主细胞和精囊细胞）中中度基础水平的自噬也可能参与分泌囊的降解。

晶状体纤维中几乎没有内质网、线粒体、核糖体，也没有细胞核。因此，一种可能性是晶状体细胞的自噬可能与这些细胞器的消除有关(沃尔顿和麦卡沃伊，1984年). 然而，主动自噬并不局限于细胞器降解发生的区域。在晶状体前极上皮细胞中也观察到自噬体，在那里细胞没有分化。此外，当大多数晶状体纤维分化时，晶状体自噬在胚胎发育后期并不活跃（我们尚未发表的观察结果）。因此，晶状体上皮细胞的自噬可能对细胞功能而非细胞器降解很重要。最近，15脂氧合酶被认为是这种细胞器降解的原因(范·莱恩等。，1998).

红细胞是另一种细胞内细胞器很少的细胞。然而，我们无法检测红细胞，因为GFP-LC3在红细胞中的表达很低(奥卡贝等。，1997).

成分主动自噬

几种组织，包括胸腺上皮细胞、晶状体上皮细胞、足细胞(图7)一些外分泌腺细胞，如胃主细胞和精囊细胞（我们未发表的结果）在营养丰富的条件下表现出高水平的自噬。虽然用荧光显微镜很难估计胸腺上皮细胞的体积，但这些细胞中自噬体的数量可能是所有未供体组织中最高的。一份报告还显示，胸腺上皮细胞的一些液泡中存在广泛的酸性磷酸酶活性(鲍文和刘易斯，1980年). 年轻的小鼠和晚期胚胎在胸腺中表现出更活跃的自噬（我们未发表的观察结果）。一般来说，细胞质蛋白由蛋白酶体处理，传递到内质网腔中，并通过MHC I类途径呈现。然而，越来越多的数据表明，内源性蛋白质也存在于II类MHC上(莱希勒等。，1996). 细胞质蛋白如何加载到II类MHC上还没有很好的研究，但自噬可能是这一途径的原因(巴西等。，1997;尼默尔贾恩等。，2003). 在阳性和阴性选择期间，胸腺上皮细胞向淋巴细胞呈现自我抗原。由于胸腺上皮细胞不被认为具有吞噬活性，因此有理由假设它们从自身细胞质中提供自我抗原。在这种情况下，胸腺上皮细胞的自噬可能参与T细胞的发育和中枢耐受。

如上所述，在晶状体纤维分化过程中，自噬不太可能在细胞器降解中起主要作用。因为晶状体上皮细胞是晶状体代谢和解毒的中心(Bhat，2001年)，自噬可能参与这些活动。足细胞组成性活性自噬的目的尚不清楚。

结论

我们开发了一种监测小鼠自噬的新方法。它简单、快速、准确。通过这种方法对饥饿反应中的自噬进行的系统分析提供了非常基础和新颖的见解。该系统可用于研究许多尚未解决的自噬问题，如自噬的调节、自噬在疾病中的意义、细胞死亡/退化和发育以及底物特异性。

致谢

我们感谢Mohamad Zubair博士为转基因小鼠的产生提供了质粒和有益的建议；Yukiko Kabeya和Masami Miwa负责技术援助，Akiko Kuma博士负责富有成效的讨论；以及西野一藏博士和野中一彦博士，指导肌肉准备。这项工作得到了日本教育、文化、体育、科学和技术部科学研究补助金的部分支持。

笔记

缩写词：GFP，绿色荧光蛋白；PE，磷脂酰乙醇胺；胚胎干细胞；FCS，胎牛血清；PFA，多聚甲醛；PB，磷酸盐缓冲液；指长伸肌；内质网；MHC，主要组织相容性复合体；驾驶员信息中心（DIC），差分干扰对比度。

文章在印刷前在线发布。Mol.Biol。细胞10.1091/mbc。E03–09–0704。文章和出版日期可在www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc。E03-09-0704号.

