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免疫学杂志。作者手稿；PMC 2013年7月15日发布。
以最终编辑形式发布为：
免疫学杂志。2012年7月15日；189(2): 813–818.
2012年6月6日在线发布。 数字对象标识：10.4049/吉姆诺尔.1102041
预防性维修识别码：项目经理3392356
NIHMSID公司：NIHMS377209
PMID：22675202

IFN-γ通过p38 MAPK信号通路诱导巨噬细胞自噬1

松泽武史,2,* Bae-Hoon Kim先生,† 阿维纳什·谢诺伊,† Shigeki Kamitani先生,‡ 三宅雅美,*和约翰·麦克米金†
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

自噬是植物和动物的主要先天免疫防御途径。在哺乳动物中，这种级联反应可由细胞因子（IFN-γ）或模式识别受体（TLR和核苷酸结合寡聚结构域样受体[NLRs]）诱导。目前已知TLR和NLR诱导的自噬中的许多信号成分；然而，那些通过IFN-γ激活自噬的分子仍有待阐明。在这里，我们设计巨噬细胞编码串联荧光标记的LC3b（tfLC3）自噬体报告子以及稳定整合的shRNAs，以证明IFN-γ诱导的自噬需要JAK 1/2、PI3K和p38 MAPK，但不需要STAT1。此外，自噬相关的GTPase Irgm1在稳定表达tfLC3的RAW 264.7和tfLC3转导的Irgml中都被证明是不必要的-/-初级巨噬细胞，揭示了绕过Irgm1的新型p38 MAPK依赖性、STAT1非依赖性自噬途径。这些意想不到的发现有助于理解干扰素-γ诱导的巨噬细胞内自噬是如何被激活以进行炎症和宿主防御的。

简介

巨噬细胞参与许多重要的宿主功能，包括清除感染、组织稳态和修复以及消炎(1). II型干扰素（IFN-γ）在通过增殖1型T辅助细胞和NK细胞分泌后，仍然是原型巨噬细胞激活因子(2). IFN-γ通过JAK1和JAK2对STAT1的酪氨酸磷酸化启动其信号转导级联(三-5). 随后，STAT1二聚体与IFN刺激的反应元件结合，并诱导数百个IFN刺激基因的转录(三,4). 除了JAK-STAT1途径外，IFN-γ通过STAT1非依赖性途径诱导基因表达(5-7)并调节各种信号级联，包括MyD88(8)，第38页地图(9)，PI3K(10)和蛋白激酶C(11,12). 在巨噬细胞中，IFN-γ的主要免疫靶基因包括MHCⅠ类和Ⅱ类、炎症和致热细胞因子（TNF-α和IL-6）、趋化因子和抗菌蛋白，如诱导型一氧化氮合酶2（NOS2）、吞噬细胞氧化酶和免疫GTPases(三-5,13,14). 值得注意的是，干扰素-γ对细菌、原生动物、病毒和真菌的细胞自主先天免疫至关重要(14-16).

自噬已成为植物和动物王国的主要免疫防御途径(17,18). 在哺乳动物中，这种级联反应可由宿主衍生的细胞因子（如IFN-γ）或模式识别受体（包括TLR和核苷酸结合寡聚化域（NOD）样受体（NLR））诱导(18-24). IFN-γ诱导的自噬也可以通过免疫相关的鸟苷三磷酸酶（GTPase）家族的几个成员控制细胞内病原体（IRG蛋白，以前称为p47 GTPases）(16,19,20,25-28)最近由65kDa鸟苷酸结合蛋白家族（Gbps）成员(29). 小鼠IRG家族由17-20组成爱尔兰基因，其表达由IFN刺激的反应序列和γ激活序列驱动(30). 一种特殊的IRG蛋白Irgm1被吹捧为在IFN-γ诱导的自噬中发挥关键作用(20). Irgm1的人类同源基因IRGM(30)据报道，它们具有类似的生物学职责，其中可能包括有丝分裂(20,28). 然而，与小鼠不同的是，人类IRGM不是由IFN-γ引起的。相反，它的表达是由内源性逆转录病毒元件ERV9驱动的(30,31). 这增加了干扰素-γ诱导自噬的IRGM依赖性信号通路的可能性。

