p38αMAPK通过mAtg9和p38IP对自噬的协调调节

通过与mAtg9的相互作用将p38IP定位到膜上

p38IP与mAtg9的胞质点状共定位表明，p38IP的群体是膜相关的。我们假设这种定位可能部分归因于它与mAtg9的相互作用。通过两种方法测试p38IP膜结合中mAtg9的需求。我们首先使用mAtg9的过表达来测试这是否会通过亚细胞分级增加膜上p38IP的数量(图2A). 从HEK293A细胞的裂解液中制备PNS，该细胞瞬时转染HA–p38IP或与RFP–mAtg9联合转染。通过离心分离细胞膜和胞液后，我们观察到p38IP在胞液和膜颗粒之间分隔。mAtg9的过表达导致p38IP胞浆库的耗竭和膜沉淀的增加。接下来，我们使用siRNA去除HEK293细胞中的mAtg9，并分析p38IP在细胞溶质池和细胞核之间的分布(图2B). 我们观察到，在mAtg9缺失的细胞中，p38IP的核质比显著增加。这些结果支持了p38IP通过与mAtg9的相互作用与膜相关的观点。

我们实验室以前的研究表明，mAtg9位于相邻的核区域，与反式-高尔基网络（TGN）和外周内体。饥饿后，mAtg9的并列核池减少，留下一个分散的外周池，与Rab7和GFP–LC3共存，后者是自噬体的标记(年轻等, 2006). 为了测试p38IP和mAtg9共同定位对饥饿的敏感性，HEK293细胞在全培养基或饥饿培养基（Earle’s缓冲盐水溶液（EBSS））中培养。HA–p38IP和mAtg9在全培养基和EBSS中均存在共定位(图2C). 此外，细胞核中p38IP的数量不受饥饿的影响(图2B). 为了证实mAtg9和p38IP相互作用中不存在饥饿依赖性改变，使用喂养或饥饿细胞的裂解物进行了联合免疫沉淀实验。内源性mAtg9或RFP–mAtg9HA–p38IP的免疫沉淀不受饥饿的影响(图2D)，确认共同本地化数据。

饥饿诱导的mAtg9贩运需要p38IP

为了研究p38IP是否在mAtg9运输中发挥作用，在诱导饥饿之前，用针对p38IP的siRNA转染HEK293A细胞72小时。通过RT-PCR测定p38IP siRNA介导的敲除水平(补充图S2). 正如我们之前的结果所预期的那样，在用对照siRNA处理的细胞中，mAtg9在全培养基中位于相邻的核位置，并在饥饿时分散(图2E). 然而，在p38IP缺失细胞中，mAtg9并没有从相邻核池重新分布到外周池。这一结果证明了p38IP在饥饿诱导的mAtg9贩运中的需求，并提示p38IP可能在自噬中起作用。

p38IP是饥饿诱导自噬所必需的

为了验证p38IP在饥饿诱导的自噬中的作用这一假设，我们监测了添加和不添加leupeptin的EBSS中LC3的脂化。LC3或GFP–LC3在自噬诱导后被脂化，导致分子量的可量化变化和向点状自噬体结构的移位(水岛，2004年). 我们首先使用稳定表达GFP–LC3（293/GFP–LC3；陈等, 2007)量化p38IP缺失后饥饿中形成的自噬体数量(图3A). 用对照或p38IP siRNA处理293/GFP–LC3细胞72小时后，在全培养基或EBSS中培养2小时，并分析GFP–LC 3的定位。在对照siRNA处理的细胞中，饥饿2小时后观察到大量自噬体。添加白肽以抑制溶酶体蛋白酶并积累自噬体，从而区分对自噬形成和周转的影响。p38IP siRNA介导的缺失在全培养基中没有影响，然而，饥饿后GFP–LC3阳性自噬体的数量显著减少(图3A).

