癌症研究。作者手稿；PMC 2013年5月1日提供。
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NIHMSID公司：美国国家卫生研究院361706
类粒头蛋白-2抑制上皮-间质转变
,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1,2 ,三和1,2,*
本杰明·西普利
1玛丽·巴布·伦道夫癌症中心，1 Medical Center Drive，Campus Box 9300，West Virginia University，Morgantown，WV 26506
菲利普·莱利，IV
1玛丽·巴布·伦道夫癌症中心，1 Medical Center Drive，Campus Box 9300，West Virginia University，Morgantown，WV 26506
菲利普·皮弗
1玛丽·巴布·伦道夫癌症中心，1 Medical Center Drive，Campus Box 9300，West Virginia University，Morgantown，WV 26506
约瑟夫·威德梅耶
1玛丽·巴布·伦道夫癌症中心，1 Medical Center Drive，Campus Box 9300，West Virginia University，Morgantown，WV 26506
约瑟夫·艾迪生
1玛丽·巴布·伦道夫癌症中心，1 Medical Center Drive，Campus Box 9300，West Virginia University，Morgantown，WV 26506
阿列克谢·伊万诺夫
1玛丽·巴布·伦道夫癌症中心，1 Medical Center Drive，Campus Box 9300，West Virginia University，Morgantown，WV 26506
2西弗吉尼亚州摩根敦市西弗吉尼亚大学医学中心大道1号生物化学系，邮编26506
詹姆斯·丹维尔
三马歇尔大学生物化学和微生物学系，1 John Marshall Drive，Huntington，WV 25755
史蒂文·弗里希（Steven M.Frisch）
1玛丽·巴布·伦道夫癌症中心，1 Medical Center Drive，Campus Box 9300，West Virginia University，Morgantown，WV 26506
2西弗吉尼亚大学医学中心路1号生物化学系，摩根敦，WV 26506
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2西弗吉尼亚大学医学中心路1号生物化学系，摩根敦，WV 26506
三马歇尔大学生物化学和微生物学系，地址：1 John Marshall Drive，Huntington，WV 25755
- 补充资料
1
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摘要
谷穗基因参与伤口愈合和发育性神经管闭合。鉴于创伤愈合过程中发生的上皮-间充质转化（EMT）与肿瘤的癌干细胞样隔室（包括TGF-β依赖性）之间的高度相似性，我们研究了Grainyhead基因Grainyhead-like-2（GRHL2）在致癌EMT中的作用。GRHL2在claudin-low亚类乳腺肿瘤和basil-B亚类乳腺癌细胞系中特异性下调。GRHL2抑制TGF-β诱导的、Twist诱导的或自发的EMT，增强失巢敏感性，并抑制乳腺上皮细胞中的乳球生成。这些效应部分是通过直接抑制ZEB1启动子抑制ZEB表达来介导的。GRHL2还抑制Smad介导的转录，上调mir200b/c和TGF-β受体拮抗剂BMP2。最后，GRHL2在MDA-MB-231乳腺癌细胞中的异位表达触发了间质到上皮的转变，并恢复了对失巢凋亡的敏感性。总之，我们的发现确定了GRHL2在抑制乳腺癌细胞中致癌EMT中的主要作用。
关键词：上皮-间充质转化、EMT、粒头、失巢、ZEB1、TGF-β、乳腺癌
简介
致癌EMT是一种转录重编程事件，赋予肿瘤细胞的限制亚类具有增强的转移和干细胞样特性。这些特性包括增加迁移/侵袭、抗化学和辐射、抗失巢凋亡和异常的肿瘤发生频率，以及类似癌干细胞的能力(1,2). 在乳腺癌中，两种肿瘤亚类“克劳丁-罗”和“化生”表现出明显的EMT样基因表达特征。这些是侵袭性最强、治疗反应最差的肿瘤之一(三).
一般来说，TGF-β信号可以促进或抑制肿瘤的发生和发展(4,5). 它可以通过Smad介导的周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因（如p15）的诱导来抑制肿瘤，并且在某些肿瘤中会发生该途径的失活突变。然而，在其他情况下，TGF-β通过转录和非转录机制支持致癌EMT诱导，从而促进肿瘤进展。例如，在claudin-low和化生乳腺肿瘤以及干细胞样CD44中高的/CD24型低的从其他亚类乳腺肿瘤中分离出来的肿瘤细胞亚群——TGF-β途径组分显著上调，事实上，TGFβ受体激酶抑制剂部分逆转了EMT相关基因的表达谱(三,6). 这表明TGF-β途径在这方面具有促肿瘤作用。
细胞培养模型证实了这些结论。一种特征广泛的SV40大T/hTERT永生化乳腺上皮细胞系HMLE在CD44亚群中表现出自发EMT高的/CD24型低的单元格(7). 这种EMT伴随着自分泌TGF-β信号的上调，主要是通过下调拮抗剂如BMP2/4的表达。通过抑制该信号通路，可以实现上皮表型的逆转。此外，即使在该系统中，扭转诱导的EMT也部分依赖于自分泌TGF-β信号，这表明其在多种环境中的功能意义。
致癌EMT和创伤相关EMT之间的相似性，包括TGF-β依赖性，已被证明(8–10). 基于此，我们假设，也许其他“专用”创伤修复基因在致癌EMT中可能很重要。谷穗家族基因已被证明在伤口愈合、表皮完整性和胚胎神经管闭合的机械相关过程中发挥重要作用(11–14). 到目前为止，已确定的相关但有限的谷胱甘肽家族靶基因包括E-cadherin、claudin-4、桥粒蛋白-1、转谷氨酰胺酶-1、rho-GEF19、果蝇母子转换期间表达的几个塞尔达靶基因以及端粒酶(11,12,14–17). 关于癌症，GRHL2基因扩增已在包括乳腺癌在内的多种肿瘤类型中被发现，并抑制死亡受体的表达，对相应配体介导的凋亡产生抵抗，表明GRHL2是一个潜在的癌基因(18). 另一方面，GRHL3最近被证明可以抑制鳞状细胞癌，因为它可以激活PTEN的表达(19).
