CXCR7/CXCR4异二聚体组成招募β-阻遏素增强细胞迁移^*

摘要

介绍

趋化因子受体属于七螺旋G蛋白偶联受体（GPCR）超家族⁴并且参与了大量的生理事件(1–三). 在大约20个已知的趋化因子受体中，CXCR4及其同源配体、基质细胞衍生因子-1（SDF-1）或CXCL12被广泛研究，因为它们在许多发育过程中，包括器官发生、造血、血管形成和免疫反应中，起着指导细胞迁移的重要作用(2). 在成人中，CXCR4/CXCL12轴调节骨髓干细胞归巢、造血祖细胞保留和白细胞贩运(2,4). 此外，CXCR4参与病理过程。它是HIV-1细胞进入的次级共受体，参与介导乳腺、前列腺、卵巢和肺等原发性内皮肿瘤的发生和靶向转移(5–7). CXCR4已被发现在多种肿瘤类型中表达，并与肿瘤细胞的生存和增殖有关。其表达与几种肿瘤类型的恶性程度和转移形成有关(7–10).

最近，CXCL12被证明与趋化因子受体CXCR7具有高亲和力，在此之前，该受体被归类为孤儿受体(11–13). 然而，CXCR7-SDF-1复合物并没有激活规范G_我-介导的信号网络导致CXCR7可能是一个非信号化趋化因子受体的结论，可能类似于红细胞趋化因子清除剂Duffy（也称为趋化因子Duffy抗原受体）(11,12,14,15). 但有趣的是，CXCR7被发现在多种肿瘤类型和活化的肿瘤相关内皮细胞上表达，并被证明对肿瘤细胞的生存和生长至关重要(12,16–19). 虽然CXCR7是一种假定的非信号受体，其促进肿瘤生长和生存的确切分子机制尚不清楚，但最近的研究试图提供机制方面的见解。CXCR4和CXCR7之间的异二聚化被认为是调节CXCR4功能的一种机制(20–22). 使用萤火虫萤光素酶互补测定法，Luker等。(21)证明CXCR4和CXCR7均可形成同源和异源二聚体。此外，CXCR7与CXCR4的共同表达导致CXCR4介导的G_我激活和信号(20). 此外，尽管CXCR7不通过典型的G蛋白途径发出信号，但它可能通过替代的β-抑制素介导的信号途径以有偏见的方式发出信号(23–25).

基于这些观察结果，我们决定测试CXCR7与CXCR4异源二聚是否有助于创建具有独特性质的独特信号实体，并有助于改变趋化因子受体药理学。我们在此报告，CXCR4和CXCR7的关联导致CXCR4促进的G受损_我激活和信号转导，促进选择性下游β-arrestin依赖的信号转导途径的激活。我们证明CXCR4·CXCR7复合物组成性地招募β-arrestin并增强细胞增殖激酶途径，包括p38 MAPK、SAPK和ERK1/2激活，从而增加CXCR4表达乳腺癌细胞的细胞迁移。

实验程序

结果

CXCR7和CXCR4形成异二聚体

基于CXCR4和CXCR7的组织表达谱重叠，以及它们与同一趋化因子配体CXCL12/SDF-1（以下简称SDF-1）结合的能力，我们研究了这两种趋化因子受体在细胞表面形成异二聚体或高阶低聚物复合体的潜力。差异C末端标记的CXCR4-C9和CXCR7-FLAG在HEK293细胞中的共同表达导致CXCR4-C与CXCR7-FLAG的共同免疫沉淀（Co-IP）(图1A类). 相反，在CXCR4-C9免疫沉淀后也观察到CXCR7的相互co-IP（数据未显示）。使用HA标记的CXCR4（CXCR4-HA）获得了类似的结果（数据未显示）。此外，我们发现使用11G8（一种构象特异性CXCR7抗体）从完整细胞中免疫沉淀细胞表面表达CXCR7，从而检测到共免疫沉淀CXCR4(图1B类). 相反，CXCR4和CCR5的联合表达导致CXCR4与CCR5之间的联合IP很少(补充图1A类). 在共同表达这两种受体的Neuro2A细胞中进行的CXCR4-C9和CXCR7-FLAG的免疫荧光研究显示，这两种感受器在细胞表面的共同定位以及细胞内的明显斑点(图1C类). 综上所述，这些结果强烈表明在表达这两种受体的细胞中存在CXCR4·CXCR7复合物。