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图3

哺乳动物自噬需要p38IP。(A类)用对照或p38IP siRNA转染293/GFP–LC3细胞。转染后72小时，将细胞在全培养基（FM）、全培养基中培养2小时，其中全培养基含有亮氨酸肽（FM-Leu）、EBSS（ES）或EBSS含有亮氨酸蛋白酶肽（ES-Leu。GFP–LC3阳性自噬体数量的量化是通过盲法实验中的计数进行的。条形=5μm（数据表示为60个细胞的平均值±标准偏差，^***P（P）=0.0002，学生t吨-测试）。(B类)用siRNA对照、p38IP的siRNA和ULK1的siRNA转染HEK293A细胞。使用抗LC3抗体或使用抗ULK1抗体进行免疫印迹，通过SDS-PAGE分析细胞裂解产物的内源性LC3脂质氧化。(C类)用siRNA对照转染HeLa细胞，并用siRNA转染p38IP。在如（A）中孵育2小时后，用抗LC3和抗肌动蛋白抗体对样品进行免疫印迹。对内源性LC3II/LC3I水平进行量化，并将比率表示为任意单位。在（B）中，n个=4,^***P（P）=<0.0001和^*P（P）=0.0324，学生t吨-测试。在（C）中，数据代表了两个实验。(D类)用siRNA对照或siRNA p38IP转染293/GFP–LC3细胞，并在全培养基中培养，或在EBSS中培养2和4小时。样本用抗p62抗体进行免疫印迹，肌动蛋白作为负荷对照。(E）用HA–p38IP或myc–ULK1 C末端结构域（CTD）转染HEK293A细胞。24小时后，用[¹⁴C] 缬氨酸如材料和方法部分所述，并在全培养基或EBSS中培养2 h。然后收集细胞并分析其长期蛋白质降解（数据表示为三倍的平均值±标准差，代表两个实验，EBSS模拟与EBSS HA–p38IP(^***P（P）=0.036); EBSS模拟与ULK1 CTD(^***P（P）=<0.0001）；学生t吨-测试）。

为了进一步量化抑制程度，我们分析了用对照或p38IP siRNA处理的293/GFP-LC3细胞中GFP-LC3II的表现(补充图S3)而在用p38IP siRNA处理的细胞中，饥饿状态下GFP–LC3II的水平显著降低。接下来，我们通过HEK293A和HeLa细胞内源性LC3脂质过氧化，分析了p38IP缺失对自噬的影响(图3B和C). ULK1是酵母Atg1的哺乳动物同源物，是这些细胞系中饥饿诱导自噬所必需的(陈等, 2007)并将该蛋白的缺失作为阳性对照。在HEK293A和HeLa细胞中，p38IP缺失导致了leupeptin对EBSS中LC3II的抑制(图3B和C分别）。在HEK293细胞中，这种抑制作用相当于ULK1缺失所观察到的50%。通过转染抗siRNA的HA–p38IP结构，可以恢复siRNA介导的p38IP缺失(补充图S4). 然后使用LC3非依赖性自噬测量进一步评估p38IP的需求。我们监测了p62/SQSTM1的水平，这是一种LC3结合蛋白，在自噬体中被隔离和降解(克林斯基等, 2008). 如所示图3Dp38IP的siRNA-缺失导致饥饿期间p62/SQSTM1降解受到抑制。综上所述，这些结果表明p38IP是饥饿诱导自噬所必需的。

我们假设p38IP水平可能通过其与mAtg9的结合对自噬的调节很重要，并且p38IP的过度表达可能导致自噬流量的不平衡。我们评估了长期蛋白质降解对p38IP过度表达的影响。正如之前的结果所预期的那样，在饥饿细胞中，我们发现长期蛋白质降解增加了两到三倍。p38IP过度表达后，这种饥饿依赖性增加显著减少(图3E). 抑制程度与ULK1（一种有效的自噬抑制剂）的C末端结构域过度表达后观察到的抑制程度相当(陈等, 2009).

