氨基酸是脂肪和三磷酸腺苷（ATP）合成中蛋白质和中间体的组成部分。它们还启动细胞内的信号级联，从而激活主生长调节剂mTOR复合物1（mTORC1）。这种多组分蛋白激酶整合了生长因子的输入以及营养和能量供应，以控制许多生物合成和分解代谢过程(1). mTORC1上游的大多数信号汇聚在TSC1-TSC2上，TSC1-TSC2是一种异二聚体肿瘤抑制因子，对瑞布鸟苷三磷酸酶（GTPase）进行负调控，GTPase是mTORC1蛋白激酶活性的重要激活剂(2,三). 相反，氨基酸通过促进其与一个独特的GTPases家族Rag GTPases的结合而向mTORC1发出信号(4,5). Rags形成由RagA或RagB组成的异二聚体，它们彼此高度相似，与RagC或RagD结合，也高度相关。Rag GTPases以氨基酸敏感的方式将mTORC1募集到溶酶体表面，溶酶体也含有Rheb(5). 三聚体Ragulator复合物由p18、p14和MP1蛋白组成，将Rag GTPases锚定在溶酶体上，与Rags一样，也是氨基酸激活mTORC1所必需的(6). Ragulator和Rag异二聚体共同在溶酶体表面形成mTORC1的氨基酸调节对接位点。
氨基酸信号被提议在质膜或细胞内启动，但这个关键问题仍未解决(7–10). Rag GTPases在溶酶体上的定位，而不是其他含Rheb的内膜，表明该细胞器在向mTORC1发送氨基酸信号方面起着重要作用。为了确定溶酶体相关过程和蛋白质是否参与氨基酸对mTORC1的激活，我们在果蝇S2细胞中使用RNAi来减少一些在溶酶体生物发生和功能中起作用的基因的表达(表S1). 靶向大多数基因的dsRNA并不影响T398上氨基酸诱导的核糖体蛋白S6激酶（dS6K）磷酸化，这是dTORC1活性的读数(表S1). 相反，dsRNAs靶向vhaC39、vha16、vha100-1和vha100-2，这些都是液泡H的编码成分+ATP酶（v-ATP酶），将dS6K磷酸化抑制到与靶向dRagC的dsRNA相似的程度(表S1和和图S1A). vhaC39的dsRNAs也降低了S2细胞的大小(). 与果蝇细胞的结果一致，靶向果蝇vha16的直系同源人类ATP6V0c的慢病毒shRNAs抑制了氨基酸诱导的人类胚胎肾（HEK）293T细胞S6K1磷酸化(和图S1B). 这些结果表明v-ATP酶参与氨基酸激活mTORC1。
氨基酸激活mTORC1对v-ATP酶的需求。(一个)双标记RNA（dsRNA）介导果蝇S2细胞中vhaAC39的缺失。剥夺细胞1.5小时的氨基酸，然后用完全培养基刺激30分钟。分析来自细胞裂解物的蛋白质在苏氨酸398（T398）处的dS6K磷酸化。将两种不同的dsRNA对vhaAC39的消耗与dRagC的消耗进行比较。(B类)dsRNA介导的S2细胞中vha100-1和vha100-2的缺失抑制了氨基酸诱导的dS6K的T398磷酸化。(C类)与对照dsRNA（黑色）相比，使用两个dsRNA（红色和蓝色）在S2细胞中耗尽vhaAC39后测量细胞大小。(D类)靶向GFP、RagC、RagD和V0c的短发夹RNA（shRNA）处理的HEK-293T细胞中T389处的S6K1磷酸化。细胞被剥夺氨基酸50分钟，如有指示，刺激10分钟。免疫印迹法用于检测指示的蛋白质。(E类)在缺乏氨基酸的HEK-293T细胞中，在所示浓度的ConA存在下，S6K1磷酸化50分钟，然后用氨基酸刺激10分钟。(F类)在所示浓度的水杨酸甲酰胺（SalA）存在下，剥夺氨基酸50分钟的HEK-293T细胞中的S6K1磷酸化，并用氨基酸重新刺激10分钟。(G公司)ConA通过氨基酸的醇酯阻止mTORC1活化。HEK-293T细胞被剥夺氨基酸50分钟，然后在指示浓度的ConA存在下用氨基酸或氨基酸醇酯刺激10分钟。(H（H）)细胞内氨基酸激活mTORC1。HEK-293T细胞被剥夺氨基酸50分钟，并在DMSO或2µM SalA中用氨基酸或环己酰亚胺刺激。免疫印迹法检测所示蛋白。
v-ATP酶由多组分V0和V1结构域组成，通过一种尚未完全理解的机制运行，在这种机制中，V1扇区的每一个ATP水解循环都会产生扭矩，从而旋转V0的膜结构域，即转子。反过来，这种运动使质子转移到溶酶体腔中，使其酸化(11). 大环内酯类Concanamycin A（ConA）和水杨酸酰胺A（SalA）是v-ATP酶的结构多样的抑制剂，没有其他已知的靶标(11–14). 在293T细胞中，ConA和SalA以浓度依赖的方式抑制氨基酸诱导的S6K1磷酸化(). 短时间（15–50分钟）处理后S6K1磷酸化受到抑制(图S2A)溶酶体形态无伴随改变(图S2、B和C)或抑制Akt磷酸化，生长因子信号转导的读数().