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图1。

CXCR7通过与CXCR4形成复合体来改变SDF-1信号。 A类在HEK293细胞中共同表达时，CXCR4和CXCR7共同免疫沉淀。如图所示，转染CXCR4-C9和CXCR7-FLAG的HEK293细胞的洗涤剂-可溶性裂解物经抗FLAG抗体免疫沉淀处理(IP（IP）)CXCR7-标记。将下拉物进行SDS-PAGE，然后进行免疫印迹(IB公司)使用1D4单克隆抗体进行分析(上部面板). 使用1D4和抗FLAG抗体监测CXCR4-C9(中间面板)和CXCR7-FLAG表达水平(下部面板)分别为。B类，与中的实验相同A类除转染细胞外，在裂解前用11G8预孵育，11G8是一种对受体构象敏感的CXCR7特异性抗体。使用1D4抗体检测Co-IP CXCR4-C9(上部面板)和CXCR7水平用抗-FLAG抗体监测(下部面板).C类表达CXCR4和CXCR7的Neuro2A细胞的免疫荧光染色显示CXCR4与CXCR7在膜上共存。天pCRE-SEAP分析显示CXCR4和CXCR7抑制FK诱导的cAMP生成。SDF-1刺激通过CXCR4而非CXCR7抑制FK诱导的细胞cAMP生成。CXCR7与CXCR4的共表达导致FK诱导的细胞通过CXCR4产生的cAMP以剂量依赖性的方式减少。单独使用CXCR4，EC₅₀= 3.4 ± 0.8; CXCR4±CXCR7 1:1.5，EC₅₀= 60 ± 11.E类与CXCR7不同，CCR5与CXCR4的共同表达不会导致pCRE-SEAP分析中SDF-1刺激信号的改变。仅CXCR4，EC₅₀= 3.4 ± 0.8; CXCR4±CCR5 1:1.5，EC₅₀= 3.1 ± 0.5.F类pCRE-SEAP分析显示，当CXCR4-CXCR7共表达细胞预孵育500 n时，SDF-1信号恢复米意大利贸易咨询委员会。数据表示为平均值±S.E(n个= 3). 仅CXCR4，EC₅₀= 3.4 ± 0.8; CXCR4±CXCR7 1:1.5，EC₅₀= 60 ± 11; CXCR4+CXCR7/ITAC、EC₅₀= 5.5 ± 1.7.

CXCR7调节CXCR4依赖性G蛋白信号

接下来，我们研究了CXCR4·CXCR7复合物对SDF-1介导的信号传导的功能作用。活性CXCR4刺激异三聚体抑制性G蛋白（G_我)抑制细胞腺苷酸环化酶活性并降低cAMP水平。我们使用基于SEAP的cAMP报告基因分析来研究SDF-1对G_我-cAMP生成的介导抑制(26). SDF-1刺激可强烈抑制福斯科林（FK）诱导表达CXCR4的HEK293细胞产生cAMP(图1天). 相反，SDF-1对表达CXCR7的细胞的治疗未能诱导类似的效果(图1天). 然而，CXCR7与CXCR4的共同表达强烈减弱了SDF-1诱导的对细胞cAMP生成的抑制。CXCR7对SDF-1诱导的CXCR4信号传导的影响是剂量依赖性的(图1天). 这种效应对CXCR7也是特异性的，因为同样数量的CCR5（也就是G_我-耦合，未导致EC发生类似变化₅₀(图1E类). 这种改变并不是由于CXCR4的细胞表面表达改变，因为我们没有发现CXCR7存在时CXCR4细胞表面水平有任何显著降低(补充图1B类). 这些结果表明，CXCR7在调节CXCR4到G的耦合中起作用_我影响G蛋白介导的下游信号传导。我们的发现与最近发表的一项研究基本一致，其中CXCR7的共同表达导致G蛋白偶联减少，细胞内钙水平动员减少，这是G激活的另一种信号途径_我CXCR4刺激下游(20).