受其在创伤愈合中作用的启发，我们假设并报告GRHL2抑制TGF-β信号通路介导的EMT。与此效应一致，GRHL2在EMT依赖性乳腺肿瘤（克劳丁低，化生）和细胞系（基底B）中特异性下调。发现EMT需要ZEB1，是GRHL2抑制的直接靶点。GRHL2还增强了失巢敏感性。这些数据表明GRHL2的EMT抑制功能在TGF-β/EMT驱动的肿瘤类型中下调。
材料和方法
细胞系
HMLE、HMLE+twist-ER和HMLE+Ras细胞（HMLER）是R.Weinberg（怀特黑德研究所）的慷慨贡献。HMLE和HMLE+Twist-ER在MEGM（Lonza）和[DME/F12（Gibco）+5%马血清+1X青霉素-链霉素-谷氨酰胺（PSG）+10μg/ml胰岛素、10 ng/ml EGF、0.5μg/ml氢化可的松]的1:1混合物中生长，如有指示，将4-羟基他莫芬（10ng/ml）添加到HMLE+Twist-ER细胞中以激活Twist-ER蛋白。HMLER细胞在MEGM中生长。MDA-MB-231LN由E.Pugacheva（西弗吉尼亚大学）提供，生长在高级DMEM（Invitrogen）+10%胎牛血清+1X青霉素-链霉素-谷氨酰胺（PSG）中。
逆转录病毒转导产生稳定的细胞系
从Open Biosystems（MHS4426-99625903）购买的模板中扩增出人GRHL2，并通过标准分子生物学方法将其亚克隆到pMIG或MSCV-IRES-puro逆转录病毒（Addgene；XhoI位点）中。通过每60mm转染4.5μg逆转录病毒质粒和2.5μg pCMV-VSV-g在GP2+293T细胞中包装和扩增逆转录病毒2细胞培养皿，使用Mirus TransIT试剂。48小时后收集病毒上清液，通过0.45微米过滤器（Whatman）过滤，并使用0.6 ml上清液感染6孔培养皿中的一孔靶细胞，方法是在1400 rpm下离心1小时，然后再培养6小时至过夜。选择感染细胞进行嘌呤霉素检测（HMLE为2μg/ml，MDA-MB-231为0.5μg/ml）或流式检测GFP，然后进行western blot分析以验证表达。
通过慢病毒转导和瞬时敲除（siRNA）产生稳定的细胞敲除细胞系
GRHL2、ZEB1和加扰控制shRNAs购自pGIPZ载体中的Open Biosystems。（产品编号：shGRHL2a:RHS4430-99291384；shGRHL3b:RHS4430-99614394。shZEB1a:V3LHS_356186和shZEB1 b:3 V3LHS-356187；后者也使用Mlu1/Xho片段亚克隆到载体pTRIPz中）。SiZEB1 Smartpool来自Dharmacon目录号（L-006564-01-0005），并使用Lipofectamine RNAi-max（Invitrogen）瞬时转染。
哺乳动物试验
哺乳动物以1×10的速度播种4细胞/孔，并在适当的生长培养基+0.5%甲基纤维素（MC）中生长7-10天。每三天用1ml培养基+MC喂食一次奶池。计算每个奶池的乳房总量，并将尺寸截止值设置为直径150mm；相同的细胞在2×10的条件下进行培养56孔板的细胞/孔，连续4天每天计数细胞数以测量正常生长速率。误差条表示重复的标准偏差。
Anoikis分析
使用TrypLE Express（Invitrogen）分离细胞，计数并固定数量（1×105至2×105将6孔超低附着簇盘（Costar）的细胞/孔悬浮在正常生长介质+0.5%MC中6至24小时，以诱导失巢。为了对凋亡DNA片段进行细胞死亡ELISA（CDE）分析，将细胞收集在3个体积的培养基中，然后以1500rpm转速旋转3min。然后用D-PBS（Invitrogen）将颗粒洗涤，转移到微量离心管中，以7000 rpm造粒15秒，并在PBS+0.5%Triton X 100+10mM EDTA中溶解（注：发现罗氏细胞死亡ELISA试剂盒的溶解缓冲液对细胞的溶解不充分）。将裂解液在冰上培养15分钟，偶尔混合，然后以13000rpm离心12分钟。根据试剂盒（罗氏）提供的手册，对上清液进行CDE。或者，通过台盼蓝排除试验测定细胞死亡百分比，其中细胞以相同的方式悬浮，但在Accumax（创新细胞技术）中收集并重新悬浮，以确保单细胞悬浮。短暂孵育（2–3分钟）后，将台盼蓝添加到该溶液中，并立即在血细胞仪上计数%的死亡细胞。对所有样本进行重复或三次分析，并从此处提供的数据中减去零时间细胞死亡值。
三维文化
3D Matrigel培养方法改编自：(20). 综上所述，2.5×10三将细胞/孔接种到8孔室载玻片（Labtek）上，其中45ul Matrigel（Trevigen）均匀分布。用合适的生长介质（见上文）+2.5%基质凝胶覆盖细胞。培养6天后，通过计算形成突起的结构数量和生长为小叶结构的结构数量来量化3D迁移/侵袭。每次实验至少统计200个结构；误差条表示三个样本的标准偏差。
微阵列方法