工具书类

  • Ariano，M.A.、Armstrong，R.B.和Edgerton，V.R.（1973年）。五种哺乳动物的后肢肌纤维群。《组织化学杂志》。细胞化学。 21, 51-55. [公共医学][谷歌学者]
  • Attaix，D.和Tailandier，D.（1998年）。与溶酶体和钙依赖系统相比，泛素蛋白酶体途径在肌肉萎缩中的关键作用JAI出版社，伦敦。
  • Bendayan，M.、Bruneau，A.和Morisset，J.（1985）。在对照和实验条件下对大鼠胰腺腺泡细胞进行形态计量学和免疫细胞化学研究。生物细胞 54, 227-234. [公共医学][谷歌学者]
  • Bhat，S.P.（2001）。晶状体上皮。Biosci公司。代表。 21, 537-563. [公共医学][谷歌学者]
  • Blommart，E.F.C.、Luiken，J.J.F.P.和Meijer，A.J.（1997）。自噬蛋白水解：控制和特异性。组织化学。J。 29, 365-385. [公共医学][谷歌学者]
  • Bowen，I.D.和Lewis，G.H.（1980）小鼠胸腺中的酸性磷酸酶活性和细胞死亡。组织化学 65, 173-179. [公共医学][谷歌学者]
  • 巴西，M.I.、Weiss，S.和Stockinger，B.（1997）。巨噬细胞内细胞内蛋白的过度降解阻止了主要组织相容性复合体II类分子的出现。欧洲免疫学杂志。 27, 1506-1514. [公共医学][谷歌学者]
  • Clarke，P.G.（1990年）。发育性细胞死亡：形态多样性和多种机制。阿纳特。胚胎。（柏林） 181, 195-213. [公共医学][谷歌学者]
  • Dahlmann，B.、Rutschmann，M.和Reinauer，H.（1986年）。饥饿或皮质酮治疗对大鼠骨骼肌中易释放肌丝数量的影响。生物化学。J。 234, 659-664.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • de Waal，E.J.、Vreeling Sindelarova，H.、Schellens，J.P.、Houtkooper，J.M.和James，J.（1986）。短期饥饿期间大鼠肝细胞溶酶体空泡系统的定量变化。形态计量学分析，特别涉及宏观和微观自噬。细胞组织研究。 243, 641-648. [公共医学][谷歌学者]
  • Doelling，J.H.、Walker，J.M.、Friedman，E.M.、Thompson，A.R.和Vierstra，R.D.（2002年）。APG8/12激活酶APG7是拟南芥营养循环和衰老所必需的。生物学杂志。化学。 277, 33105-33114. [公共医学][谷歌学者]
  • Dunn，W.A.J.（1994）。溶酶体介导的蛋白质降解的自噬及相关机制。趋势细胞生物学。 4, 139-143. [公共医学][谷歌学者]
  • K.N.Frayn和P.F.Maycock（1979年）。生理浓度的胰岛素对小鼠比目鱼肌和趾长伸肌蛋白质代谢的调节。饥饿和烫伤的影响。生物化学。J。 184，323-330。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hanaoka，H.、Noda，T.、Shirano，Y.、Kato，T.，Hayashi，H.，Shibata，D.、Tabata，S.和Ohsumi，Y.（2002）。拟南芥自噬基因的破坏加速了叶片衰老和饥饿诱导的黄化。植物生理学。 129, 1181-1193.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hershko，A.和Ciechanover，A.（1998年）。泛素系统。每年。生物化学评论。 67, 425-479. [公共医学][谷歌学者]
  • Hochstrasser，M.（1996）。泛素依赖性蛋白质降解。每年。修订版Genet。 30, 405-439. [公共医学][谷歌学者]
  • Y.一村。等。(2000). 泛素样系统介导蛋白质脂质氧化。自然 408, 488-492. [公共医学][谷歌学者]
  • Juhasz，G.、Csikos，G.，Sinka，R.、Erdelyi，M.和Sass，M.（2003）。Aut1的果蝇同源物对自噬和发育至关重要。FEBS信函。 543, 154-158. [公共医学][谷歌学者]