接下来，我们研究了CXCR7特异性配体干扰素诱导的T细胞α趋化剂/CXCL11对CXCR4·CXCR7复合物的影响。与SDF-1类似，ITAC与CXCR7结合，但不通过CXCR7诱导G蛋白信号(15). 有趣的是，CXCR4/CXCR7共表达细胞与500 n米ITAC减轻CXCR7对SDF1介导的CXCR4信号传导的负面影响(图1F类). ITAC恢复CXCR4激活下游细胞cAMP生成的SDF-1依赖性抑制(图1F类).

CXCR4·CXCR7复合物构成招募β-受体

β-Arrestin在GPCR下游的信号传递和内化事件中起着重要作用。鉴于最近的研究已经证明CXCR7以配体依赖的方式招募β-抑制素的能力(23–25)，我们决定研究CXCR4·CXCR7受体复合物对β-arrestin的募集。在HEK293细胞中，CXCR7-FLAG和βArr-GFP与CXCR4-C9共转染或不转染。我们观察到CXCR7和β-抑制素之间的基础和配体依赖性相互作用水平较低(图2,A类和B类). 令人惊讶的是，CXCR4和CXCR7的共同表达导致基础和SDF-1诱导的β-抑制素与CXCR7共同免疫沉淀显著增加(图2,A类和B类). β-arrestin的增强募集对CXCR4·CXCR7复合物是特异性的，因为CCR5的共同表达并没有导致β-arristin与CXCR7的相关性增加(图2,A类和B类). 需要进一步的研究来描述参与β-抑制蛋白募集的结构和分子决定簇，这些决定簇可能位于CXCR4和CXCR7上，或分布在这两个受体上（见“讨论”下）。有趣的是，与SDF-1治疗的效果相反，用ITAC治疗CXCR4/CXCR7-共表达细胞并没有导致β-抑制素募集的进一步增加(图2C类). 事实上，经ITAC治疗后，CXCR4·CXCR7复合物中β-arrestin的补充略有下降，但可重复出现(图2C类).

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图2。

CXCR4·CXCR7复合物组成性地募集β-arrestin。 A类，HEK293细胞与CXCR7-FLAG和β-arrestin-eGFP以及CXCR4或CCR5联合转染，并用100 n米指示时间的SDF-1。裂解物经免疫沉淀(IP（IP）)用多克隆抗FLAG抗体进行免疫印迹(IB公司)使用抗GFP分析(上部面板)和防FLAG(中间面板)抗体。在存在CXCR4但不存在CCR5的基线下，观察到含有CXCR7的细胞膜上β-抑制素的补充增加(上部面板). 用SDF-1刺激5分钟和30分钟后观察到相同的趋势。这个下部面板显示了使用抗GFP抗体的β-arrestin-eGFP表达的输入水平。B类，当CXCR7与CXCR4或CCR5共表达时，仅含CXCR7的细胞膜中β-抑制素募集动力学的定量。数据表示平均值±S.E(n个= 3).美国。，任意单位。C类将CXCR7-FLAG和β-arrestin-eGFP与对照载体或CXCR4-C9联合转染HEK293细胞，并用100 n米SDF-1或ITAC 30分钟。用多克隆抗FLAG抗体免疫沉淀裂解液，并用抗GFP抗体进行Western免疫印迹分析(底部面板). β-抑制素招募的量化描述见顶部面板数据表示至少三个独立实验的结果，并表示为平均值±S.E。β-arrestin募集对CXCR4-CXCR7膜的最大反应为100%。用ITAC刺激不会导致β-arrestin向表达CXCR4-CXCR7的细胞膜的募集增加。天共表达CXCR4、CXCR7和βArr-eGFP的Neuro2A细胞的免疫荧光图像。A类显示了CXCR4/CXCR7/βArr-eGFP的合并图像。B–D类显示较小区域的较高放大倍数(白色正方形，A)展示所有这些合作伙伴的共同本地化。