p38的激活抑制饥饿诱导的自噬

p38IP与p38α结合，是激活p38α所必需的体内(佐恩（Zohn）等, 2006)，我们分析了p38 MAPK激活对自噬途径的影响。293/GFP–LC3细胞用茴香霉素（一种蛋白质合成抑制剂）预处理30分钟，或紫外线照射3分钟，然后恢复40分钟(Raingeaud公司等, 1995，哈扎林等, 1998，康等, 2006)激活p38 MAPK。如所示图4A，茴香霉素和紫外线照射均抑制EBSS中GFP–LC3阳性自噬体的形成，并抑制含有亮氨酸肽的EBSS中293/GFP–LC 3细胞的自噬小体的形成。两种处理对全培养基中的细胞均无影响。接下来我们询问p38的激活是否也导致mAtg9分布的改变。如所示图4B在茴香霉素处理或紫外线照射后，EBSS中的mAtg9分散受到抑制。由于我们假设p38IP通过mAtg9与膜相关，并且mAtg8的分布在p38激活后发生改变，因此我们询问茴香霉素是否同样改变了p38IP的膜相关。我们发现茴香霉素治疗后p38IP的膜相关池减少(补充图S5)表明p38激活后，p38IP与mAtg9的相互作用也降低。

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图4

p38的激活抑制自噬和mAtg9的运输。(A类)用10μM茴香霉素处理293/GFP–LC3细胞30分钟，或暴露于紫外线照射下3分钟，然后恢复40分钟，并在全培养基、全培养基（含亮氨酸肽）、EBSS或EBSS（含亮酸肽）中孵育2小时。然后用共聚焦显微镜对细胞进行固定和可视化。每个细胞的GFP–LC3阳性结构按图3A棒材=5μm。数据表示为平均值±标准误差。n个=60个细胞，模拟与茴香霉素EBSS(^***P（P）=<0.0001); 模拟与UV EBSS(^***P（P）=<0.0001); 模拟与茴香霉素EBSS和亮氨酸蛋白酶(^***P（P）=<0.0001); 模拟与EBSS与亮氨酸肽UV(^***P（P）=<0.0001). 所有分析均使用Student’st吨-测试。(B类)HEK293A细胞用10μM茴香霉素预处理30分钟，或紫外线照射3分钟，然后恢复40分钟，然后在EBSS中培养2小时图2E棒材=5μm。数据表示为60个细胞的平均值±标准偏差，EBSS模拟值与EBSS茴香霉素(^*P（P）=0.0142); EBSS模拟与EBSS UV(^*P（P）=0.0150); 学生的t吨-测试。

为了量化p38 MAPK激活对自噬的影响，在p38激活后饥饿2小时，测量GFP–LC3II水平。我们发现茴香霉素治疗降低了GFP–LC3II水平(图5A). 当p38被紫外线照射激活时，也观察到对GFP–LC3II水平的类似影响（数据未显示）。为了确定p38激活是否也影响细胞的自噬蛋白水解能力，我们检测了对长寿命蛋白降解的影响。在饥饿前30分钟和饥饿期间用茴香霉素激活p38时，我们观察到蛋白质降解的抑制作用，与leupeptin的抑制作用相当(图5B). 综上所述，这些结果表明，激活p38能够抑制饥饿诱导的mAtg9扩散和自噬。