使用Nanodrop（Fisher Scientific）定量RNeasy Plus试剂盒（Qiagen）分离的RNA。在生物分析仪（安捷伦）上检查RNA质量。根据制造商的说明，使用Ambion WT表达试剂盒处理每种RIN值大于7的250毫微克RNA样品。该反应的典型产率为6-9微克cDNA。使用基因芯片WT终端标记试剂盒（Affymetrix）处理所需数量的cDNA（5.5微克）进行片段化和生物素标记。通过安捷伦生物分析仪检查裂解反应的效率。将片段化和生物素标记的cDNA（50微升）与添加的杂交对照物的整个反应在45°C的GeneChip Hybridation Oven 640（Affymetrix）中与人类基因芯片1.0 ST外显子阵列（Affmetrix）杂交17小时。在Affymetrix GeneChip Fluidics Station 450中，使用FS 450_0001协议对人类基因芯片1.0 ST外显子阵列进行染色。简言之：生物素标记的cDNA与含有链霉亲和素-藻红蛋白复合物的溶液进行两轮洗涤反应，并对生物素标记抗链霉亲和力抗体进行中间处理以放大信号。藻红蛋白标记在Affymetrix基因芯片扫描仪3000 7G plus中使用532 nm的光进行检测，并通过光电倍增管进行检测。Expression Consol软件（Affymetrix）用于检查杂交芯片的质量控制。所有通过质量控制的芯片都使用Expression Console软件进行了RMA规范化。微阵列数据以登录号GSE36081保存在NCBI GEO数据库中。为了研究GRHL2在多大程度上影响上皮-间充质转化（EMT）的倾向，我们比较了已鉴定的EMT信号中基因的相对表达(21)与构成GRHL2表达的细胞中基因的相对表达有关。具体来说，我们从表S1第页，共页(21)并计算相对表达式的平均对数比。我们将这些基因限制在我们的阵列平台上，并计算这些基因与GRHL2调节基因与对照相比的对数表达率的皮尔逊相关系数。
报告者分析
使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）以1μg DNA:2ul Lipofeectamine比率瞬时转染HMLE。12孔的1.5μg DNA/孔是可耐受的最大DNA量。将转染混合物在200μl Opti-MEM（Invitrogen）中培养20分钟，然后将其添加到缺乏抗生素的正常生长培养基中的细胞中。细胞孵育4h，然后用正常生长介质再次喂养。通过用PBS洗涤细胞一次，然后在1x细胞培养裂解缓冲液（Promega）中裂解，制备裂解液。将裂解液在13000 rpm下离心10分钟，并检测上清液中的荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性，作为内部对照。荧光素酶检测试剂取自Promega，β-半乳糖苷酶2X检测试剂为200 mM磷酸钠（pH 7.3），2mM氯化镁2100 mM 2-巯基乙醇和1.33 mg/ml邻硝基苯半乳糖苷。Smad报告子构建物3TP-Lux来自Addgene。pGL3中ZEB1启动子荧光素酶的构建(22)由Antonio Garcia de Herreros（西班牙巴塞罗那）提供。CMV-LacZ或TK-LacZ被用作内部控制。GRHL2克隆购自Open biosystems，cat#MHS4426-99625903，编码序列克隆到pcDNA3.1+的XhoI位点。使用以下引物生成ZEB1启动子的亚片段并克隆到pGL3-启动子（MluI-BglII）：片段1:ZPfr1-f:Ttaat ACGCGT CCTTAAGGTCCGCACGGCG，ZPfr1-r:tatat agatct AAGTTCCTTGCCAGCAGC；片段2:ZPfr2-f:TtaatACGCGT CTAGCCTCTTCAATCCA，ZPfr2-r:tatatagatcTCCGCCCCGCACCCGGGCC；片段3:ZPfr3-f:TtaatACGCGTCACGCGTGGGACTGA，ZPfr3-r:tatat agatct GGATGGAACCGAGG；片段4:ZPfr4-f:Ttaat ACGCGT GCCTCCCTCCCCACACCA，ZPfr4-r:tatat agatct ACCGCTTTACGACA；片段5:ZPfr5-f:TtaatACGCGT GCGGACCGGGTGGGAGGC，ZPfr5-r:tatat agatct TACCTGCGCAGCCCG；片段6:ZPfr6-f:Ttaat ACGCGT GCCTCTCCGGTCGCCGCG，ZPfr6-r:tatatagatct GGGGCAGGGAGGGGATCTGGC，片段7:ZPfr7-f:Ttaat ACGCGT GGGCAGCCGGCGTGTG，ZPfr7-r:tatat agatct ACCGTGGGCACTGCTGAATT。
用于突变片段4结构的引物（使用Stratagene Quickchange II XL试剂盒）为：Mut-f:gtaaagccgggagtcccaggtgcggtagatcgcg；Mut-r:cgcagatctacgcacctgtgggacgcactcgctttac
免疫荧光
