心肌病患者的心外神经重塑

组织学和免疫化学研究

对星状神经节进行连续切片，并使用来自神经节中部的代表性组织切片进行分析。对所有幻灯片进行扫描，并以电子方式存储数字图像以供分析（Scan Scope、Aperio、Vista、CA）。分析除神经束外的整个神经节。组织学和免疫化学定量通过计算机形态计量学进行（Tissue Studio，Definiens Inc，Parsippany，NJ）。幻灯片以数字盲法进行分析，以避免数据分析中的偏差。在计算机分析过程中测量染色强度，并对研究样本进行标准化。

通过Thionin（Fisher Scientific，Pittsburgh，PA）和Geske对Verhoeff弹性肌和Masson三色肌的改良（EVG-trichrome）对神经元大小进行量化(19). EVG-三色染色定量星状神经节内纤维化。一名盲法观察者对神经节内纤维化的严重程度进行了0-5分的评分。值为0表示不存在纤维化。值1仅用于血管周围纤维化。整个神经节广泛纤维化的值为5。2、3和4的值分别用于比血管周围更严重但不覆盖整个星状神经节的进行性纤维化程度。

二氨基联苯胺（DAB，Life Technologies，Green Island，NY）免疫染色用于量化神经元生长（GAP-43，1:2000，Life Technologies）和神经突触密度（Synaptophyn，（SYN），1:200，Life Techologies）。神经元大小以平方微米（μm）表示²). 免疫反应性表示为um中的免疫染色区域²/研究的组织总面积（mm）²（嗯²/毫米²). 阳性对照（使用神经元癌组织）与所有免疫训练实验并行进行，以确认抗体免疫反应性。

心肌组织用H+E和Geske’s Modified of Verhoeff’s relasticle和Masson’s trichrome（EVG-trichrome）染色，从组织学上区分瘢痕和正常心肌。用S100免疫染色法测定神经纤维密度。S100免疫染色表达如上所述。如上所述，通过GAP-43免疫反应性定量心肌内神经萌芽。

神经元大小和分布

Thionin和Trichrome/EVG染色后，正常对照组星状神经节（NL，n=3）、瘢痕心脏神经节（SCAR，n=24）和无瘢痕心肌病心脏（NICM，n=7）的平均神经元大小示例如图2A硫胺素染色显示SCAR神经节的神经元明显大于NL（371.9±10.2μm²vs 320.1±4μm²). 然而，令人惊讶的是，NICM神经节的神经元是三组中最大的（435±10μm²，整体第页=0.002,图2B).

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图2

心脏病理学中的星状神经节神经元。（A） NL、SCAR和NICM的硫堇染色星状神经节代表性图像。（放大40倍，比例尺：50μm）。（B） 硫胺素染色平均神经元大小的量化。紫色实线连接手段。（C） 较小（<350μm）的百分比²)，中等（350μm²-500微米²)和大型（>500μm²)NL、SCAR和NICM的神经元如所示。紫色实线连接手段

小（<350μm）的分布²)，中等（350-500μm²)和大型（>500μm²)硫蛋白染色神经节内观察到的神经元如图所示图2C所有三组中的大多数神经元均在350μm以下²然而，与NL相比，SCAR和NICM中的小神经元百分比降低。SCAR和NICM与NL（MANOVA）中大神经元的百分比增加第页<0.0182，精确到威尔克斯λ）。各组中中等大小神经元的百分比没有显著差异。

神经节纤维化与神经密度

观察者（MCF）对每个星状神经节中观察到的纤维化程度进行评分，不考虑每个神经节的分组。如方法部分所述，对纤维化采用0-5的分级。NL、SCAR和NICM的平均纤维化等级分别为2.7±0.7、1.8±0.2和2.0±0.4；总体的第页=0.423),图3A.

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图3

星形神经节纤维化与神经元密度。（A） NL、SCAR和NICM中星状神经节纤维化的严重程度。（B） 对各组神经元的平均密度进行了比较。紫色实线连接手段。

三组之间的神经密度（细胞数/组织面积）无显著差异（0.039±0.01个细胞/μm²vs 0.028±0.005个细胞/μm²vs 0.024±0.004个细胞/μm²分别用于NL、SCAR和NICM；总体的第页=0.454),图3B.

突触密度与神经萌芽

通过NL、SCAR和NICM的星状神经节中的突触素免疫染色测量神经元突触密度，如图所示图4A突触密度为17.8±7.0 um²/毫米²对比57.8±11.2微米²/毫米²(第页=0.084）vs.44.5±7.9微米²/毫米²(第页=0.039）分别（整体第页=0.162）。

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图4

星状神经节内突触密度和神经萌芽。面板（A）显示了NL、SCAR和NICM中突触素（SYN）和生长相关蛋白43（GAP43）免疫反应性的代表性图像。箭头表示突触素染深的点状结构。（B） 和（C）各组间突触素和GAP43免疫反应性的量化。（放大20倍，比例尺：100μm）。

生长相关蛋白43（GAP43）并入生长神经元，是神经元生长的标志。图4A显示NL、SCAR和NICM组星状神经节中的GAP43染色。两组GAP43免疫反应性无显著差异（2696.2±1004μm）²/毫米²vs3992±614微米²/毫米²(第页=0.939）vs2564.7±881微米²/毫米²(第页=0.210），分别为整体第页=0.194).