除co-IP外，我们还观察到CXCR4和CXCR7与β-arrestin在共表达所有三种成分的Neuro-2A细胞中的共定位(图2天). 值得注意的是，在没有CXCR4的情况下，我们没有观察到CXCR7和β-arrestin之间的任何协同定位（数据未显示），这表明CXCR4是CXCR7与β-arristin之间增强相互作用所必需的。

综上所述，我们的数据表明，CXCR7不仅诱导CXCR4的G蛋白偶联发生改变，而且在CXCR4存在的情况下与β-抑制素发生组成性相互作用。此外，CXCR7特异性配体ITAC预处理可恢复SDF-1介导的G_我信号传导以及导致β-arrestin与CXCR4·CXCR7复合物的相关性降低。这表明ITAC在调节CXCR4·CXCR7异聚物和/或其信号通路方面具有潜在的有趣作用。

CXCR7对ERK1/2信号通路的影响

研究表明，CXCR4和CXCR7均能独立增强对细胞增殖和肿瘤生长至关重要的细胞信号通路(9,12,17,29). 我们检测了CXCR4/CXCR7共表达对SDF-1介导的ERK1/2信号通路的影响。有趣的是，CXCR7与CXCR4的共同表达导致了SDF-1刺激后ERK1/2的升高和持续激活(图3A类). 这与先前的证据一致，这些证据表明CXCR7共同表达导致ERK1/2持续激活(22)尽管在报告的研究中，作者没有观察到ERK1/2激活的进一步增加。

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图3。

CXCR7增强SDF-1诱导的细胞信号通路。 A类、SDF-1诱导的ERK、p38 MAPK和SAPK/JNK在CXCR4-、CXCR7-和CXCR4/CXCR7表达细胞中活化的动力学。单独或联合转染CXCR4和CXCR7的HEK293细胞用100 n米SDF-1作用0、5、15和30分钟。使用磷酸化和总ERK1/2、p38 MAPK和SAPK/JNK抗体对细胞裂解物进行Western免疫印迹。B类ERK、p38 MAPK和SAPK磷酸化的量通过密度测定进行量化，并通过将数据表示为磷酸化信号与总信号的比率进行标准化。结果表示为5分钟时最大响应的百分比。数据表示平均值±S.E(n个= 3). 定量ERK1/2、p38 MAPK和SAPK/JNK激活动力学，对表达CXCR4、CXCR7或两者的细胞样本进行。不适用。，无目标。

除了ERK1/2外，我们还将分析扩展到p38 MAPK和SAPK、与细胞增殖和细胞存活相关的MAPK信号通路。如所示图3，仅CXCR4表达很少激活p38 MAPK或SAPK。CXCR4与CXCR7的共表达导致基础和SDF-1刺激的p38 MAPK和SAPK的激活均呈剂量依赖性增加(图3,A类和B类，以及补充图2). 这种效应对CXCR7是特异性的，因为CCR5的转染不会导致p38 MAPK和SAPK的激活以响应SDF-1(补充图2). 当CXCR4和CXCR7单独表达时，p38 MAPK和SAPK激活水平都很低（基础和SDF-1刺激）(图3,A类和B类). 我们假设CXCR4·CXCR7复合物可能优先与p38 MAPK和SAPK通路耦合，而不是单独由每个受体介导的信号。总之，CXCR7与CXCR4的共同表达导致G蛋白偶联抑制细胞cAMP生成减少，但β-arrestin募集增加，以及与细胞增殖和存活相关的信号通路增加。

CXCR7增强SDF-1诱导的细胞信号通路是β-阻遏介导的过程

鉴于CXCR7没有诱导典型的G蛋白介导的反应，但确实导致了β-arrestin募集的增加，我们接下来研究了CXCR4·CXCR7异构体对各种细胞信号通路的激活增加是否可能是β-arristin依赖性过程。我们联合转染CXCR4和CXCR7以及靶向siRNA的β-arrestin2或非靶向对照siRNA，以耗尽β-arristin2的内源性水平。用RT-定量PCR和ΔΔC类_T型分析（数据未显示）。如所示图4β-arrestin的耗竭导致ERK活化的总体下降。基础和SDF-1刺激的p38和SAPK激活也显著降低(图4). 因此，我们得出结论，β-arrestin是CXCR4·CXCR7异质体介导信号的重要组成部分，CXCR7介导的SDF-1诱导信号的增强可能是β-arristin依赖性过程。