v-ATP酶及其活性对氨基酸激活mTORC1是必需的，这一发现促使我们考虑其在该途径中的潜在作用。一种可能性是，v-ATP酶在氨基酸下游发挥作用，是氨基酸诱导信号通路的一部分，最终导致mTORC1激活。另一个可以想象的功能是，v-ATP酶产生的质子梯度是氨基酸运输到氨基酸传感器所在的细胞室所必需的。为了检验这些可能性，我们测试了氨基酸的醇酯衍生物激活mTORC1是否需要v-ATP酶。这些酯类在细胞膜上自由扩散，在细胞质和溶酶体中被酯酶水解成天然氨基酸(15). 氨基酸酯或亮氨酸甲酯的混合物激活mTORC1，其效率与各自的天然氨基酸相当(图S1、C和D). 此外，ConA还抑制氨基酸酯诱导的S6K1磷酸化(和图S1E). 与这些发现一致，SalA还抑制了环己酰亚胺诱导的mTORC1激活，环己酰酮通过抑制翻译提高了细胞内氨基酸的浓度(7,16) (). 因此，这些结果与在氨基酸诱导信号向mTORC1的启动或传播过程中，v-ATP酶在细胞内氨基酸下游发挥作用是一致的。
氨基酸信号传导中的一个关键事件是Rag GTPase介导的mTORC1向溶酶体表面的移位(5,6). 在用ConA或SalA处理或耗尽ATP6V0c的细胞中，mTOR未能在氨基酸反应下聚集到溶酶体上，而是在细胞内以扩散染色模式发现(和图S3，A–C). 不像Ragulator(6)，v-ATP酶似乎不是将Rag GTP酶锚定在溶酶体表面所必需的，因为药理学或RNAi介导的对v-ATP酶的抑制不会影响RagC的溶酶体定位(和图S3、C和D). 为了测试v-ATPase是否在Rag GTPase上游发挥作用，我们使用了一个组成活性的RagB突变体（RagB全球技术伙伴)并使mTORC1信号对氨基酸饥饿不敏感(4,5). 如果激活Rag GTPase需要v-ATP酶，则RagB的表达全球技术伙伴应挽救由ConA和SalA引起的mTOR溶酶体募集和S6K1磷酸化缺陷。事实上，在稳定表达RagB的细胞中全球技术伙伴mTOR的溶酶体定位和S6K1的磷酸化不仅对氨基酸饥饿不敏感，而且对ConA和SalA处理也不敏感(和图S3F). 与这些结果一致，在表达活性RagA的敲除小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中全球技术伙伴来自内源性RagA基因座SalA()和ConA(图S3G)未阻断RagA引起的构成性S6K1磷酸化全球技术伙伴总之，这些结果将v-ATP酶置于氨基酸的下游，但置于Rag GTP酶的核苷酸负载调节的上游；他们还排除了其参与mTORC1的其他监管输入，例如控制Rheb活性(6).