  • Kabeya，Y.、Mizushima，N.、Ueno，T.、Yamamoto，A.、Kirisako，T..、Noda，T.，Kominami，E.、Ohsumi，Y.和Yoshimori，T.（2000）。LC3是酵母Apg8p的哺乳动物同源物，加工后定位于自噬体膜。EMBO J。 19, 5720-5728.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kitagawa，T.和Ono，K.（1986年）。饥饿期间大鼠胰腺外分泌细胞的超微结构。历史。组织病理学。 1, 49-57. [公共医学][谷歌学者]
  • D.J.克林斯基。等人。(2003). 酵母自噬相关基因的统一命名。开发单元 5, 539-545. [公共医学][谷歌学者]
  • Klinsky，D.J.和Ohsumi，Y.（1999）。细胞质中蛋白质和细胞器的液泡输入。每年。Rev.细胞发育生物学。 15, 1-32. [公共医学][谷歌学者]
  • Kuma，A.、Mizushima，N.、Ishihara，N.和Ohsumi，Y.（2002年）。由Apg16寡聚作用介导的～350 kD Apg12-Apg5·Apg16多聚物复合物的形成对酵母的自噬至关重要。生物学杂志。化学。 277, 18619-18625. [公共医学][谷歌学者]
  • Lechler，R.、Aichinger，G.和Lightstone，L.（1996）。MHC II类抗原提呈的内源性途径。免疫学。版次。 151, 51-79. [公共医学][谷歌学者]
  • Li，J.B.和Goldberg，A.L.（1976年）。食物剥夺对大鼠骨骼肌蛋白质合成和降解的影响。美国生理学杂志。胃肠测试。肝脏生理学。 231, 441-448. [公共医学][谷歌学者]
  • Liang，X.H.，Jackson，S.，Seaman，M.，Brown，K.，Kempkes，B.，Hibshoosh，H.和Levine，B.（1999）。beclin 1诱导自噬和抑制肿瘤发生。自然 402, 672-676. [公共医学][谷歌学者]
  • Lindsten，K.、Menendez-Benito，V.、Masucci，M.G.和Dantuma，N.P.（2003年）。泛素/蛋白酶体系统转基因小鼠模型。自然生物技术。 21, 897-902. [公共医学][谷歌学者]
  • Melendez，A.、Talloczy，Z.、Seaman，M.、Eskelinen，E.L.、Hall，D.H.和Levine，B.（2003）。自噬基因对秀丽线虫dauer的发育和寿命延长至关重要。科学类 301, 1387-1391. [公共医学][谷歌学者]
  • 水岛，N.，库马，A.，小林，Y.，山本，A.，松下，M.，高雄，T.，夏目漱石，T.、大秀，Y.和吉森，T.（2003）。小鼠Apg16L是一种新型WD重复蛋白，以Apg12-Apg5结合物为靶点，作用于自噬隔离膜。细胞科学杂志。 116, 1679-1688. [公共医学][谷歌学者]
  • 水岛N.、野田佳彦T.和Ohsumi Y.（1999）。在酵母自噬途径中，Apg12p-Apg5p结合物的功能需要Apg16p。EMBO J。 18, 3888-3896.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 水岛N.、野田佳彦T.、吉森T.、田中Y.、石井T.、乔治M.D.、克林斯基D.J.、大秀M.和大秀Y.（1998年a）。自噬所必需的蛋白质结合系统。自然 395, 395-398. [公共医学][谷歌学者]
  • 水岛，N.，Ohsumi，Y.和吉森，T.（2002a）。哺乳动物细胞中的自噬体形成。单元格结构。功能。 27, 421-429. [公共医学][谷歌学者]
  • 水岛，N.，Sugita，H.，Yoshimori，T.和Ohsumi，Y.（1998年b）。一种新的人类蛋白质结合系统。酵母Apg12p结合系统的对应物，对自噬至关重要。生物学杂志。化学。 273, 33889-33892. [公共医学][谷歌学者]
  • 水岛，N.，山本，A.，Hatano，M.，小林，Y.，Kabeya，Y.、铃木，K.、德久，T.、大秀，Y.和吉森，T.（2001）。利用Apg5缺陷小鼠胚胎干细胞解剖自噬体的形成。《细胞生物学杂志》。 152, 657-667.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 水岛，N.、吉森，T.和大树，Y.（2002b）。作为Apg12结合酶的小鼠Apg10：通过结合介导的酵母双杂交方法进行分析。FEBS信函。 532, 450-454. [公共医学][谷歌学者]
  • Mortimore，G.E.、Hutson，N.J.和Surmacz，C.A.（1983年）。饥饿和再喂养期间小鼠肝细胞蛋白质水解与宏观和微观自噬的定量相关性。程序。国家。阿卡德。科学。美国 80, 2179-2183.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Mortimore，G.E.和Pösö，A.R.（1987年）。细胞内蛋白质分解代谢及其在营养缺乏和供应过程中的控制。每年。修订版螺母。 7, 539-564. [公共医学][谷歌学者]