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图4。

β-Arrestin是CXCR4·CXCR7复合物激活的SDF-1诱导的细胞信号通路所必需的。 A类表达CXCR4/CXCR7的细胞中SDF-1诱导ERK、p38 MAPK和SAPK/JNK活化的动力学(nt siRNA)或β-arrestin2靶向siRNA(βArr2小核糖核酸). 用100 n米SDF-1作用0、5、15和30分钟。使用磷酸化和总ERK1/2、p38 MAPK和SAPK/JNK抗体对细胞裂解物进行Western免疫印迹。B类ERK、p38 MAPK和SAPK磷酸化的量通过密度测定进行量化，并通过将数据表示为磷酸化信号与总信号的比率进行标准化。结果表示为5分钟时最大响应的百分比。数据表示平均值±S.E(n个= 3).纳特，非目标。

CXCR7以β-阻遏依赖方式增强SDF-1诱导的细胞迁移

考虑到MAPK信号通路的激活增加，我们决定进一步研究CXCR4·CXCR7杂合物对细胞迁移的功能影响。我们研究了CXCR7表达对SDF-1刺激的MDA-MB-231（231）乳腺癌细胞趋化性的影响。这些细胞对SDF-1的反应呈剂量依赖性，并以增加的SDF-1浓度梯度向前移动(图5A类). 在10 n时观察到对SDF-1的最大趋化反应米细胞迁移指数作为SDF-1浓度的函数已被证明是一个钟形曲线，其中较高水平的SDF-1实际上诱导较少的趋化反应(30). 我们发现，当转染231个细胞时，随着CXCR7数量的增加，SDF-1诱导的趋化反应会增强(图5A类). 如所示图5A类2μg CXCR7时，231细胞的趋化性增强最大。除了在CXCR7过度表达的情况下231个细胞的总趋化指数增加外，我们还注意到SDF-1的效力发生了变化。我们观察到转染CXCR7的231个细胞对低浓度SDF-1的反应能力增强(图5A类).

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图5。

CXCR7表达增强趋化性。 A类0、1、10和100 n诱导MDA-MB-231乳腺癌细胞的趋化性米随着转染CXCR7数量的增加，SDF-1的表达增加。当CXCR7表达量增加时，细胞对SDF-1的趋化性增强。B类12.5n诱导稳定表达CXCR4（U87-CD4-CXCR4）的U87-CD4细胞趋化性米SDF-1在CXCR7存在下以剂量依赖性方式增强（0、0.5和2μg CXCR7）。100 n细胞的预处理米ITAC导致SDF-1刺激的CXCR7共表达细胞迁移减少。C类用非靶向性转染U87-CD4-CXCR4细胞(新墨西哥州。)siRNA、βArr2 siRNA或βArr DN以及1μg CXCR7。在βArr2-siRNA和βArr-DN存在的情况下，CXCR7对SDF-1刺激的U87-CD4-CXCR4细胞迁移的增强作用被逆转。数据表示为平均值±S.E(n个= 3).天，提出的模型表明，在SDF-1处理的细胞中，CXCR4触发细胞内cAMP生成和Ca的抑制²⁺动员，CXCR4和CXCR7都刺激ERK 1/2激活(左侧面板). CXCR4和CXCR7的共表达导致CXCR4与CXCR7明显异二聚体化，异聚体CXCR4·CXCR7复合物显示出显著改变的信号分布。CXCR4·CXCR7异构体不能触发对细胞cAMP生成的抑制。β-arrestin的组成招募将CXCR4·CXCR7复合物中的CXCR4刺激耦合到增殖途径（ERK1/2、p38 MAPK和SAPK）。