Rag GTPase对溶酶体募集mTORC1的v-ATP酶需求。(一个)氨基酸缺失的HEK-293T细胞中mTOR和LAMP1的免疫荧光图像(顶部)或者被剥夺然后被刺激(底部)在DMSO在场的情况下(左边)或2.5µM SalA(正确的). mTOR和LAMP2通道分别显示。“插图”显示选定字段的放大倍数较高。在合并中，黄色表示共同本地化。(B类)表达靶向GFP的慢病毒编码shRNA的HEK-293T细胞(左边)或V0c(正确的)被剥夺了氨基酸(顶部)或者被剥夺然后被刺激(底部). (C类)缺失氨基酸的HEK-293T细胞中RagC和LAMP2的染色(顶部)或者被剥夺然后被刺激(底部)在DMSO在场的情况下(左边)或2.5µM SalA(正确的). (D类)稳定表达组成活性RagB的HEK-293T细胞Q99升突变体（293T RagB全球技术伙伴)缺乏氨基酸(顶部)或者被剥夺和刺激(底部)在二甲基亚砜存在下(左边)或2.5µM ConA(正确的). (E类)HEK-293T细胞中S6K1磷酸化和HEK-293AgB全球技术伙伴在二甲基亚砜或2µM SalA存在下剥夺氨基酸50分钟，并用氨基酸刺激10分钟的细胞。(F类)野生型MEF中的S6K1磷酸化（RagA+/+)或在MEF中，构成活性RagA Q66L突变体（RagA全球贸易计划/全球贸易计划); 在DMSO或2.5µM SalA存在下剥夺细胞的氨基酸50分钟，并用氨基酸刺激10分钟。
在所有图像中，比例尺代表10µm。
我们测试了v-ATPase和Rags或Ragulator或两者之间是否存在物理交互作用。对表达FLAG标记的Raggulator组分（p18或p14）或RagB的293T细胞制备的抗FLAG免疫沉淀物进行半定量质谱分析，发现存在v-ATP酶的许多亚单位(). 用内源性V0（c和d1）和V1（A、B2和D）亚单位抗体进行免疫印迹分析，证实Ragulator与V0和V1结构域共免疫沉淀()而Rags与V1亚单位共免疫沉淀(图S4、A和B). 虽然在免疫印迹分析中很容易检测到V0的c亚单位与Ragulator共免疫沉淀，但质谱法没有检测到，可能是因为其高度疏水性。v-ATP酶不与溶酶体（LAMP1）或细胞质（Metap2）对照蛋白共免疫沉淀(). 用纯化的重组蛋白进行的体外实验证实了V0组分d1和p18之间的直接相互作用，而p14没有，V1组分D和p18以及在较小程度上和p14之间的直接交互作用(). Rag GTPase和纯化的v-ATP酶亚基之间未检测到直接相互作用(图S4C)与质谱分析的RagB免疫沉淀物中v-ATP酶亚基丰度相对较低一致(). 因此，除了将Rag GTPase支架化到溶酶体表面外，Ragulator还提供了v-ATP酶和Rag GTpase之间的物理和功能联系。
v-ATP酶和Ragulator-Rag GTPases的相互作用。(一个)总结FLAG-p18免疫沉淀物质谱分析的卡通(左边)，标志p14(中心)和FLAG-RagB(正确的)表达HEK-293T细胞。v-ATPase亚单位根据其肽表示进行颜色编码（最右边的标尺）。(B类)Ragulator与V0结构域的结合。裂解稳定表达FLAG标记的p18和p14的HEK-293T细胞，进行FLAG免疫沉淀，然后免疫印迹V0c和V0d1。FLAG-LAMP1和FLAG-Metap2作为阴性对照。(C类)Ragulator与V1域的绑定。裂解稳定表达FLAG标记的p18、p14、LAMP1和Metap2的HEK-293T细胞，进行FLAG免疫沉淀，然后进行V1A、V1B2和V1D的免疫印迹。(D类)（顶部）体外结合试验中，纯化的FLAG-p18和FLAG-p14与融合到谷胱甘肽S-转移酶（HA-GST-V0d1）的重组V0d1孵育，固定在谷胱甘苷琼脂糖珠上。对样品进行FLAG免疫印迹，以检测结合的Ragulator成分。HA-GST-Rap2A作为阴性对照。（底部）体外纯化的FLAG-p18和FLAG-p14与融合谷胱甘肽S-转移酶（HA-GST-V1D）的重组V1D孵育的结合试验。HA-GST-metap2作为阴性对照。