对于Smad2定位，添加TGF-β（5 ng/ml）6小时，并用4%多聚甲醛（PFA）在PBS中固定盖玻片10分钟。用100mM甘氨酸在PBS中淬灭PFA。用0.2%TX100在PBS 4度下渗透细胞10分钟，用PBS洗涤两次，并在PBS+10%山羊血清+0.1%吐温-20+0.1%BSA中封闭1小时。在封闭缓冲液中稀释一级和二级抗体。主要抗体如下：SMAD2，细胞信号，rb，1:200。次要：rb Alexa 555（红色），分子探针，1:1000。安装介质：Prolong Gold w/DAPI（Invitrogen）。
对于E-Cadherin、vimentin和GRHL2，将细胞固定在−20°C的100%甲醇中至少1小时。然后用PBS清洗两次，并如上所述进行封堵。Ecadherin，ms，BD，1:200；波形蛋白，rb，细胞信号，1:200；GRHL2，rb，西格玛，1:200。第二种药物是抗鼠Alexa 555（红色）或抗兔Alexa 488（绿色）或A555（红色），（分子探针），稀释比例为1:1000。如上所述，在Longing Gold中安装了隐形眼镜。使用Axiovert 200M显微镜、AxioCam MRM摄像头和Axio Vision 4.3.1软件（蔡司）生成图像。
炸薯条
将5×100mm的4-OHT诱导HMLE+twist-ER（在某些实验中为+GRHL2）培养皿分别固定在1.2ml 10%电子显微镜级多聚甲醛中10分钟。在用甘氨酸猝灭后，完全按照前面所述进行CHIP(23)使用以下抗体：（每个3.3μg）：GRHL2（Sigma）；组蛋白H3（细胞信号）或非免疫兔IgG（Pierce）。使用以下引物集通过PCR分析CHIP-衍生DNA：ZEBf6:GCGAGGCGTGTGACTGATGG；ZEBr6:AAAGTTGGAGGCTCGGCGGC；ZEBf10:CTGCACGGCGAGACCGCT；ZEBr10:TTCCGCTTGCCAGCACGCTC；GAPDH-f:ATGGTTGCACTGGGGATCT；GAPDH-r:TGCCAAAAGCCTAGGGGAGA公司。对于qPCR分析，使用2X Power-Sybr Green Master Mix（Applied Biosystems）分析CHIP DNA，并使用“ΔΔ-Ct”方法计算相对于输入DNA的信号；与使用GRHL2-null细胞裂解物在对照反应中获得的ZEB1扩增相比，采用1.5X的校正来调整GAPDH扩增的效率。使用的引物集为F8:GCCGCCGAGCCTCCAACTTT；R8：TGCTAGGGACCGGGCGGTTT。
蛋白质印迹
使用4–20%梯度三甘氨酸凝胶（Invitrogen）进行SDS-PAGE。通过电泳将蛋白质转移到PVDF过滤器（Immobilon FL，Millipore）中含有5%MeOH的三甘氨酸转移缓冲液中来固定蛋白质。过滤器在PBS+5%非脂肪乳中被堵塞，一级抗体在PBS+0.1%吐温20+5%非脂乳中培养，二级抗体在PBS+0.1%吐温20+5%SDS中培养。初级阶段通常孵育2小时至一夜，次级阶段孵育1小时。使用的主要药物为：Ecadherin，ms，BD Biosciences（BD）；Vimentin，理学硕士，圣克鲁斯生物技术公司（SCBT）；N-卡德林，ms，BD；CD44（HCAM），毫秒，SCBT；ESRP1/2，ms，（宾夕法尼亚大学费城分校Russ Carstens供稿）；肌动蛋白，ms，Millipore；Akt、rb或ms，细胞信号（CS）；GRHL2、rb、Sigma；Zeb1，rb，Sigma或rb，CS；Ankyrin-G、rb、S.M.F.自定义生成(23); 总计-Smad2/3，ms，BD；磷酸-Smad2/3，rb，CS；NF2（梅林）、rb、SCBT。化学发光的二级抗体为抗鼠或抗兔抗体，与辣根过氧化物酶（Biorad）结合，以1:3000稀释度使用；western blots使用（ECL-West-Pico，Pierce）开发。荧光标记的二级抗体为小鼠IRDye 800CW或兔IRDyee 680LT（Li-Cor），在10:000使用，并使用奥德赛红外成像系统（Li-Cor）检测。荧光图像被转换为灰度。
其他生物信息学方法
我们从NCBI基因表达综合库（登录号GSE10885）获得了GRHL2表达数据(三)). 我们比较了肿瘤类型Basal、Claudin、Her2、Luminal和Normal中GRHL2的对数表达。我们进行了Tukey HSD测试，以确定这些组之间的哪些比较显示出统计学上的显著差异；绘制了对数表达式的家族95%置信区间。使用R版本2.13.1进行统计分析(网址：www.r-project.org).
结果
GRHL2表达缺失与间充质表型相关
基于GRHL2在小鼠上皮细胞中的特异性表达(12–14,24)，我们研究了其在EMT期间的电位调节。使用表达twist-ER融合的HMLE细胞——一种先前特征化的可诱导EMT模型(21)——我们分析了三苯氧胺诱导扭转的一段时间内GRHL2的水平，发现在EMT期间GRHL2蛋白确实下调，其动力学类似于E-钙粘蛋白的丢失和N-cadherin的增加(). 与这一发现一致，通过CD44分类获得的HMLE细胞亚群（“间充质亚群”）中自发、稳定的EMT高的表型，如前所述(7)，也显示低GRHL2表达().