接下来，我们决定使用表达CXCR4的稳定细胞系作为模型来研究CXCR7对SDF-1诱导的细胞迁移的影响。如所示图5B类，与CXCR7共转染的U87-CXCR4细胞显示SDF-1刺激的迁移增加，呈剂量依赖性。在较高剂量的CXCR7共表达细胞中，ITAC刺激仅导致迁移的边际增加(图5B类). 有趣的是，ITAC预处理显著减弱了SDF-1刺激的CXCR4/CXCR7-共表达细胞迁移增加，这表明ITAC刺激对CXCR4·CXCR7复合物具有负调节作用。我们还发现，CXCR7诱导的迁移增强依赖于功能性CXCR4的存在，因为用AMD-3100（CXCR4特异性小分子抑制剂）预处理亲代和表达CXCR7的细胞，会消除所有SDF-1诱导的细胞迁移（数据未显示）。使用siRNA敲除或使用之前描述的β-arrestin显性阴性突变体有趣地消耗功能性β-arristin2水平(27,31)也废除了CXCR7表达提供的迁移优势(图5C类).

讨论

最近的研究表明，CXCR7是趋化因子SDF-1的一种新的替代受体，SDF-1是已知的CXCR4的激动剂配体(11,12). 然而，CXCR7是一种非典型的趋化因子受体，即使存在饱和的SDF-1浓度，它显然也不会通过典型的G蛋白相关信号通路发出信号(11,12,14,15). 尽管CXCR7激活的信号通路仍在研究中，但越来越多的证据表明，CXCR7可能作为选择性招募和激活β-抑制素介导的信号的偏向性受体发挥作用(23–25,32). 在本研究中，我们发现CXCR7通过在细胞膜中自组装来调节CXCR4的功能，从而与CXCR4形成异二聚体或可能的更高阶异齐聚体。CXCR4和CXCR7的异二聚化导致经典SDF-1介导的G_我-经典G测量的激活信号_我监测腺苷酸环化酶抑制的活化分析(图1). 令人惊讶的是，共表达CXCR4和CXCR7的细胞显示出增加了β-抑制素的配体刺激和基础质膜募集(图2). 血浆膜定位的β-arrestin已被证明结合活性磷酸化GPCR，作为MAPK级联的专性信号支架，包括ERK1/2、JNK和p38 MAPK激酶(33,34). 在这里，我们表明CXCR4存在时CXCR7的共同表达导致ERK1/2级联的增加和持续激活，以及p38 MAPK和SAPK的增加激活(图3和补充图2). CXCR7增强SDF-1诱导的信号似乎是一个β-arrestin依赖过程，因为β-arristin的siRNA敲低导致所有被研究的信号通路显著减弱(图4). 从G蛋白介导的信号转导到β-arrestin依赖的信号与CXCR4·CXCR7异构体对MDA-MB-231乳腺癌细胞以及在内源性CXCR4存在下异源表达CXCR7的运动细胞的SDF-1依赖性细胞迁移的敏感性明显增加有关(图5). 使用siRNA敲除或β-arrestin显性阴性突变体直接抑制β-arristin可消除CXCR4·CXCR7异构体介导的迁移增加，表明β-arretin在受体异二聚体复合物下游发挥重要作用(图5C类). 我们的结果支持这样一个模型，即CXCR4单体/同型二聚体主要通过G蛋白依赖的信号通路发出信号，而CXCR4·CXCR7杂合物主要以偏向的方式参与β-抑制素依赖的信号途径(图5天).

受体二聚化/寡聚化已成为GPCR生物学中的一个关键范式，并且几乎涉及GPCR功能的所有方面，包括细胞内运输、受体内化、药理抑制和信号转导(35,36). 尽管确定受体异源二聚体化的功能后果具有挑战性，但已经证明异源二聚化可以完全改变激活的信号通路以及受体的贩运(37,38). 在CXCR4·CXCR7异二聚体的情况下，我们观察到SDF-1刺激下游诱导的信号通路发生切换，G蛋白依赖性信号减少，β-抑制素募集和信号增加。事实上，有一些例子表明异二聚体具有独特的药理特征。例如，研究表明，μ-δ阿片受体异二聚体选择性地征募β-arrestin2，从而产生导致持续ERK激活的偏置信号(37). 就V1a和V2血管加压素受体而言，异二聚体调节与β-抑制素的相互作用以及内化受体的命运(38). 异二聚还可以调节配体选择性，如CCR5·CCR2和CXCR4·CCR2异二聚体的情况所示，其中异二聚导致与仅一个与受体二聚体高亲和力的趋化因子配体结合的负结合协同性(39–41).