在这项研究中，我们生成了巨噬细胞，其中包含串联红色荧光蛋白（RFP）-绿色荧光蛋白（GFP）标记的LC3b（tfLC3）自噬体报告子的完整染色体拷贝(32). 这名记者利用了GFP（pK）的荧光损失一，6.0）但不是RFP（pK一，4.5）在溶酶体的酸性环境中标记自噬小室，在其成熟为自溶小体期间，自溶小室通过与内切体和溶酶体顺序或独立融合而形成(18). 此外，将串联荧光报告子引入Irgm1缺陷小鼠（Irgm1-deficient mice）的原代骨髓源巨噬细胞（BMM）中-/-)也证明了这种GTPase在自噬体生物发生的早期阶段是不存在的。我们的结果表明，IFN-γ不仅加速了自噬体的形成，而且也加速了其成熟，并且是通过与上述Irgm1相关的途径不同的途径实现的。该新途径使用JAK1/2和p38 MAPK信号，但不需要STAT1。我们的发现为在干扰素-γ诱导的自噬控制感染过程中寻找新的STAT1和Irgm1非依赖性基因提供了可能性。

材料和方法

老鼠

野生型（WT），STAT-/-和Irgm1-/-小鼠是在耶鲁大学医学院繁殖的，正如之前报道的那样，初级BMM是从小鼠中获得的(25). 所有的动物实验都是根据耶鲁大学处理和护理这些小鼠的机构指南进行的。

质粒和tfLC3巨噬细胞系

使用Lipofectamine LTX（Invitrogen，Carlsbad，CA）或Nucleofector系统（Amaxa Biosystems，Cologne，Germany）将mRFP-GFP-LC3b质粒（来自大阪大学Tamotsu Yoshimori博士的慷慨捐赠）转染到RAW 264.7小鼠巨噬细胞或原代BMM中，以稳定表达tfLC3。为了产生表达短发夹RNA（shRNA）的慢病毒载体pLKD.neo，以引物5′-CGAATTCTCCAATGCTGCAGCACGACCGTTCTCCAC-3′和5′-TGAATTCCGACCTCGGAGAC-3′为模板，以pLKO.1-puro/shGqα（Sigma，St Louis，MO）为模板，对人U6启动子片段进行PCR扩增。扩增子被消化Nru公司我和生态RI（Takara Bio Inc.，日本东京），然后克隆到pLKO.1-puro/shGqα以生成pLKD.pur载体。以引物5′-CGGATATCCCCGGATGAACAGAGAGG-3′和5′-GGGTACTCCAGAACTCGAGAACTCGTCAAGAGA-3′和pEGFP-N1（科罗拉多州帕洛阿尔托市克隆泰克）为模板，PCR扩增新霉素耐药基因。扩增子被消化巴姆HI和千磅我（Takara Bio Inc.）在克隆到pLKD.pur以获得pLKD.neo载体之前。随后，使用Addgene pLKO.1协议构建了pLKD.pur或pLKD.neo慢病毒(网址：www.addgene.org). RNAi序列如下：Atg7，5'-TTCTGCACGGTCGATAATG-3'；干扰素-γR1、5'-GCCAGATAAAGTAAGGTT-3'（shIFN-γR1-1）和5'-CACATATACAGCATTA-3’（shIFN-γR1-2）；STAT1、5'-CCGAAGAACTTCACTCTTA-3’（shSTAT1-1）和5'-TTGGCAAGAGCTGAACTATAC-3’（shTAT1-2）；Irgm1、5'-CGAGAAATCAAGAGATACAAA-3'（shIrgm1-1）和5'-CGCTATTTGGTAGTAT-3'（shSrgm1-2）。使用ViraPower慢病毒表达系统（Invitrogen）将病毒载体联合转染至293FT细胞（Invit罗gen）以产生慢病毒。使用产生的病毒上清液感染RAW 264.7细胞，然后用Puromycin或G418（Clontech）筛选稳定的敲除细胞。