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图5

p38IP在p38α依赖性自噬抑制中的作用。(A）293/GFP–LC3细胞在完全培养基或EBSS中培养前，用10μM茴香霉素预处理30分钟。使用抗LC3抗体通过SDS-PAGE分析细胞裂解物的GFP-LC3脂质化。用抗β-微管蛋白检测膜。GFP–LC3脂质化被量化为GFP–LD3II/GFP–LC3I的量（数据表示为三倍的平均值±标准差，P（P）=0.0091，学生的t吨-测试）。(B）HEK293A电池标有[¹⁴C] 如材料和方法一节所述，缬氨酸用10μM茴香霉素预处理30分钟，然后在全培养基、EBSS或EBSS中与亮氨酸肽孵育2小时。然后对细胞进行长期蛋白质降解分析（数据表示为三倍的平均值±标准偏差，代表两个实验，未经处理的EBSS和经茴香霉素处理的(P（P）=0.0363); EBSS未治疗与亮蛋白肽治疗(P（P）=<0.0001），学生的t吨-测试）。(C）用p38IP的对照siRNA或siRNA转染HEK293细胞。培养24小时后，用茴香霉素预处理对照细胞或p38IP缺失细胞，然后用全培养基培养2小时，用leupeptin、EBSS或EBSS和leupepting培养2小时。用抗p38α或抗LC3抗体分析细胞裂解物。对LC3II/LC3I水平进行量化，并将其归一化为EBSS中培养的未经处理的对照细胞。数据代表了两个实验。(D类)瞬时转染HA-p38IP和RFP-mAtg9的HEK293A细胞用茴香霉素处理30分钟，mAtg8被免疫沉淀。5%的裂解物或免疫沉淀物用抗HA和抗mAtg9抗体进行了检测（数据代表3个实验，^*P（P）=0.0332).

接下来我们询问p38激活后自噬的减少是否受到p38IP的调节。先前研究表明，p38IP的丢失会导致磷酸化p38α及其下游效应物ATF2和CREB的减少(佐恩（Zohn）等, 2006). 因此，我们预测p38IP的丢失将导致茴香霉素对自噬的抑制减少。然而，由于自噬对p38IP的需求，该实验变得复杂。通过监测LC3II的形成，如图5C我们发现p38IP的siRNA缺失抑制了LC3II的形成，茴香霉素治疗也是如此。p38IP和茴香霉素的siRNA缺失的联合作用导致LC3II的形成受到抑制，与单独治疗的效果相当。缺乏加性效应表明p38α和p38IP在同一途径中发挥作用。

为了扩大这些结果，我们在我们的细胞模型中检测了p38IP缺失对p38α磷酸化的影响。Zohn公司等(2006)研究表明，p38IP的缺失降低了突变小鼠胚胎中的p38α磷酸化。为了测试我们的系统中磷酸化p38α水平是否受到p38IP缺失的影响，我们在p38IP的siRNA缺失后，在茴香霉素治疗后检测磷酸化p38-α。令人惊讶的是，在没有p38IP的情况下，我们没有观察到p38α的磷酸化降低(补充图S6A).

此外，如所示图3Ep38IP的过度表达抑制了长期蛋白质降解。因此，为了确定p38IP过度表达对p38α磷酸化的影响，我们分析了p38IP过表达磷酸化p38α后未经处理或用茴香霉素处理的细胞(补充图S6B). p38IP的过度表达并没有显著影响磷酸化p38α的水平，也没有改变茴香霉素治疗后磷酸化p38-α的水平。因此，在我们的细胞模型中，在p38IP缺失或p38IP过度表达后，茴香霉素激活的磷酸p38α池仍然存在，p38IP的过度表达不会导致磷酸p38β的增加。

p38α调节p38IP的定位并与mAtg9结合

我们的数据表明，p38α是自噬的负调控因子，并暗示其抑制作用不受p38IP依赖性激活p38α磷酸化的调节，而可能受与p38IP的磷酸化依赖性相互作用的调节。因此，p38α的异位激活可能会导致p38IP定位的改变。茴香霉素治疗可增加磷酸化p38α池，并导致膜上p38IP的丢失(补充图S5)表明p38IP细胞溶质池的增加是由于与p38α相互作用的增加。为了验证这一点，我们确定当磷酸化p38α池增加时，p38IP与p38α的相互作用是否增加。我们用茴香霉素处理细胞，用磷酸特异性抗体免疫沉淀磷酸化p38α，并检测p38IP(补充图S6C). 在茴香霉素治疗后，我们免疫沉淀了更多的磷酸p38α，而联合免疫沉淀了成比例增加的p38IP。此外，茴香霉素治疗后，与mAtg9共免疫沉淀的p38IP数量减少(图5D).

