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.2010年1月6日；29(1):27-40.
doi:10.1038/emboj.2009.321。 Epub 2009年11月5日。

p38alpha MAPK通过mAtg9和p38IP对自噬的协调调节

杰玛·L·韦伯 1, 莎伦·A·图兹
附属公司

p38alpha MAPK通过mAtg9和p38IP对自噬的协调调节

杰玛·L·韦伯等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

自噬是一种溶酶体降解途径，对体内平衡、发育、神经疾病和癌症至关重要。人类疾病中自噬的调节机制尚不清楚。Atg9是一种自噬所需的跨膜蛋白，有人认为Atg9的贩运可能调节自噬。哺乳动物Atg9在基础条件下在TGN和内体之间进行转运，并在诱导自噬的信号作用下形成新的自噬体。我们确定p38IP是一种新的mAtg9相互作用体，并表明这种相互作用受p38alpha MAPK调控。p38IP是饥饿诱导的mAtg9运输和自噬体形成所必需的。操纵p38IP和p38alpha可改变mAtg9的定位，这表明p38alfa通过p38IP调节饥饿诱导的mAtg8转运，从而形成自噬体。此外，我们还表明p38alpha是基础自噬和饥饿诱导自噬的负调控因子，并建议这种调控可能是通过与mAtg9直接竞争结合p38IP来实现的。我们的结果为MAPK通路与通过mAtg9和p38IP控制自噬之间的联系提供了证据。