β-Arrestin可以独立于G蛋白激活信号通路(33,34). 这已经针对血管紧张素1受体进行了最佳描述，并针对几个额外的GPCR进行了证实(42,43). ERK激活的G蛋白依赖和G蛋白依赖途径均在激活的血管紧张素1受体下游被证实。具体而言，G蛋白介导的信号传导导致短暂的核ERK活性，β-抑制素依赖的信号传导则导致持续的细胞溶质ERK活性(42). ERK的这种独特的时空激活被转化为不同的信号级联。这些结果和其他结果表明，导致选择性激活一条通路而非另一条通路的偏倚配体或条件可能通过稳定不同的“活性”受体构象而导致不同的生理效应(33,34). 确实有选择性配体的例子；例如，CCL19和CCL21是两种CCR7特异性内源性趋化因子配体，在激活G蛋白的能力方面同样有效，但只有CCL19可以诱导β-抑制素募集和β-抑止素依赖性ERK激活(44). 同样，这两个β₂-肾上腺素能和甲状旁腺激素受体已被证明具有特定的配体，这些配体偏向G蛋白依赖性或β-抑制素依赖性信号(45,46).

β-阻遏物介导的ERK和p38 MAPK激活与CXCR4下游刺激驱动的细胞迁移和细胞存活有关(47–50). 此外，发现来自敲除β-arrestin2的动物的淋巴细胞在SDF-1介导的趋化性中受损(47). 有趣的是，β-arrestin与CXCR4的共同表达导致趋化因子刺激的G蛋白活化减弱和cAMP生成抑制，同时增加受体内化和ERK1/2活化(51). 在同一研究中，β-arrestin的显性阴性抑制剂对G蛋白信号传导没有影响，尽管强烈抑制受体内化和ERK1/2激活。总之，趋化因子受体激活下游的β-抑制素依赖性信号通路提供了一种G蛋白依赖性机制，将GPCR与参与细胞增殖、存活和迁移的几个信号通路联系起来。

我们的结果以及其他最近发表的数据表明，CXCR7的共同表达将CXCR4信号转导远离G蛋白相关通路(20). 但到目前为止，还没有对CXCR4·CXCR7异源复合物诱导的信号传导机制的深入了解。我们表明，CXCR4·CXCR7复合物能有效诱导β-arrestin膜募集，并增强SDF-1诱导的ERK1/2、p38和SAPK通路的激活。CXCR4-CXCR7异二聚体在招募β-arrestin支架复合物中的增强活性为研究CXCR4和CXCR7在癌细胞中的共同表达所提供的生长、存活和迁移优势提供了机制性见解。这项工作的一个有趣但富有挑战性的后续行动将是确定我们观察到的CXCR4·CXCR7复合物中β-arrestin强化招募的决定因素。例如，Gravel进行的一项研究等。(32)证明携带CXCR4 C末端尾部的嵌合CXCR7导致β-阻遏素的组成性招募。这些最近的研究证明了生物发光共振能量转移、荧光素酶互补和成像技术在研究β-阻遏素-CXCR7相互作用中的有用性(20,21,23,24,32). 虽然可以采用类似的生物发光共振能量转移/FRET技术来识别CXCR4·CXCR7二聚体对的特定伴侣，该对在β-抑制素招募中起关键作用，与β-arrestin接触的氨基酸的定位和鉴定可能需要更为集中的技术，如非天然氨基酸突变、生物-有机标记、光化学交联和膜纳米粒子重建。我们和其他人已经成功地使用这些技术来识别受体内构象变化(52)以及受体G蛋白/抑制素结合和激活(53,54). 例如，单体和二聚体受体状态都被报道为β-抑制素结合和激活的功能单位(54,55). 在我们的系统中，CXCR4·CXCR7复合物构成了β-arrestin的新成员，因此将成为绘制β-arristin相互作用位点的良好模型系统。综上所述，上述技术以及最近发现的已知CXCR4调节剂选择性影响CXCR7招募β-抑制素的能力(32,56)，将允许进一步描述观察到的β-arrestin向CXCR4·CXCR7复合物的增强募集。