试剂

重组小鼠IFN-γ购自R&D Systems（明尼阿波利斯，明尼苏达州）。p38 MAPK抑制剂、E64d和JAK抑制剂I购自Calbiochem（德国达姆施塔特）。LY294002是一种PI3K抑制剂，来自Cell Signaling（Danvers，MA）。Pepstatin A从Sigma中获得。

荧光染色

将RAW 264.7细胞或原代BMM用3%多聚甲醛在PBS中固定10分钟，用PBS洗涤3次，然后用DAPI（Invitrogen）染色以检测细胞核。使用尼康ECLIPSE Ti2000荧光显微镜（日本川崎尼康仪器公司）观察细胞。

蛋白质印迹

干扰素-γ处理后，用PBS清洗巨噬细胞，在缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5，1%Triton X-100，150 mM NaCl）加蛋白酶抑制剂混合物（德国曼海姆罗氏）中溶解，并在转移到聚偏氟乙烯膜之前对裂解液进行SDS-PAGE。用以下抗体进行Western blotting：兔抗Atg7多克隆抗体（pAb）（GeneTex，Irvine，CA）、小鼠抗LC3b单克隆抗体（2G6；Nano Tools，Hamburg，Germany）、兔抗NOS2兔pAb（ENZO Life Sciences，Plymouth Meeting，PA）、鼠抗GAPDH单抗（6C5；Santa Cruz Biotechnology）、，兔抗STAT1 pAb（GenScript，Piscataway，NJ）、兔抗磷酸化STAT1 p Ab（GenScript）、抗IFN-γR pAb、山羊抗Irgm1 pAb，HRP偶联抗鼠IgG抗体（宾夕法尼亚州西格罗夫市杰克逊免疫研究实验室）、HRP偶联抗兔IgG Ab（杰克逊免疫研究室）和HRP偶联对抗羊IgG阿布（圣克鲁斯生物技术）。以GAPDH和肌动蛋白的表达作为内部对照。使用ImageJ软件量化条带的强度。

结果

IFN-γ增强tfLC3报告巨噬细胞自噬体的生成

使用表达tfLC3（RAW-tfLC3）的克隆衍生RAW 264.7巨噬细胞，我们发现在使用IFN-γ（0.1-300 U/ml）治疗24小时后，自噬体的数量和大小均呈剂量依赖性增加(图1，A、 B类、和F类). 此外，时间进程分析显示，自噬体的形成在IFN-γ刺激（200 U/ml）约60分钟内开始，并在细胞因子治疗后2-6小时达到峰值(图1H（H）). 类似分析显示，IFN-γ促进自噬体成熟为自溶体（仅检测为RFP空泡），这一过程在IFN-γ刺激后2小时开始，稍晚在刺激后4-8小时达到峰值(图1，B、 G公司、和我). 通过提供针对核心自噬衔接蛋白Atg7的shRNA，这两个过程都可以被阻断，从而证实了二分报告者的忠实性(图1B-E公司). 这些结果表明，IFN-γ促进自噬体的形成，并通过典型的Atg途径使其成熟为自溶体。用抗LC3b单克隆抗体进行Western blotting证实，在用溶酶体蛋白酶抑制剂E64d和胃蛋白酶抑制素A处理IFN-γ处理的RAW 264.7细胞时，LC3b-I激活为LC3b-II，以防止LC3b在自溶体内降解(图1J型). 干扰素-γ治疗后2-4小时达到峰值。因此，我们在下面描述的遗传和药理学功能丧失实验中测量了IFN-γ诱导的自噬体的形成和成熟。