(E类)Ragulator-V1相互作用，而不是Ragulator-V0，受氨基酸调节。稳定表达FLAG标记的p18、p14和Metap2的HEK-293T细胞被剥夺氨基酸90分钟，或剥夺氨基酸，然后用氨基酸刺激15分钟。裂解后，对样品进行FLAG免疫沉淀和所示v-ATP酶亚基的免疫印迹。(F类)SalA阻断氨基酸对Ragulator-V1相互作用的调节。在二甲基亚砜或2µM SalA存在下，将稳定表达FLAG-p14的HEK-293T细胞剥夺氨基酸90分钟，或剥夺氨基酸，然后用氨基酸刺激15分钟。(G公司)卡通总结了（A）-（F）中确定的Ragulator-v-ATPase相互作用。橙色表示氨基酸的调节，蓝色表示缺乏调节。
与作用于v-ATP酶上游的氨基酸一致，氨基酸调节v-ATP酶V1结构域与Ragulator和Rag GTPase之间的相互作用。氨基酸饥饿和刺激分别增强和减弱了这种相互作用(和图S4D). 相反，氨基酸不影响Ragulator与v-ATP酶V0结构域的相互作用()或V1和V0亚单位之间的相互作用（葡萄糖饥饿也是如此(17)) (图S4D). 用SalA处理细胞，就像剥夺氨基酸一样，加强了Ragulator和V1结构域亚基之间的相互作用，而且，在很大程度上阻止了氨基酸削弱相互作用(和图S4E). 因此，氨基酸诱导被SalA阻断的v-ATPase-Ragulator-Rag GTPase复合物的结构重排().
v-ATP酶体积大、结构复杂，具有许多在活细胞中不易区分的功能(11,18–22). 因此，为了更好地理解其在向mTORC1发送氨基酸信号中的作用，我们开发了一个无细胞系统，该系统能够重述氨基酸诱导的mTORC1-与溶酶体表面Rag GTPases的结合（参见方法）。我们从表达氨基酸缺失的FLAG-RagB的293T细胞中制备了轻细胞器部分。用氨基酸或氨基酸酯短暂刺激细胞器，然后用含有myc标记的猛禽的胞浆孵育(和图S5A). 在这个系统中，氨基酸，尤其是氨基酸酯，增加了myc-raptor与含有FLAG-RagB的囊泡的结合，但不控制囊泡(和图S5B). 如预期，在含有FLAG-RagB的制剂中全球技术伙伴突变体，myc-raptor的结合率高且对氨基酸不敏感(图S5C和S5D). 我们还通过从293T细胞中免疫分离来制备纯化的溶酶体（见方法）(图S6，A–C). 再次，氨基酸酯诱导myc标记的猛禽与分离的溶酶体结合(图S6D). 细胞质似乎是可有可无的，因为高度纯化的FLAG标记的猛禽表现出氨基酸诱导的与含有GST标记的Rag异二聚体的细胞器结合(图S6E). 因此，溶酶体包含感应氨基酸和激活Rag GTPase所需的所有机制。
体外氨基酸对mTORC1活化的分析。(一个)myc-raptor与FLAG-RagB-的体外结合，但不与含有FLAG-Rap2A的囊泡结合。使细胞器制剂不受刺激，或用氨基酸或氨基酸酯刺激，并与含有myc猛禽的胞质溶胶一起孵育。FLAG免疫沉淀后，免疫印迹法检测结合myc-raptor(B类)完整的FLAG-RagB溶酶体、用链球菌溶酶体-O渗透的FLAG-GragB溶菌体和用Triton X-100渗透的FLAG-RagB溶酶体未被刺激、用氨基酸刺激或用氨基酸酯刺激。免疫印迹法检测Myc-受体(C类)瞬时表达FLAG-S6K1、FLAG-S6K1+myc-PAT1、FLAG S6K1+HAGST标记活性Rag突变体或FLAG-S6K1+myc-PAT1+HAGST-active Rags的HEK-293T细胞中T389处的S6K1磷酸化。细胞被剥夺氨基酸50分钟，或饥饿，然后刺激10分钟（见方法）。通过免疫印迹法检测所示蛋白。myc-PAT1的带型可能与糖基化有关。(正确的)瞬时表达myc-PAT1的HEK-293T细胞溶酶体的免疫荧光图像，并对myc标签（顶部，合并处为红色）和LAMP2（中部，合并处呈绿色）进行染色。