CXCR4和CXCR7表达水平均与细胞增殖增加相关在体外增强乳腺、肺和前列腺肿瘤的生长和转移潜能体内在小鼠癌症模型中(9,29). 我们使用U87-CXCR4细胞系研究CXCR7在CXCR4应答细胞增殖中的作用。如前所述，我们确实观察到适度剂量依赖性SDF-1诱导的细胞增殖。然而，在我们的模型系统中，CXCR7的瞬时共表达似乎解偶联了配体诱导的细胞增殖，从而导致配体诱导依赖性细胞增殖。这些类型的转染细胞实验的重要性有限，但利用各种转化细胞系的相关发现已被报道。例如，胶质母细胞瘤细胞表现出SDF-1α的剂量依赖性增殖，AMD3100预处理可降低这种增殖(57–59). 有趣的是，CXCR7赋予乳腺肿瘤细胞系MDA MB435s生长优势，这被视为活细胞计数的增加，但不一定是总细胞计数的增加，这种效应可以通过特异性CXCR7配体CCX754来减少(12). NIH 3T3细胞也出现类似的CXCR7依赖性增殖(60). 虽然SDF-1并没有显著增加内源性表达CXCR7的A764胶质瘤细胞的增殖，但配体刺激可以减少喜树碱诱导的凋亡，而使用CXCR7特异配体CCX733可以逆转这种情况(19). 在一项与U373胶质瘤细胞的类似研究中，AMD3100和CCX733独立地降低了SDF-1诱导的增殖，表明CXCR4和CXCR7在细胞增殖途径中的作用(62). 卡拉托佐洛等。(62)还报告了未经SDF-1刺激的未经处理和CCX733处理的细胞之间的统计显著差异。CXCR4和CXCR7表达水平也与非小细胞肺癌的早期和转移复发有关(63). CXCR7高表达与非小细胞肺癌和肾癌患者的5年无病生存率呈负相关(63,64). 有趣的是，CXCL11/ITAC在肿瘤部位的靶向过表达在小鼠肿瘤模型中显示出抗肿瘤活性，并且ITAC还可作为CXCR4-和CXCR7-阳性人类肿瘤细胞经内皮细胞迁移的有效拮抗剂(25,65).

我们的结果为这些先前的观察提供了一种机制性的见解。我们发现，用ITAC处理CXCR4·CXCR7复合物可以调节CXCR4/CXCR7异二聚体诱导的信号传导。ITAC逆转CXCR7对CXCR4诱导的cAMP生成抑制的作用，使其恢复到仅用CXCR4观察到的正常水平(图1). ITAC治疗可降低CXCR4·CXCR7复合物中β-抑制素的水平，并降低CXCR7共表达提供的迁移优势(图2和​和5）。5). 因此，ITAC可能是CXCR4·CXCR7二聚体复合物的变构调节剂。可以想象，ITAC与CXCR7的结合可能在CXCR4内诱导交叉构象变化，从而恢复其与G的偶联_我在其他趋化因子受体异二聚体复合物中也观察到类似的变构调制(61,66). 需要进行进一步的研究，以评估使用CXCR7特异性配体或小分子调节CXCR4/CXCR7异二聚体靶向CXCR7的功能后果及其对肿瘤生长和转移的影响。CXCR4在许多疾病过程中的中心作用，包括癌症、HIV感染、动脉粥样硬化和类风湿性关节炎，以及CXCR7在肿瘤进展和转移中的新作用，证明这两种受体都是可能的药物干预的潜在治疗靶点。

补充材料

致谢

参考文献