由于p38α的激活导致膜上p38IP的丢失，我们询问p38α是否调节p38IP与mAtg9的结合。用Flag–p38α、HA–p38IP和RFP–mAtg9的组合转染HEK293A细胞，并用抗mAtg8抗体进行免疫沉淀。p38IP与mAtg9共同免疫沉淀(图6A，车道9）。然而，HA–p38IP和RFP–mAtg9之间的相互作用因Flag–p38α的过度表达而丢失(图6A，第8和6B车道，第6车道）。有趣的是，在表达RFP–mAtg9和Flag–p38α的细胞中，还观察到p38α与mAtg9共同免疫沉淀(图6A，通道7），HA–p38IP的过度表达减弱了这种相互作用(图6A，车道8）。通过p38IP免疫沉淀进行交互实验(图6B). 在所有三种蛋白的过度表达中，mAtg9与HA的结合减少–p38IP，而p38α的结合不受影响(图6B，第6和第7车道）。这些结果表明，p38α对p38IP的亲和力大于mAtg9对p38IP的亲和力，并且p38α可以与mAtg8竞争p38IP相互作用。综合这些结果表明，p38α调节p38IP与mAtg9的结合，这种差异结合可能是p38α控制自噬的机制。为了支持这一点，p38α的过度表达导致p38IP从mAtg9中募集，也可以预测抑制自噬。如所示图6Cp38α在HEK293A细胞中的过度表达显著抑制了饥饿诱导的LC3II形成。

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图6

p38α的过度表达抑制自噬，并与mAtg9竞争与HA–p38IP的结合。(A）用RFP–mAtg9和Flag–p38（泳道2和7）、RFP–mAtg9、Flag–p38和HA–p38IP（泳道3和8）或RFP–mAtg9和HA–p38IP（泳道4和9）转染HEK293A细胞。用抗mAtg9抗体免疫沉淀RFP–mAttg9，用抗HA抗体检测共同免疫沉淀的HA–p38IP，用抗Flag抗体检测联合免疫沉淀的Flag–p38。用抗Atg9抗体检测到RFP–mAtg9。(B类)用RFP–Atg9和HA–p38IP（泳道1和5）、RFP–mAtg9、Flag–p38和HA–p38IP（泳道2和6）或Flag–p38和HA–p38IP（泳道3和7）转染HEK293A细胞。用抗HA抗体免疫沉淀HA–p38IP，用抗Atg9抗体检测共同免疫沉淀的RFP–Atg9，用抗p38α抗体检测联合免疫沉淀的Flag–p38。用抗HA抗体检测HA–p38IP。(C类)用Flag–p38α转染HEK293A细胞24小时。细胞在完全培养基、EBSS或EBSS加leupeptin中培养2小时，裂解，并使用抗LC3抗体分析内源性LC3脂质化，并用抗Flag抗体进行免疫印迹。LC3脂质化被量化为LC3II/LC3I的量（数据表示为三倍的平均值±s.e.m，n个=2个实验，EBSS对照组与带有Flag-p38α的EBSS，^***P（P）=0.0026).

p38α通过mAtg9和p38IP协调调节自噬

根据我们的数据，我们提出了一个模型，旨在解释我们的结果，并建议mAtg9贩运在调控依赖饥饿的自噬中的作用(图8). 我们认为，在完全培养基中，p38α池被磷酸化并结合p38IP。在这些条件下，mAtg9在相邻核池和外周内体之间进行运输。p38IP也与外周内胚体上的mAtg9结合，该结合库与磷酸化p38α结合库平衡。我们推测，自噬发生的基本速率较低，因为磷酸化p38α结合p38IP的亲和力高于mAtg9。与p38IP结合的磷酸-p38α也可能抑制mAtg9的贩运。饥饿时，氨基酸水平降低会导致p38α磷酸化水平降低。p38IP对去磷酸化p38α亲和力的降低可能有利于p38IP与mAtg9之间的相互作用。p38IP和mAtg9之间平衡的改变，或者磷酸化p38α抑制作用的丧失，都会使mAtg九通过交通形成自噬体，导致自噬增加。我们还推测，当氨基酸库得到补充，促进p38α的磷酸化并恢复p38α、p38IP和mAtg9之间的原始平衡时，就会从饥饿中恢复（数据未在模型中显示）。在最初的恢复期内，p38IP可以在自噬体上与mAtg9分离，从而使mAttg9再循环到内体。