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数字

图1
图1
mAtg9绑定到p38IP在体外和体内. (A）AH109菌株与含有mAtg9（诱饵）C末端（CT）结构域的pGBKT7和含有p38IP（猎物）CT结构域的p GADT7或pACT2共同转化。然后，通过在30°C的SD-Trp/Leu/His平板上共转化酵母生长3天来观察相互作用。(B类)p38IP的结构域组织，N-（1–487个氨基酸）和C-（487–733个氨基酸）末端结构域。p38IP具有一个预测的核定位信号（NLS）、一个PEST结构域和两个富含丝氨酸的结构域。显示了与p38α和mAtg9的相互作用区域。(C)用RFP–mAtg9和HA–p38IP转染HEK293A细胞。用抗HA抗体免疫沉淀HA–p38IP，用抗mAtg9抗体检测共免疫沉淀RFP–mAtg9。用抗HA抗体检测HA–p38IP。星号表示非特定带。mAtg9的间接免疫荧光分析(D类)HA–全长p38IP（HA–FL）(E类)HA–C端子p38IP（HA–CT），以及(F类)HA–N端子p38IP（HA–NT）。棒=5μm。在（D）和（E）中看到的共同定位并不是因为随机分布的囊泡重叠。交叉相关函数（CCF）分析（van Steensel等（1996）显示了Δ附近的峰值和最大Rp值X（X）=0，表明mAtg9和p38IP之间的共同定位是正相关的和非随机的（补充图S1）。
图2
图2
p38IP存在于膜上，与mAtg9共定位，并且是依赖于饥饿的mAtg9贩运所必需的。(A）HEK293A细胞单独转染HA–p38IP或与HA–p28IP和RFP–mAtg9联合转染，均质并离心，所得核后上清液（PNS）通过10万离心分离克进入膜颗粒和胞浆。用SDS-PAGE溶解等量的蛋白质，并用抗甘露糖-6-磷酸受体（MPR）抗体作为膜相关蛋白的对照，用抗超氧化物歧化酶（SOD）抗体作为胞浆蛋白、抗mAtg9抗体和抗HA抗体的对照进行免疫印迹。使用ImageJ软件量化HA–p38IP水平，并在PNS中绘制与HA–p28IP相关的曲线(n个=4）(**P（P）=0.0051). (B）使用siRNA去除HEK293细胞的mAtg9，然后用HA–p38IP转染并在全培养基或EBSS中培养（数据未显示）。星号表示mAtg9耗尽的细胞。棒材为5μM。使用ImageJ软件分析了喂食和饥饿条件下对照组和mAtg9耗竭的细胞的核荧光强度与细胞溶质荧光强度(***P（P）=<0.0001，学生t吨-测试）。(C)用HA–p38IP转染HEK293A细胞并进行间接免疫荧光处理。用抗HA抗体检测HA–p38IP，用抗mAtg9抗体检测内源性mAtg9。在全培养基或EBSS中，HA–p38IP定位于细胞核和细胞质斑点。HA–p38IP与mAtg9共同定位于细胞外围（箭头）。棒材（上面板）5μM，（下面板）1μM。(D）用抗mAtg9抗体从单独转染HA–p38IP或RFP–mAtg8和HA–p28IP的HEK293细胞中免疫沉淀mAtg9。用抗HA或抗mAtg9抗体检测了总共5%的裂解物或免疫沉淀物。从相同的免疫印迹获得左手和右手的底板，但暴露不同的时间以使内源性mAtg9更好地显现。(E）用对照或p38IP siRNA转染HEK293细胞。转染后72h，细胞在全培养基或EBSS中孵育2h，然后固定并免疫染色以检测内源性mAtg9定位。mAtg9定位通过对相邻核表型或分散表型的细胞进行视觉评分来量化。条形=5μm（数据表示为200个细胞的平均值±标准偏差，*P（P）=0.0413，学生的t吨-测试）。
图3
图3
哺乳动物自噬需要p38IP。(一个)用对照或p38IP siRNA转染293/GFP–LC3细胞。转染后72小时，将细胞在全培养基（FM）、全培养基中培养2小时，其中全培养基含有亮氨酸肽（FM-Leu）、EBSS（ES）或EBSS含有亮氨酸蛋白酶肽（ES-Leu。GFP–LC3阳性自噬体数量的量化是通过盲法实验中的计数进行的。条形=5μm（数据表示为60个细胞的平均值±标准偏差，***P（P）=0.0002，学生t吨-测试）。(B类)用siRNA对照、p38IP的siRNA和ULK1的siRNA转染HEK293A细胞。使用抗LC3抗体或使用抗ULK1抗体进行免疫印迹，通过SDS-PAGE分析细胞裂解产物的内源性LC3脂质氧化。(C)用siRNA对照转染HeLa细胞，并用siRNA转染p38IP。如（A）所示，孵育2小时后，用抗LC3和抗肌动蛋白抗体对样品进行免疫印迹。对内源性LC3II/LC3I水平进行量化，并将比率表示为任意单位。在（B）中，n个=4,***P（P）=<0.0001和*P（P）=0.0324，学生t吨-测试。在（C）中，数据代表了两个实验。(D类)用siRNA对照或siRNA p38IP转染293/GFP–LC3细胞，并在全培养基中培养，或在EBSS中培养2和4小时。样本用抗p62抗体进行免疫印迹，肌动蛋白作为负荷对照。(E）用HA–p38IP或myc–ULK1 C末端结构域（CTD）转染HEK293A细胞。24小时后，用[14C] 缬氨酸如材料和方法部分所述，并在全培养基或EBSS中培养2 h。然后收集细胞并分析其长期蛋白质降解（数据表示为三倍的平均值±标准差，代表两个实验，EBSS模拟与EBSS HA–p38IP(***P（P）=0.036）；EBSS模拟与ULK1 CTD(***P（P）=<0.0001); 学生t吨-测试）。
图4
图4
激活p38抑制自噬和mAtg9贩运。(一个)用10μM茴香霉素处理293/GFP–LC3细胞30分钟，或暴露于紫外线照射下3分钟，然后恢复40分钟，并在全培养基、全培养基（含亮氨酸肽）、EBSS或EBSS（含亮酸肽）中孵育2小时。然后用共聚焦显微镜对细胞进行固定和可视化。每个细胞的GFP–LC3阳性结构如图3A所示进行量化。棒=5μm。数据表示为平均值±标准误差。n个=60个细胞，模拟与茴香霉素EBSS(***P（P）=<0.0001); 模拟与UV EBSS(***P（P）=<0.0001); 模拟与茴香霉素EBSS和亮氨酸蛋白酶(***P（P）=<0.0001); 模拟与EBSS与亮氨酸肽UV(***P（P）=<0.0001). 所有分析均使用Student’st吨-测试。(B类)HEK293A细胞用10μM茴香霉素预处理30分钟，或紫外线照射3分钟，然后恢复40分钟，然后在EBSS中培养2小时。图像分析如图2E所示。棒=5μm。数据表示为60个细胞的平均值±标准偏差，EBSS模拟值与EBSS茴香霉素(*P（P）=0.0142); EBSS模拟与EBSS UV(*P（P）=0.0150); 学生的t吨-测试。