GRHL2在经历EMT的细胞和肿瘤中下调（a） 扭转下调GRHL2。用4-羟基三苯氧胺诱导具有三苯氧胺诱导扭曲（扭曲ER）的HMLE细胞诱导指定的时间段，并分析上皮、间充质和肿瘤起始细胞（CD44）标记基因。（b） 相对于亲代HMLE细胞，GRHL2在间充质亚群（MSP）细胞中下调。（c） GRHL2在以Neve等为特征的乳腺癌细胞系的“基础B”亚类中特异性下调(42). （d） GRHL2在Hennessy等人的乳腺癌细胞系的“claudin-low”亚类中特异性下调(三). （e） GRHL2在以Creighton等为特征的肿瘤起始/间充质细胞亚群中特异性下调(25).
乳腺癌细胞系已根据基因表达谱进行分类。一个特殊的亚类，基底B，具有间充质特征。GRHL2显著下调，特别是在这个亚类中(). 类似地，乳腺肿瘤样本的“克劳丁-罗”亚类（也以间充质基因表达谱和预后差为特征）表达的GRHL2水平显著低于其他亚类，事实上，与正常乳腺组织相比，GRHL2表达水平略有上调(，请参阅讨论）。GRHL2在以EMT（透明细胞肾癌）为特征的不同肿瘤类型中也显著下调(图S1). 此外，通过CD44分类对患者化疗后获得的原发性乳腺癌细胞的耐药亚群高的/CD24型低的标记表达或乳房球生成(25)表达GRHL2水平下降().
这些数据表明，GRHL2缺失是经历EMT并获得肿瘤起始表型的原代和培养肿瘤细胞的普遍特征，这为GRHL2下调对EMT具有重要功能的假设提供了依据。
GRHL2是EMT抑制器
自发发生的CD44高的CD24型低的异质HMLE细胞系中的MSP细胞以EMT为特征，归因于自分泌信号通路激活(7). 用GRHL2表达构建物感染HMLE细胞，并使用GFP标记物选择感染细胞，导致CD44消失高的亚群()在感染后几天内，这表明是一种转化效应，而不是选择性生长（如下所示）。
GRHL2抑制EMT（a） GRHL2的异位表达抑制HMLE细胞（“MSP”）自发性间充质亚群中CD44的表达。用FACS分析感染GRHL2或空逆转录病毒载体（pMIG）的HMLE+Twist-ER细胞（无4-OHT）的CD44表达。（b） GRHL2使MSP细胞恢复为上皮表型。CD44高的将HMLE细胞流式分选获得的HMLE间充质亚群感染空载体或GRHL2，然后(顶部面板)通过免疫荧光或(下部面板)用western印迹法检测上皮和间充质标志基因。（c） MSP细胞中GRHL2的表达可恢复失巢症敏感性（左面板：上图表示DNA片段ELISA分析，下图表示台盼蓝渗透性分析），并减少乳腺增生（中面板），而不会影响生长速度（右面板）。（d） GRHL2抑制扭转诱导的EMT。用4-OHT（激活扭转转基因）处理表达空载体或GRHL2的HMLE+twist-ER 7天，并且(顶部面板)拍照以记录形态学。(下部面板)：在有或无异位GRHL2表达的细胞中，4-OHT诱导twist基因后上皮和间充质标记基因变化的时间进程；（e） GRHL2抑制MDA-MB-231LN细胞中的EMT和抗失巢凋亡。对表达空载体或GRHL2的MDA-MB-231LN进行形态学分析（相差显微镜，左上角)E-钙粘蛋白的表达和定位（免疫荧光，右上角)上皮和间充质标记物的表达（western blotting，左下角)，失巢敏感性（DNA片段ELISA(中间的)和粘附生长率(下右).
为了进一步描述这种现象，我们通过流式分选从HMLE细胞系中分离出MSP细胞，并用GRHL2逆转录病毒感染这些细胞。基于上皮和间充质标志物的E-cadherin免疫荧光和western印迹，GRHL2将MSP恢复为上皮表型(). 抗异型抗体和形成乳房球的能力是与HMLE细胞EMT相关的关键特征。MSP细胞中GRHL2的表达在不影响粘附细胞生长的情况下，恢复了失巢敏感性并显著减少了乳房球的形成().
这些数据表明，GRHL2恢复了MSP细胞的自发EMT和伴随的肿瘤起始细胞特征。为了测试GRHL2在其他EMT情况下的作用，我们在HMLE+Twist-ER细胞和典型EMT-like/triple阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中组成性表达了GRHL2，在这两种情况下，GRHL2均导致EMT和抗失巢凋亡的显著逆转()表明这种效应具有惊人的广泛特异性。
GRHL2抑制TGF-β诱导的EMT
MSP细胞和扭曲表达的HMLE细胞依靠自分泌TGF-β信号维持间充质和致瘤特性(7)表明GRHL2可能通过这一共同途径抑制EMT。我们通过使用一种TGF-βR1激酶活性的特异性抑制剂LY364947，证实了扭转介导的EMT和获得抗失巢凋亡是TGF-？依赖的(图S2). 由于该抑制剂在某些方面模拟了异位GRHL2的作用，我们测试了GRHL2对TGF-β诱导的EMT的作用。
此前曾报道，仅TGF-β不足以在HMLE中诱导EMT，这一过程需要激活多条通路(7). 当GRHL2被两种不同的shRNA部分耗尽时，TGF-β单独诱导EMT的效率高于对照shRNA细胞(). GRHL2基因敲除促进了TGF-β的多种活性：诱导间充质形态，下调上皮特异性基因（E-cadherin、ESRP1和ankyrin-G，一种调节失巢凋亡的上皮细胞骨架蛋白）(23))波形蛋白和肿瘤起始细胞标志物CD44S上调；令人惊讶的是，TGF-β诱导的N-钙粘蛋白部分独立于GRHL2的表达。与EMT的这种促进作用相一致，GRHL2基因敲除也允许TGF-β进入产生乳房球的抗失巢状态(). GRHL2还抑制了EMT的另一个特征，即在三维基质凝胶培养中菌落生长过程中形成大的突起结构，这表明存在入侵潜力(图S3).