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图8

通过mAtg9、p38IP和p38 MAPK调节自噬的模型。在全培养基中，mAtg9在TGN和内体之间运输。磷酸化p38α抑制自噬。p38IP存在于外周内胚体的mAtg9池中，并与p38α复合。需要注意的是，p38α–p38IP的两个池是相同的，为了清楚起见，它们是分开显示的。在饥饿状态下，p38α被去磷酸化，以较低的亲和力结合p38IP，并且不能再抑制自噬（如虚线所示）。p38α释放的p38IP池将促进mAtg9的贩运和自噬。

p38α活化受营养素调节并调节p38IP与mAtg9的结合

为了支持我们的模型，p38α在氨基酸刺激下被激活(塔拉德拉斯之家等, 2008)这与我们的研究结果一致，即全培养基中磷酸化p38α的水平高于饥饿2小时后的水平(补充图S6). 我们已经表明，当p38α被激活时，与膜相关的p38IP水平降低，并且预测可用于结合mAtg9的p38IP数量更少。我们还表明，茴香霉素激活p38α导致p38α–p38IP复合物增加。为了支持在富含营养的条件下p38α优先结合p38IP的假设，我们发现当p38α、p38IP和mAtg9过度表达时，mAtg9-p38IP复合物水平降低。我们认为这是由于与p38IP结合的直接竞争，而不是由p38α磷酸化mAtg9或p38IP调节的相互作用减少，因为从细胞裂解物中沉淀的p38IP或mAtg8免疫沉淀均未被重组活化的p38α磷化（JW和ST，未发表的观察结果）。

为了进一步支持这一假设，全培养基中p38α的siRNA缺失导致mAtg9从反式-高尔基网络，p38IP的膜相关池增加，LC3II水平增加。综上所述，这些数据表明，p38α在全培养基中起着负向调节p38IP–mAtg9相互作用的作用，从而阻止mAtg8重新分布到自噬体，从而控制供体细胞自噬水平。

通过p38IP与Atg9结合诱导自噬

我们已经证明，在饥饿条件下，mAtg9贩运需要p38IP。在p38IP缺失的细胞中，mAtg9仍存在于反式-高尔基体网络和LC3脂质化受到抑制。此外，我们观察到，在迄今为止测试的任何条件下，p38IP和mAtg9都不会在并置核区共存。因此，我们假设mAtg9和p38IP在内切体中相关，并且在饥饿期间，当p38IP的p38α结合池减少时，外周内切体池中与p38IP相关的mAtg9-增加，而不是返回TGN mAtg9.被转运到自噬体。然而，我们没有观察到饥饿期间HA–p38IP与mAtg9的结合增加(图2D)正如我们的模型所预测的那样。对此结果的一个合理解释是，HA–p38IP的过度表达可能会改变p38IP–mAtg9和p38IP-p38α池，我们推测HA–p28IP的过表达可能会克服饥饿诱导的p38IP与去磷酸化p38α结合的减少。我们已经证明，p38α的过度表达可以恢复p38IP和p38α之间的相互作用，从而导致mAtg9–HA–p38IP相互作用的中断(图6A和B). 由于我们无法开发出抗p38IP的抗体，我们无法研究内源性p38IP与mAtg9的营养依赖性相互作用。