  • Nevalainen，T.J.和Janigan，D.T.（1974年）。禁食期间小鼠胰腺腺泡细胞的退化。维丘建筑。B细胞病理学。 15, 107-118. [公共医学][谷歌学者]
  • Nimmerjahn，F.、Milosevic，S.、Behrends，U.、Jaffee，E.M.、Pardoll，D.M.、Bornkamm，G.W.和Mautner，J.（2003）。主要组织相容性复合体II类通过自噬限制细胞溶质抗原的呈现。欧洲免疫学杂志。 33, 1250-1259. [公共医学][谷歌学者]
  • 我·西野。等。(2000). 原发性LAMP-2缺乏可导致X连锁空泡型心肌病和肌病（达农病）。自然 406, 906-910. [公共医学][谷歌学者]
  • Niwa，H.、Yamamura，K.和Miyazaki，J.（1991）。利用新型真核载体高效选择高表达转染体。基因 108, 193-199. [公共医学][谷歌学者]
  • Noda，T.、Suzuki，K.和Ohsumi，Y.（2002年）。酵母自噬体：从头开始形成膜结构。趋势细胞生物学。 12, 231-235. [公共医学][谷歌学者]
  • Ohsumi，Y.（2001）。自噬的分子解剖：两个泛素样系统。自然反相摩尔电池。生物。 2, 211-216. [公共医学][谷歌学者]
  • Okabe，M.、Ikawa，M.、Kominami，K.、Nakanishi，T.和Nishimune，Y.（1997）`绿色老鼠是普遍存在的绿色细胞的来源。FEBS信函。 407, 313-319. [公共医学][谷歌学者]
  • Otto，G.P.、Wu，M.Y.、Kazgan，N.、Anderson，O.R.和Kessin，R.H.（2003）。大型自噬是盘基网柄变形虫多细胞发育所必需的。生物学杂志。化学。 278, 17636-17645. [公共医学][谷歌学者]
  • Seglen，P.O.和Bohley，P.（1992年）。自噬和其他空泡蛋白降解机制。Experientia公司 48, 158-172. [公共医学][谷歌学者]
  • 铃木，K.，Kirisako，T.，Kamada，Y.，水岛，N.，野田，T.和Ohsumi，Y.（2001）。由协同功能组织的自噬前体结构APG公司基因对自噬体的形成至关重要。EMBO J。 20, 5971-5981.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Tanida，I.、Tanida Miyake，E.、Komatsu，M.、Ueno，T.和Kominami，E.（2002）。人类Apg3p/Aut1p同源物是一种可靠的E2酶，可用于多种底物GATE-16、GABARAP和MAP-LC3，并促进hApg12p与hApg5p的结合。生物学杂志。化学。 277, 13739-13744. [公共医学][谷歌学者]
  • Tanida，I.、Tanida-Miyake，E.、Ueno，T.和Kominami，E.（2001）。人类同源物酿酒酵母Apg7p是一种用于多种底物的蛋白激活酶，包括人类Apg12p、GATE-16、GABARAP和MAP-LC3。生物学杂志。化学。 276, 1701-1706. [公共医学][谷歌学者]
  • Tsukada，M.和Ohsumi，Y.（1993年）。自噬缺陷突变体的分离与鉴定酿酒酵母。 FEBS信函。 333, 169-174. [公共医学][谷歌学者]
  • van Leyen，K.、Duvoisin，R.M.、Engelhardt，H.和Wiedmann，M.（1998年）。脂氧合酶在程序性细胞器降解中的作用。自然 395, 392-395. [公共医学][谷歌学者]
  • Vary，T.C.和Kimball，S.R.（1992年）。败血症诱导的蛋白质合成变化：对快速和慢速转换肌肉的不同影响。美国生理学杂志。 262，C1513-C1519。[公共医学][谷歌学者]
  • Walton，J.和McAvoy，J.（1984年）。晶状体上皮对视网膜调节介质的顺序结构反应。Exp.眼科研究。 39, 217-229. [公共医学][谷歌学者]
  • 吉森，T。等。(2000). 小鼠SKD1是酵母Vps4p的同源物，在哺乳动物细胞的正常内体运输和形态中是必需的。分子生物学。单元格 11电话：747-763。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会