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IFN-γ增强tfLC3报告巨噬细胞的自噬体生物生成。一个，tfLC3报告器图。B-D公司将表达tfLC3的RAW-tfLC3细胞和稳定的Atg7敲除细胞与200 U/ml IFN-γ孵育24 h。固定细胞并用DAPI染色检测细胞核。显示了具有代表性的荧光图像，箭头或箭头分别表示自噬体或自溶体(B类). 形成自噬体的RAW 264.7细胞比例(C类)和自溶体(D类)如图所示。使用至少300个细胞计算比例，数值表示为三个独立实验的平均值±SD。E类用蛋白酶抑制剂混合物在细胞裂解缓冲液中对细胞进行裂解，然后对裂解产物进行SDS-PAGE分析和western印迹。F-I公司用200 U/ml或指示浓度的IFN-γ（圆形）或单独载体（方形）处理RAW-tfLC3 24 h或指示时间，然后固定。形成自噬体的RAW 264.7细胞比例(F类和H（H）)和自溶体(G公司和我)如图所示。使用至少300个细胞计算比例，数值表示为三个独立实验的平均值±SD。J型，在E64d加pepstatin A（每个10μg/ml）的存在下，用200U/ml IFN-γ处理RAW 264.7细胞指定的时间，然后用蛋白酶抑制剂混合物在细胞裂解缓冲液中裂解。随后，对细胞裂解物进行SDS-PAGE分析和蛋白质印迹。密度测定LC3b-II/GAPDH比值显示在印迹下方。

在IFN-γ刺激后早期，JAK1/2是自噬所必需的

IFN-γ与其受体的结合导致JAK1和JAK2的反式激活，STAT1分子的磷酸化和移位到细胞核，在细胞核中调节基因转录(5). 为了测试JAK是否是IFN-γ诱导自噬所必需的，我们用JAK抑制剂I，2-（1,1-二甲基乙基）-9-氟-3,6-二氢-7H-苯并咪唑[4,5-f]异喹啉-7-酮处理IFN-γ激活的RAW-tfLC3细胞。该抑制剂对JAK1-3（IC）具有高度选择性50以及酪氨酸激酶Tyk2，其在I型干扰素受体干扰素-αR下游运行。它完全消除了自噬体的形成和成熟，以及抗菌酶诱导型NOS2的表达，这是一个已知的JAK1/2靶基因，作为阳性对照(图2). 因此，JAK1/2似乎专为促进自噬诱导的干扰素-γ下游的早期信号级联而设计。

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IFN-γ刺激后早期自噬需要JAK1/2。A-C公司用JAK抑制剂I再处理RAW-tfLC3或不处理2 h，然后用200 U/ml IFN-γ刺激细胞4 h。细胞固定并用DAPI染色以检测细胞核。显示了典型的荧光图像，箭头或箭头分别表示自噬体或自溶体(一个). 形成自噬体的RAW 264.7细胞比例(B类)和自溶体(C类)如图所示。使用至少300个细胞计算比例，数值表示为三个独立实验的平均值±SD。D类用蛋白酶抑制剂混合物在细胞裂解缓冲液中对细胞进行裂解，然后对裂解产物进行SDS-PAGE分析和western印迹。印迹下方显示了密度测定磷酸化STAT1/STAT1比率。

STAT1和Irgm1对IFN-γ刺激的自噬激活不起作用

在经典的干扰素-γ信号级联中，JAK1/2激活导致STAT1磷酸化和转位到细胞核以激活靶基因，如Irgm1(25)后者被认为是刺激自噬反应的主要成分(19,20). 因此，我们通过将慢病毒pLKD shRNAs引入RAW-tfLC3报告细胞系中，以获得稳定的巨噬细胞，这些巨噬细胞不仅表达tfLC3，而且对STAT1或Irgm1也沉默。此外，我们生成了第三组稳定的RAW-tfLC3巨噬细胞克隆，作为稳健的阴性对照。

该分析系统使我们能够确定STAT1和Irgm1在宿主细胞未通过转染siRNA池的TLR或NLR感应瞬时激活的情况下是否在功能上参与诱导自噬(29). IFN-γ刺激的自噬体形成和成熟仅在IFN-γR1-silenced细胞中受到抑制；STAT1和Irgm1沉默对自噬体诱导没有任何影响(图3，A至E). 相反，在IFN-γR1、STAT1和Irgm1-shRNA-表达RAW-tfLC3巨噬细胞系中，内源性Irgm1的表达被完全阻断(图3F类). 对于三个shRNA靶基因中的每一个，用两个独立的shRNA-表达RAW-tfLC3克隆获得了相同的结果。使用C57BL/6野生型STAT1的主要BMM也观察到类似结果-/-和Irgm1-/-用tfLC3质粒进行核孔化的小鼠(图3，G-I公司). 自噬体的形成和在最初4-6小时内的成熟在基因型之间是相同的，内源性LC3b-I转化为LC3b-II也是一样的(图3J型和图4E类). 因此，我们的基因功能丧失结果表明，IFN-γ可以以STAT1-和Irgm1-非依赖性的方式激活巨噬细胞自噬。