以前的数据表明，激活的p38α存在于内体上并调节内吞作用(卡瓦利等, 2001；德尔克鲁瓦等, 2003；Pelkmans公司等, 2005；沃尔奇利等, 2008). 虽然我们在我们的细胞系中观察到大多数p38α是细胞溶质，但我们发现p38的激活增加了与p38IP结合的p38α的数量，并减少了与膜相关的p38IP的数量。需要进一步研究以确定结合p38IP的p38α激活池的位置。然而，如我们所示，当mAtg9在全培养基中组成性循环时，它与晚期内体共定位，我们推测mAtg8可能暂时与该隔室上的p38IP结合，但可能不会被p38IP保留并返回TGN。在饥饿过程中，随着p38α被去磷酸化，p38α–p38IP的相互作用减少，我们推测内体上的p38IP–mAtg9相互作用会增加并促进自噬，尽管这一点仍有待直接证实。我们的数据依赖于p38IP的过度表达，这可能会改变mAtg9、p38IP和p38α之间的平衡。然而，为了支持这一点，我们发现茴香霉素抑制mAtg9在外周池中的滞留，并抑制LC3II的形成和饥饿条件下的自噬。

或者，饥饿后，mAtg9可以与ULK1等蛋白质或受ULK1活性调节的蛋白质相互作用，并保留在内体上，从而使p38IP被招募到该隔室中。为了支持这一点，我们发现ULK1的缺失抑制了mAtg9在外周池中的保留。然而，还需要进一步的实验来确定ULK1如何以及在何处对mAtg9产生影响，以及这是否对p38α的激活敏感。此外，通过研究酵母Atg9p的分布，可以深入了解p38α如何调节来自内体的mAtg9转运。有趣的是，已有研究表明，渗透胁迫诱导自噬需要HOG1，即酵母p38αMAPK同源序列。然而，到目前为止，在酵母中还没有发现明显的p38IP同源序列，这表明酵母中的调节可能与哺乳动物细胞不同。

抗体和荧光试剂

在注射C末端20 aa的仓鼠中产生了单克隆抗mAtg9抗体年轻等(2006)从NEB（UK）获得单克隆抗p38和多克隆抗磷酸p38抗体。多克隆抗Stx6抗体购自Synaptic Systems。单克隆抗Flag M2和单克隆抗肌动蛋白抗体购自Sigma Aldrich（美国）。从Covance（UK）获得单克隆抗HA抗体。多克隆抗SOD抗体购自Abcam。从CRUK获得多克隆抗MPR抗体，从Santa Cruz Biotechnology购买单克隆抗p62抗体。抗β-微管蛋白多克隆抗体来自Abcam。荧光二级抗体购自分子探针（Invitrogen）。

DNA构建物

HA–p38IP和Flag–p38的质粒是来自贾怀汉（加州斯克里普斯研究所）的礼物，之前的描述是佐恩（Zohn）等(2006)使用带有HA标签的引物将CT和NT-p38IP构建物扩增到pcDNA 3.1载体中。单体RFP–mAtg9之前由年轻等(2006).

酵母双杂交筛选

酵母双杂交筛选由赫尔辛基大学酵母双杂交核心设施进行。mAtg9 C末端结构域（残基1489-2520）被克隆到pGBKT7中。使用克隆到pACT2中的人肝脏文库进行筛选。使用Matchmaker 2-杂交系统3（Clonetech）进行定向酵母双杂交分析。在SD-trp/leu板上选择转化子。在30°C下放置3天后，SD-trp/leu/his板上的生长显示了这种相互作用。

siRNA敲除

siRNA双链（HP GenomeWide siRNA）是从Qiagen和Dharmacon中获得的。RT-PCR对p38α具有最有效敲除水平的双链特异性，对应于：Hs_MAPK14_3_HP 5′-CAGTCCATTCATGCGAAA-3′。RT-PCR敲除p38IP效率最高的siRNA对应于：Hs_FAM48A_10_HP 5′-TGCGATTTGCAGCATAA-3′（Qiagen）和5′-GCAAGCTTAGAACTAT-3′（Dharmacon）。按照制造商的方案，使用寡聚体胺将实验和对照siRNA转染到HEK293和293/GFP–LC38细胞中。使用以下引物，使用多位点定向突变试剂盒（Qiagen）制备siRNA-resistant质粒：5′-ACTGAAACCGTCAGTTCATGTATTGGGAA-3′。