GRHL2抑制TGF-β诱导的EMT（a） GRHL2敲低使HMLE细胞经历TGF-β诱导的EMT。在分析细胞形态之前，将HMLE+twist-ER细胞（无4-OHT）与两个不同的GRHL2 shRNA或一个干扰对照shRNA接触TGF-β两周(左上角)E-钙粘蛋白表达/定位（免疫荧光，右上角)或乳房球生成（图表，下右). 在TGF-β治疗的指定时间（western blot，下左). （b） GRHL2抑制TGF-β产生抗失巢凋亡的能力。在加入或不加入TGF-β培养两周后，通过DNA片段分析上述细胞系的失巢凋亡。（c） GRHL2抑制Smad介导的转录。(左侧面板)：稳定的GRHL2敲除对Smad-responsive报告体构建物（3TP-lux）活性的影响通过荧光素酶分析来确定，该荧光素素酶分析是通过瞬时转染的HMLE+twist-ER细胞（无4-OHT）表达扰乱或GRHL2a shRNA，在裂解前用TGF-β处理16小时；数值是荧光素酶活性标准化为内部共转染β-半乳糖苷酶对照。(下部面板)：通过qRT-PCR测定外源TGF-β，稳定的GRHL2敲除对TGF-？/Smad靶基因CTGF和ZEB1诱导的影响。(顶部面板)：GRHL2对Smad2/3的磷酸化无影响。表达空载体或GRHL2的MSP细胞用指示浓度的TGF-β处理24小时，并分析总的和磷酸化的smad2/3。(右侧面板)：GRHL2对Smad2的核转位无影响。用TGF-β处理第a部分中描述的GRHL2敲除细胞或对照细胞6小时，并通过免疫荧光分析Smad2定位。（d） GRHL2基因敲除在带有Ras（HMLER）的HMLE细胞中诱导EMT。用相差显微镜对表达两种不同GRHL2 shRNAs或干扰shRNA对照的HMLER进行成像(顶部)，免疫印迹检测上皮和间充质标志物(正确的)或检测失巢症（台盼蓝排除，左侧面板). （e） GRHL2上调BMP2。使用指定的引物集，对HMLE+Twist-ER细胞系中具有或不具有组成性GRHL2表达（用4-OHT诱导）的RNA进行RT-PCR。
这些结果表明，GRHL2可能抑制TGF-β受体下游的信号传导。我们重点关注Smad介导的转录，因为它在对外源性TGF-β介导的EMT的反应中起着重要的作用，尽管不是唯一的作用(4). 使用特性良好的报告分析（3TP-lux(4))，GRHL2敲除通过相对于对照细胞的~4.6X刺激TGF-β/Smad介导的转录(). 相应地，GRHL2敲除促进TGF-β/Smad靶基因CTGF的诱导(26)和ZEB1(27)，通过外源性TGF-β。令人惊讶的是，GRHL2对Smad2的磷酸化或核转位均无明显影响，这表明其他抑制机制是有效的（见讨论）。这些结果表明，GRHL2抑制Smad介导的转录，以响应外源性TGF-β。
根据上述标准，在表达低水平活化K-ras（HMLER）的HMLE细胞中，GRHL2敲除足以诱导EMT，即即使没有外源性TGF-β(). 这种EMT明显依赖于自分泌TGF-β信号传导，因为LY364947逆转了它(图S4). TGF-β信号拮抗剂BMP2和4先前显示在MSP细胞中相对于正常HMLE下调，从而促进自分泌TGF-(7). 有趣的是，BMP2的表达被GRHL2激活()与GRHL2不仅抑制TGF-β信号传导以响应外源配体的观点一致，而且（通过与相同细胞系的报告数据进行比较(7))自分泌信号。
GRHL2抑制ZEB-1表达
GRHL2可通过多种机制抑制EMT。为了以无偏见的方式阐明其中一个或多个，我们进行了基于微阵列的基因表达谱分析，比较了有或无GRHL2表达的HMLE-Twist细胞。该分析表明，GRHL2（GEO数据库登录号GSE36081）调控的基因与HMLE系统中EMT期间（由多个转录因子）调控的基因组呈负相关（R=−.7508），验证了GRHL2的EMT抑制作用(). 受GRHL2调控的基因包括上皮与间充质表型的标记，其中一些是ZEB1靶基因；还注意到与EMT控制有关的转录因子。
GRHL2抑制ZEB1基因（a） 4-OHT诱导表达空载体或GRHL2的HMLE+Twist-ER 17天；去除后4天，通过微阵列分析分离并比较RNA。在同一细胞系中，比较GRHL2和Twist引起的基因变化；图中显示了这种比较的回归图。（b） GRHL2上调mir-200b/c。通过RT-PCR比较来自表达GRHL2或对照shRNA的HMLE或HMLER细胞的RNA与所指示的mir-200转录物。（c） GRHL2抑制ZEB1启动子。(左侧面板)：MSP细胞与ZEB1启动子荧光素酶报告子构建物共转染，输入指定数量的GRHL2表达载体或等量的空载体。数值表示归一化为内部β-半乳糖苷酶对照的相对荧光素酶活性；（右面板）：短暂转染ZEB1启动子后，对GRHL2稳定敲除或对照（加扰）敲除的HMLE+Twist-ER细胞（无4-OHT）进行荧光素酶活性检测。