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STAT1和Irgm1不适合通过IFN-γ刺激激活自噬。A-C公司和G-I公司用200 U/ml IFN-γ刺激RAW 264.7细胞、稳定敲除细胞和表达tfLC3的骨髓基质细胞4小时。细胞固定并用DAPI染色以检测细胞核。显示了具有代表性的荧光图像，箭头或箭头分别表示自噬体或自溶体(一个和G公司). 形成自噬体的RAW 264.7细胞比例(B类和H（H）)和自溶体(C类和我)如图所示。使用至少300个细胞计算比例，数值表示为三个独立实验的平均值±SD。D-F公司和J型用蛋白酶抑制剂混合物在细胞裂解缓冲液中对细胞进行裂解，然后对裂解产物进行SDS-PAGE分析和western印迹。密度测定LC3b-II/GAPDH比值显示在印迹下方。

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通过IFN-γ刺激激活自噬需要PI3K和p38 MAPK。A-D公司用指示浓度的PI3K抑制剂或p38 MAPK抑制剂预处理RAW-tfLC3细胞2h，然后用200 U/ml IFN-γ刺激细胞4h。固定细胞并用DAPI染色检测细胞核。显示了典型的荧光图像，箭头或箭头分别表示自噬体或自溶体(一个). 形成自噬体的RAW 264.7细胞比例(B类)和自溶体(C类)如图所示。使用至少300个细胞计算比例，数值表示为三个独立实验的平均值±SD。用蛋白酶抑制剂混合物在细胞裂解缓冲液中对细胞进行裂解，然后对细胞裂解产物进行SDS-PAGE分析和western印迹(D类).E类和F类，来自WT的BMM，Irgm1-/-，或STAT1-/-用200 U/ml IFN-γ处理小鼠6小时或指定时间。用蛋白酶抑制剂混合物在细胞裂解缓冲液中对细胞进行裂解，然后对细胞裂解产物进行SDS-PAGE分析和western印迹。密度测定LC3b-II/GAPDH和磷酸化比率显示在印迹下方。

PI3K和p38 MAPK是通过IFN-γ刺激激活自噬所必需的

上述发现表明IFN-γ诱导的自噬是一种非常规途径。除了经典的JAK1/2-STAT1信号级联外，IFN-γ还激活其他几个下游通路。其中包括p38 MAPK(9)和PI3K信号级联(6,10). 尤其是后一个级联反应包括一些关键的自噬调节因子，特别是雷帕霉素（mTOR）的丝氨酸/苏氨酸激酶哺乳动物靶点以及I类和III类PI3Ks(33). I类PI3Ks磷酸化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PtdIns(4,5)P（P）2)在质膜上生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PtdIns(三,4,5)P（P）三)，激活mTOR(33-35). VPS34，一种III类PI3K，在氨基酸丰富时也有助于mTOR的激活。然而，在饥饿或细胞因子激活的条件下，它的作用是不同的，在饥饿或细胞因子激活的条件下，它磷酸化子宫内膜中的PtdIns，产生磷脂酰肌醇-3-磷酸（PtdIns3P），这是募集Beclin-1/Atg6刺激自噬所需的(33,34). 两种PI3K抑制剂，3-甲基腺嘌呤和LY294002，已被证明可以抑制自噬(33)LY294002也完全阻断了IFN-γ诱导的RAW-tfLC3巨噬细胞自噬(图4，A-C公司). 然而，有趣的是，它并没有改变IFN-γ诱导的NOS2或Irgm1表达(图4D类)表明这些途径存在功能分歧。

p38 MAPK活性的检测进一步加强了这种分叉。p38 MAPK的特异性抑制剂4-[4-（4-氟苯基）-2-（4-甲基亚磺酰基苯基）-1H（H）-咪唑-5-yl]吡啶完全阻断自噬，但对IFN-γ激活后NOS2和Irgm1的表达没有影响(图4，A-D公司). 野生型STAT1再次强调了这种分歧-/-和Irgm1-/-BMM公司(图4E类和F类). 早期IFN-γ诱导的p38磷酸化以及其他MAPK成员Erk1/2和应激激活蛋白激酶（SAPK）/JNK在Irgm1中仍然保持不变-/-BMM与正常自噬体和自溶体形成相一致(图3，G-J公司和​和4E类).4E类). 这些结果表明PI3K和p38 MAPK都是激活Irgm1非依赖性自噬所必需的。