神经特性与心脏病理

神经元对损伤的反应是一种公认的现象，在神经损伤的动物模型中已有描述(20-23). 心肌梗死后星状神经节内神经元肥大的报道尚未见报道。心肌由交感神经和副交感神经以及向背根神经节传递伤害性刺激的感觉C纤维高度支配。心肌损伤，如梗死或瘢痕形成，会导致轴突损伤。神经营养信号，包括神经生长因子（NGF）(8,24)（通过逆行轴突运输和/或循环）传递到体细胞，以发出轴突损伤信号(25). 在组织内，NGF信号对心肌损伤后导致的超神经支配很重要(26). 随后，细胞体肥大是色素分解的一个组成部分。这一过程可以解释我们研究中观察到的神经元肥大的病因。

神经元也可能因慢性信号而肥大。Cavalcanti等人在运动训练的大鼠模型中显示，双侧星状神经节内的神经元大小增加(15). 该模型中肥大的机制可能与心肌和轴突损伤的机制不同，尽管可能涉及类似的信号。慢性运动训练中出现的慢性交感神经信号可能导致神经元肥大。这一发现可能在一定程度上解释了我们的发现，即心肌病（NICM）心脏的星状神经节神经元与疤痕心脏的星形神经节神经元相比表现出明显更大的肥大。这与非缺血性心肌病中涉及星状神经节的神经-细胞激活是导致进展性心肌病的病理生理过程的主要组成部分的说法一致(27,28). 此外，这些星状神经节是从难治性室性心律失常患者中获得的，也可能表明这些肥大神经节参与了心室心律失常的发生。这一假设强调了一项里程碑式随机试验的基本原理，该试验将安慰剂与β-肾上腺素能受体阻滞剂治疗和心脏交感神经失能进行了比较(29). 该试验表明，心肌梗死后患者室性心律失常和猝死的发生率显著降低。这种益处的一个潜在机制是去除重塑的（可能是过度活跃的）星状神经节。

在我们的研究中，正常、瘢痕和NICM心脏的神经密度相似。由于外周神经节中的神经元不复制（与胶质细胞不同），这表明与正常情况相比，在心脏病理条件下没有明显的神经元丢失。据报道，患有心肺疾病的尸体与未患有心肺疾病的尸体相比，星状神经节内的纤维化有所不同(17). 来自同一组的另一项研究显示，在室间隔纤维化的尸体上，星形神经节的神经元密度更高(18). 然而，这两项研究的差异微不足道。在我们的研究中，纤维化或平均神经元密度没有显著差异。这可能是因为我们研究中的受试者年龄较小，而Docimo等人(17).

心脏病理学中的神经萌芽和突触密度

在动物模型中，心肌损伤后会出现心肌和星状神经节内的神经萌芽，但在人类星状神经神经节中还没有神经萌芽的记录。在我们对慢性心肌损伤的研究中，患有心脏病的受试者星状神经节内的突触密度（突触素免疫染色）在质量上更大（NL 17.8±7um）²/毫米²与SCAR 57.8±11.2um相比²/毫米²(第页=0.039）与NICM 44.5±7.9um²/毫米²(第页=0.084); 总体的第页=0.162); 然而，在正常和病理心脏之间，星状神经节神经发芽（GAP43）没有观察到差异。我们研究中的这一发现与之前关于动物模型中神经重塑动力学的研究一致。在兔子身上(16)和犬科动物(24)分别于梗死后1周和1个月测定心肌梗死模型、突触密度和神经萌芽水平。梗死后1个月时突触密度高于梗死后1周。这与神经萌芽形成对比，神经萌芽在1周时最大，但在1个月后减少。这种模式表明，神经萌芽可能是一个短暂的过程，而突触密度的增加则是一个更持久的适应过程。我们的研究包括治愈的梗死，与对照组相比，突触密度持续升高，而神经萌芽水平与正常水平相似。同样，正常、有疤痕和无疤痕心肌病心脏的心肌神经密度相似。

作者感谢Jacob N.Fox理学学士、Wei Zhou博士、Shelly Cote RN MSNP、Jean Gima RN MSNP和Long Sheng Hong对本项目的重大贡献。此外，我们还要感谢Clara Magyar博士和加州大学洛杉矶分校转化病理学核心实验室。我们还感谢加州大学洛杉矶分校和世界大学生体育联合会（WVU）的捐赠者，他们的慷慨让我们得以研究尸体标本。我们还要感谢加州大学洛杉矶分校生物数学系的杰弗里·戈恩宾博士提供的统计援助。

资金来源：这项工作是在NHLBI（R01HL084261）对KS的支持下完成的。