（d） 鉴定对GRHL2敏感且包含GRHL2共识结合位点的ZEB1启动子片段。（左面板）：在存在或不存在共转染GRHL2的情况下，对跨越1 kb ZEB1启动子的片段（~200bp）进行转录活性分析。显示了片段1-4序列和预测的GRHL2结合位点。（右面板）：含有预测GRHL2结合位点的野生型或突变版本的片段4被联合转染的GRHL2抑制。（e） GRHL2蛋白与ZEB1启动子相互作用。使用GRHL2、组蛋白H3或非免疫抗体免疫沉淀HMLE+Twist-ER+GRHL2（上面板）或MDA-MB-231+GRHL1（下面板）中的染色质，并使用指定的CHIP引物通过凝胶PCR或qPCR进行分析。
有趣的是，如RT-PCR所示，下调GRHL2的主要靶基因之一是E-cadherin阻遏物/EMT诱导物ZEB1()和MSP细胞中的蛋白质印迹()，MDA-MB-231细胞()，HMLE+shGRHL2细胞与TGF-β()，HMLER+shGRHL2细胞()和HMLE+Twist-ER电池(). ZEB1下调的功能后果(28)比如mir-200b/c的上调()和ESRP1()也很明显。进一步研究了GRHL2对ZEB1的下调，认为这是抑制EMT的潜在机制。
为了确定ZEB1基因是否可以作为GRHL2的直接靶点，我们联合转染了先前表征的ZEB1启动子(22)与GRHL2一起进入MSP细胞（表达低内源性GRHL2）。这揭示了GRHL2对ZEB1启动子的显著抑制，正如相反的实验一样，将ZEB1基因启动子转染到含有或不含有内源性GRHL2的细胞中().
对GRHL2应答启动子序列~1 kb的检测揭示了粒头蛋白的几个潜在结合位点。我们在SV40启动子的背景下测试了ZEB1上游区域约200bp的嵌套片段，以检测GRHL2的抑制作用，并确定了一个高度抑制的片段（片段4）。该片段包含一个一致的GRHL2结合位点，并携带一个强增强子；GRHL2的抑制被该共有位点的四个碱基突变完全消除(). 为了确定ZEB1启动子是否是GRHL2抑制的直接靶点，进行了CHIP分析，证明使用GRHL2抗体对非免疫性IgG或代表基因组无关区域的引物集（使用GRHL1抗体）的PCR信号进行了强烈富集(). 这些结果表明，GRHL2抑制了ZEB1的表达，并与ZEB1启动子直接相互作用。
抑制ZEB1对GRHL2抑制EMT至关重要
ZEB1在EMT对包括TGF-β在内的各种刺激的反应中起着关键作用(29–33)，说明GRHL2通过抑制ZEB1的表达，至少部分抑制了EMT的假设。为了验证这一点，在HMLE+twistER+GRHL2细胞中使用强力霉素诱导的启动子体外表达ZEB1。根据形态学、上皮和间充质标记物的表达以及抗失巢凋亡的标准，ZEB1恢复了先前被GRHL2表达阻断的EMT(). 在通过稳定的GRHL2表达而恢复为上皮表型的MSP细胞中也观察到ZEB1表达的类似效应(图S5). 相反，在GRHL2敲除使HMLE细胞倾向于TGF-β诱导的EMT的细胞中，ZEB1敲除阻止了这种诱导(). 类似地，HMLER细胞中GRHL2敲低诱导的EMT被ZEB1敲低逆转(图S6). 这些结果表明，抑制ZEB1是GRHL2抑制EMT的关键机制。
抑制ZEB1对GRHL2抑制EMT很重要（a） ZEB1恢复组成性表达GRHL2的细胞的EMT能力和抗失巢凋亡能力。用4OHT处理HMLE+twist-ER（具有或不具有组成性GRHL2表达）和带有空载体或异位ZEB1表达载体，然后分析失巢蛋白（DNA片段ELISA，左上角); E-cadherin表达/定位（免疫荧光，右上角）、细胞形态（相位对比，左下方）上皮和间充质标记物的表达（western blot，下右). （b） ZEB1敲除可防止GRHL2敲除细胞中TGF-β诱导的EMT。表达shGRHL2a的HMLE+twistER（不含4OHT）转染非靶向siRNA或ZEB1 siRNA，然后与TGF-β细胞孵育，分析上皮和间充质标记物（western blot，顶部面板)形态（相位对比，左下面板)或E-cadherin表达/定位（免疫荧光，下右).
讨论
哺乳动物GRHL2是一种在表皮连接中起重要作用的转录因子，部分原因是包括claudin-4和E-cadherin在内的靶基因的激活。与此作用一致，果蝇Grainyhead基因是第一个用于母体-合子转换（MZT）的转录因子之一在胚胎发育期间(16)和三种哺乳动物的灵长类基因对胚胎和成人伤口愈合至关重要(11–14). 鉴于创伤愈合部分由TGF-β信号调节(9)，GRHL2对该途径的抑制作用表明，GRHL2可能有助于伤口愈合的消退期，其中角质形成细胞中的瞬时EMT样细胞转化被指示逆转。鉴于两种EMT背景之间的相似性，GRHL2对致癌EMT的抑制作用可以通过类比此功能来理解(8).