(D类)累计14从表达LAMP1-mRFP-FLAG的HEK-293T细胞免疫纯化C-标记氨基酸进入溶酶体X2个在测量之前，溶酶体要么保持完整，要么用Triton X-100或链球菌溶酶体O渗透。PAT1的过度表达在很大程度上消除了溶酶体内氨基酸的积累。每个值代表三个独立样本的平均值±SD。(E类)用二甲基亚砜或SalA处理FLAG-RagB溶酶体，用氨基酸酯激活，然后与myc-raptor孵育。来自表达FLAG-metap2的细胞的器官部分作为阴性对照。(F类)在质子离子载体FCCP或非水解ATP类似物AMP-PNP存在下，在1 mM或10 mM下用氨基酸酯刺激FLAG-RagB溶酶体。然后用mycraptor胞液培养器官样品，然后进行FLAG-IP和myc-raptor和内源性mTOR的免疫印迹。(G公司)溶酶体氨基酸对mTORC1的内-外激活模型。溶酶体腔内的氨基酸积累产生激活信号，通过v-ATP酶Ragulator传递给Rag GTPases。反过来，Rags将mTORC1物理招募到溶酶体表面。
在体外系统中，氨基酸的醇酯在诱导RagB-猛禽相互作用方面比天然氨基酸更有效(). 一个可能的原因是氨基酸必须进入并积累在溶酶体中以启动信号传递，而氨基酸酯在体外制备中更容易做到这一点(15). 为了测试溶酶体内积累的必要性，我们使用了渗透溶酶体膜从而使氨基酸泄漏的处理方法。用链球菌溶血素-O（在溶酶体膜中引入纳米大小的孔）或Triton X-100（在不破坏v-ATPase-Ragulator-Rag相互作用的情况下溶解膜）处理细胞器制剂，完全抑制氨基酸或其酯促进RagB-raptor相互作用的作用(). PAT1转运体是一种质子偶联氨基酸转运体，特异定位于溶酶体(图S7A)并从溶酶体腔中输出氨基酸(23). 在完整的细胞中，PAT1的过度表达完全抑制了氨基酸对mTORC1的激活，而这种作用通过组成活性RagB的共同表达而完全缓解全球技术伙伴(). 相反，PAT4（一种不定位于溶酶体的氨基酸转运蛋白）的过度表达对氨基酸对mTORC1的激活没有影响(图S7、B和C).
这些结果强烈表明，氨基酸信号在溶酶体内部启动。与这种可能性相一致的是，用14C-氨基酸导致通过FLAG标记溶酶体蛋白免疫分离的溶酶体内快速出现标记氨基酸(和图S6、A和B). 氨基酸积累通过溶酶体通透性恢复，PAT1过度表达在很大程度上阻止了氨基酸积累().
在体外系统中，SalA或shRNA对V0c的v-ATP酶的破坏阻断了氨基酸诱导的猛禽与RagB的相互作用(和图S5E). SalA导致v-ATP酶的结构重排，从而抑制其水解ATP的能力和建立溶酶体质子梯度的能力(13,24). 羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP），一种在不干扰v-ATP酶的情况下消散溶酶体质子梯度的离子载体(25)，不能阻止氨基酸诱导的猛禽与RagB的结合(). 此外，氨基酸或其酯类不会改变完整细胞的溶酶体pH值，也不会干扰体外溶酶体酸化(图S8，A–C). 相比之下，非水解ATP类似物腺苷5'-（β，γ-亚胺基）三磷酸（AMP-PNP）抑制V1的ATP酶活性以及随后茎和V0蛋白脂质亚基的旋转，以浓度依赖的方式阻断了氨基酸诱导的猛禽和RagB之间的相互作用(和图S8D). 因此，ATP水解和v-ATP酶的相关旋转似乎对将氨基酸信号从溶酶体腔传递到Rag GTPase至关重要，而v-ATP酶建立溶酶体质子梯度的能力是不必要的。
我们提出以溶酶体为中心由内而外mTORC1氨基酸感应模型，其中氨基酸必须在溶酶体腔中积累以启动信号传递(). v-ATP酶是向mTORC1发送氨基酸信号以及在氨基酸和Rag GTPase的核苷酸负载之间发挥作用所必需的。它在通路中的位置及其与Rag-Ragulator复合物的氨基酸敏感性相互作用暗示它是氨基酸传感机制的重要组成部分。