在敲除72小时后，使用SYBR绿色RT-PCR在细胞样本中通过RT-PCR确认siRNA敲除，如下所述陈等(2007)获得用于检测p38IP和p38转录物以及β-actin对照的引物集。

免疫沉淀

细胞在含有完全无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）的冰镇TNTE缓冲液（20 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、1%w/v Chaps、5 mM EDTA）中溶解。通过离心清除的裂解液与偶联到抗HA单克隆12CA5抗体（CRUK）的蛋白-G琼脂糖珠或偶联到抗Atg9兔多克隆抗体的蛋白-A琼脂酶珠孵育3 h，然后用TNTE洗涤三次。使用5×SDS样品缓冲液（加热至65°C 5分钟）洗脱蛋白质，并通过SDS–PAGE进行分析。

免疫荧光显微镜

免疫荧光检测如前所述年轻等(2006)使用仓鼠抗Atg9单克隆抗体对.mAtg9进行分析，该单克隆抗体使用前面描述的C末端肽产生年轻等(2006)用LSM 510激光扫描共聚焦显微镜对细胞进行成像，该显微镜配备有一个×63，1.4 NA，平面Apochro油浸物镜（均为卡尔蔡司显微成像）。使用LSM 510软件处理图像。使用Image J软件测量细胞核和细胞质中的p38IP强度，并绘制为细胞核中的p28IP强度与细胞质中p38IP密度的比值。

免疫印迹

为了检测GFP–LC3脂质过氧化，在1×SDS样品缓冲液中对293/GFP–LC 3细胞进行不同处理后的裂解。然后将裂解液加热至37°C 5分钟，并通过27G针五次以降低粘度，然后在10%莱姆利SDS-PAGE上进行分析。为了检测内源性LC3的脂质过氧化，HEK293A细胞在含有完全EDTA-无蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）的冰镇TNTE（20 mM Tris（pH7.5）、150 mM NaCl、0.3%v/v Triton X-100、5 mM EDTA）中经过各种处理后进行裂解。通过离心清除的裂解液与5×SDS样品缓冲液混合，加热至37°C 5 min，然后在4–12%双Tris NuPAGE凝胶（MES SDS运行条件）上进行分析（Invitrogen）。将蛋白质转移到PVDF膜上。使用5F10抗LC3单克隆抗体（Nanotools，Teningen，德国）检测GFP–LC3和内源性LC3。

与一级抗体孵育后，使用与红外发色团偶联的二级抗体和双通道扫描法（Licor Odyssey）或化学发光法（如前所述）检测并量化GFP–LC3信号(陈等, 2007). 使用Student的双尾模型对各种成对比较进行统计分析t吨-在方差相等的样本集上进行测试。

长寿命蛋白质降解

自噬依赖性降解[¹⁴C] 如前所述，在转染的HEK293A细胞中测量缬氨酸标记的细胞蛋白(陈等, 2007). 长期蛋白质降解的程度表示为培养基中TCA可溶性计数与培养基中总TCA可溶性数和细胞中TCA不溶性计数的百分比。

我们感谢Irene Zohn的建议，感谢SPW实验室的所有帮助，特别是Joölle Morvan和Minoo Razi分别在酵母双杂交筛选和共焦成像方面的帮助，以及Alex Massey的持续支持。我们还要感谢乔尔·莫尔万、米努·拉齐、哈罗德·杰弗里斯和尼科尔·麦克奈特对该论文的批判性阅读。最后，我们要感谢英国癌症研究所的支持。