讨论

先前有报道称，IFN-γ诱导的自噬小体形成基于RAW 264.7细胞中GFP-Irgm1的短期过度表达或短暂siRNA沉默而征募Irgm2(19,20). 通过使用稳定整合到RAW 264.7巨噬细胞染色体上的双色tfLC3报告子，结合遗传或药理学功能丧失方法，我们发现IFN-γ不仅通过JAK1/2和p38 MAPK信号通路促进自噬体的形成，而且促进其成熟。

在本研究中，我们发现了使用Irgm1的主BMM的永久性函数损失方法-/-小鼠或RAW 264.7巨噬细胞稳定表达双tfLC3自噬体-自溶体报告子和Irgm1 shRNAs，表明该IRG蛋白在自噬早期是不必要的。我们的发现提出了Irgm1是否是真诚地自噬基因或它是否具有额外的溶酶体运输功能，以对抗病原体，如结核分枝杆菌与克罗恩病相关大肠杆菌根据几项研究的建议(25,28,35). 最近有证据表明，与野生型对照组相比，Irgm1缺陷小鼠与GFP-LC3b转基因动物杂交后，髓系干细胞前体中LC3b点的诱导实际上提高了，而不是受损(36). 因此，Irgm1作为干扰素-γ诱导自噬级联反应的一部分的确切作用需要进一步阐明。在这方面，它反映了IRG家族的另一个成员Irga6，它瞄准并破坏了弓形虫自噬蛋白Atg5以自噬体诱导依赖的方式帮助寄生液泡(37). 因此，IRG除了在感染和炎症环境中自噬外，还可能发挥多种贩运和信号传递功能。

据报道，MAPK家族成员可以被干扰素刺激激活(5,9,38,39). 此外，通过IFN-γ激活Erk2，以及可能的其他MAPK，是由JAK2和富含脯氨酸的酪氨酸激酶2（Pyk2）介导的(40). 我们对IFN-γ诱导的自噬的分析也表明JAK1/2和p38 MAPK依赖性，而STAT1独立性。自噬用于降解侵入细胞内的微生物(18,41). 综上所述，这些结果表明IFN-γ通过JAK2/Pyk2/MAPK信号通路诱导的自噬激活有助于宿主防御。在STAT1中，干扰素-γ下游可表达多达100-150个基因-/-成纤维细胞。其中包括胱天蛋白酶7-样Lice-2、IL-1β、Daax和丝氨酸蛋白酶PIM-1，它们协调可能对自噬刺激的凋亡/焦蛋白脱失反应(7). 同样，其他基因靶点可能通过STAT1非依赖性、PI3K依赖性信号传导进行，如在人外周血单核细胞中所见(6). p38 MAPK的需求与最近的观察结果一致，即该途径调节p38IP与Atg9的结合，从而将其贩运到新生的自噬体(42). 因此，我们的研究结果可能鼓励人们关注干扰素-γ诱导的靶基因子集，这些靶基因可以在参与p38 MAPK的同时以STAT1非依赖方式转录途中刺激自噬体的形成。这些努力应该对理解感染的自噬和基于细胞因子的免疫具有广泛意义。

致谢

我们感谢Tamotsu Yoshimori（日本大阪大阪大学）慷慨捐赠mRFP-GFP-LC3质粒。

脚注

1这项工作得到了挑战性探索研究拨款22659088（给T.M.）、美国国立卫生研究院NIAID RO1 AI068041-01A1、BWF传染病发病机制研究者奖和W.W.Winchester基金会（给J.D.M.）的支持。

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