图5
图5
p38IP在p38α依赖性自噬抑制中的作用。(A）293/GFP–LC3细胞在完全培养基或EBSS中培养前，用10μM茴香霉素预处理30分钟。使用抗LC3抗体通过SDS-PAGE分析细胞裂解物的GFP-LC3脂质化。还用抗β微管蛋白对膜进行了探测。GFP–LC3脂质化被量化为GFP–LD3II/GFP–LC3I的量（数据表示为三倍的平均值±标准差，P（P）=0.0091，学生的t吨-测试）。(B）HEK293A电池标有[14C] 如材料和方法一节所述，缬氨酸用10μM茴香霉素预处理30分钟，然后在全培养基、EBSS或EBSS中与亮氨酸肽孵育2小时。然后分析细胞的长寿命蛋白质降解（数据表示为三组的平均值±s.e.m.，代表两个实验，EBSS未处理与山莨菪碱处理(P（P）=0.0363); EBSS未治疗与leupeptin治疗(P（P）=<0.0001），学生的t吨-测试）。(C）用p38IP的对照siRNA或siRNA转染HEK293细胞。培养24小时后，用茴香霉素预处理对照细胞或p38IP缺失细胞，然后用全培养基培养2小时，用leupeptin、EBSS或EBSS和leupepting培养2小时。用抗p38α或抗LC3抗体分析细胞裂解物。对LC3II/LC3I水平进行量化，并将其归一化为EBSS中培养的未经处理的对照细胞。数据代表了两个实验。(D类)瞬时转染HA-p38IP和RFP-mAtg9的HEK293A细胞用茴香霉素处理30分钟，mAtg8被免疫沉淀。5%的裂解物或免疫沉淀物用抗HA和抗mAtg9抗体进行了检测（数据代表3个实验，*P（P）=0.0332).
图6
图6
p38α的过度表达抑制自噬，并与mAtg9竞争与HA–p38IP的结合。(A）HEK293A细胞转染RFP–mAtg9和Flag–p38（通道2和7）、RFP–m Atg9、Flag-p38和HA–p38IP（通道3和8），或RFP–m2 atg9和HA–p38IP（通道4和9）。用抗mAtg9抗体免疫沉淀RFP–mAttg9，用抗HA抗体检测共同免疫沉淀的HA–p38IP，用抗Flag抗体检测联合免疫沉淀的Flag–p38。用抗Atg9抗体检测到RFP–mAtg9。(B类)HEK293A细胞转染了RFP–Atg9和HA–p38IP（通道1和5）、RFP–mAtg9、Flag–p38和HA–p38IP（通道2和6）或Flag-p38和HA-p38IP。用抗HA抗体免疫沉淀HA–p38IP，用抗Atg9抗体检测共同免疫沉淀的RFP–Atg9，用抗p38α抗体检测联合免疫沉淀的Flag–p38。用抗HA抗体检测HA–p38IP。(C)用Flag–p38α转染HEK293A细胞24小时。细胞在完全培养基、EBSS或EBSS加leupeptin中培养2小时，裂解，并使用抗LC3抗体分析内源性LC3脂质化，并用抗Flag抗体进行免疫印迹。LC3脂质化被量化为LC3II/LC3I的量（数据表示为三倍的平均值±s.e.m，n个=2个实验，EBSS对照组与带有Flag-p38α的EBSS，***P（P）=0.0026).
图7
图7
p38α需要p38IP来抑制自噬。(A）用对照或p38αsiRNA转染293/GFP–LC3细胞。转染后72小时，细胞在全培养基、EBSS或EBSS中与leupeptin孵育2小时，然后固定并通过共焦显微镜观察。条形=5μm（数据表示为平均值±标准误差。n个=60个细胞，EBSS对照与p38αsiRNA(***P（P）=<0.0001); EBSS与leupeptin对照与p38αsiRNA(***P（P）=<0.0001），学生的t吨-测试）。(B类)用对照或p38αsiRNA转染HEK293A细胞。转染后72小时，细胞在全培养基、EBSS或含亮氨酸肽的EBSS中孵育2小时。使用抗LC3抗体分析细胞裂解物的LC3脂质氧化。还用抗肌动蛋白和抗p38α抗体探测膜。LC3脂质化被量化为LC3II/LC3I的量（数据表示为平均值±标准偏差）。n个=5，全培养基对照与p38αsiRNA(**P（P）=0.0056); EBSS对照与p38αsiRNA(**P（P）=0.048); Leu对照EBSS与p38αsiRNA(**P（P）=0.04），学生的t吨-测试）。(C)用对照或p38αsiRNA转染HEK293A细胞。转染后72小时，将细胞在全培养基或EBSS中孵育2小时，然后固定并免疫染色以检测内源性mAtg9定位。具有分散mAtg9的细胞百分比如图2E所示进行量化（数据表示为平均值±标准偏差）。n个=200个细胞，全培养基对照与p38αsiRNA(**P（P）=0.0027); EBSS对照与p38αsiRNA(*P（P）=0.0459); 学生的t吨-测试）。棒材=5μm(D类)用p38αsiRNA转染HEK293A细胞，均质并离心，所得核后上清液（PNS）通过10万离心分离克如图2A所示，进入膜颗粒和胞浆。用SDS–PAGE溶解等量的蛋白质，并用抗MPR、抗HA和抗p38α抗体进行免疫印迹。数据代表了四个实验。(E）将HEK293A细胞转染对照、p38αsiRNA或同时转染p38αsiRNA和p38IP siRNA。转染后72小时，将细胞在全培养基、全培养基（含亮氨酸肽）、EBSS或EBSS（含亮酸肽）中培养2小时。使用抗LC3抗体分析细胞裂解物的LC3脂质氧化。用抗p38α探针探测膜。LC3脂质化被量化为LC3II/LC3I的量。数据代表了两个实验。
图8
图8
通过mAtg9、p38IP和p38 MAPK调节自噬的模型。在全培养基中，mAtg9在TGN和内体之间运输。磷酸化p38α抑制自噬。p38IP存在于外周内胚体的mAtg9池中，并与p38α复合。需要注意的是，p38α–p38IP的两个池是相同的，为了清晰起见，分别显示。在饥饿状态下，p38α被去磷酸化，以较低的亲和力结合p38IP，并且不能再抑制自噬（如虚线所示）。p38α释放的p38IP池将促进mAtg9的贩运和自噬。
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