哺乳动物谷胱甘肽蛋白在癌症中的重要性正在显现。最近研究表明，GRHL3在鳞状细胞癌中起到抑癌作用，至少部分地作为PTEN表达的直接激活剂(19); 然而，未审查与EMT相关的问题。GRHL2基因在未分类的乳腺肿瘤样本中表现出频繁扩增，并被认为是乳腺癌的潜在癌基因，部分原因是其抑制死亡受体表达(18). 与此一致，在管腔A、B和HER2阳性的肿瘤类型中观察到GRHL2 mRNA的适度上调()（尽管尚不清楚这是否是肿瘤生长过程中上皮细胞室相对于正常乳腺扩张的人为结果）。相反，我们的结果表明，GRHL2在EMT模型和EMT驱动的肿瘤亚类中下调，并抑制TGF-β诱导的ZEB1表达；根据ZEB1已建立的促肿瘤潜能，该结果预测GRHL2将特异性抑制EMT样肿瘤(34,35).
这些结果可以根据TGF-β的截然相反的、上下文相关的作用进行协调：某些肿瘤的生长抑制和肿瘤抑制与其他肿瘤的促进(4). 在乳腺癌中，不到10%的患者具有EMT/TGF-β对肿瘤进展起关键作用的肿瘤类型（克劳丁-低、化生），而在大多数肿瘤（其他基底、管腔A、B和HER2阳性亚类）中，大多数转基因小鼠模型模拟的TGF-(三,36). 通过靶向TGF-β途径，GRHL2通常被预测为癌基因（即，在乳腺癌最常见的亚类中）或肿瘤抑制基因（即EMT-like亚类）。
本文的结果表明，GRHL2通过至少两种机制干扰对TGF-β的反应，即干扰Smad2/3介导的转录激活和直接抑制ZEB1启动子（图). 与之前在其他系统中的观察结果一致(28,37)，EMT需要ZEB1来响应Twist、TGF-β和自发转化。GRHL2也上调了mir-200b/c，这与已建立的ZEB1/mir-200前馈调节回路在EMT中的关键作用一致(28). GRHL2抑制ZEB1启动子的确切机制可能与谷粒蛋白通过招募多梳抑制复合物成分或干扰反式激活物的结合来抑制转录的能力有关(16,38).
拟议模型摘要EMT是由TGF-β与其他微环境因子联合诱导的，需要激活ZEB1和其他靶基因。微环境因素（Wnt、NF-kb激动剂？）上调Twist和Snail基因，后者下调GRHL2。这种下调减轻了ZEB1启动子的抑制，允许TGF-β（部分通过Twist和Snail自身）激活ZEB1表达。GRHL2的下调也增强了Smad介导的TGF-β靶基因的反式激活，这些反式激活与ZEB1一起诱导EMT和抗失巢凋亡。
GRHL2抑制Smad介导的转录的机制目前尚未解决。先前的研究表明，ZEB1蛋白可以与Smad2/3复合物结合，增强反式激活(39); 我们的初步观察表明，这种机制并不适用于我们的系统。Smad2/3核与细胞质定位受磷酸化以及Crumbs极性复合体通过Hippo途径成分发出的信号调节(26). 然而，这些机制不太可能解释GRHL2的抑制，因为Smad磷酸化和核转位没有明显影响。其他影响Smad2/3转录激活的核蛋白，如TGIF、Ski和Sno(4)，仍需在GRHL2的背景下进行测试。
TGF-β诱导的EMT在细胞培养模型中是一种高度受限的现象，仅发生在少数上皮细胞系中(40). 事实上，我们观察到，通常用于研究这种现象的小鼠乳腺上皮细胞系NMuMg具有无法检测到的GRHL2表达，而其他无反应的小鼠乳腺细胞系确实表达GRHL2(图S7). 这些结果与之前的发现一致，即来自肿瘤微环境的其他因子赋予HMLE细胞TGF-β反应性，表明这些因子中的一个或多个可以通过下调GRHL2发挥作用(7). 更普遍的是，乳腺癌样本和细胞株中GRHL2的表达谱表明GRHL2是EMT的一般屏障。因此，GRHL2阻止TGF-β在三维培养中产生抗失巢凋亡、乳腺增生形成（一种肿瘤起始细胞行为）和侵袭性生长，从而预测了这种情况下的肿瘤抑制效应。
这些结果还表明，GRHL2可能是目前临床试验中预测对TGF-β受体抑制药物有反应的肿瘤的有用生物标志物(41)：GRHL2-null肿瘤易受TGF-β促肿瘤作用的影响，预计对这类药物有特异性反应，这一方法可以显著提高其疗效。
致谢
作者希望感谢凯西·布伦戴奇（流式细胞仪）、基米·阿隆奇以及彼得·斯托洛夫、迈克·鲁珀特、劳拉·吉布森、安东尼奥·加西亚·德埃雷罗斯、安东尼奥·波斯蒂戈、理查德·迈尔斯和凯·施密特-奥特实验室的帮助、建议和试剂。我们感谢Wioletta Szeszel-Fedorowicz执行微阵列实验。S.M.F.得到了NIH拨款R01CA123359的支持。流式细胞仪核心设施（玛丽·巴布·伦道夫癌症中心）由NIH拨款RR020866和P20 RR16440支持。J.D.的部分支持来自西弗吉尼亚州IDEA生物医学研究卓越网络（INBRE）P20 RR 016477-12（Rankin，Gary，PI）。A.V.I.获得了NIH拨款P20 RR16440、美国癌症协会拨款122300-IRG-09-061-04-IRG和Susan G.Komen的治疗拨款KG110350的支持。
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