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美国国家科学院院刊。2007年9月11日；104(37): 14759–14764.
2007年9月5日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.0702229104
预防性维修识别码：项目经理1976222
PMID：17804806

缺乏第二CXCL12/SDF-1受体CXCR7的小鼠心脏发育受阻但造血正常

弗雷德里克·西罗，* 克里斯汀·比本，† 劳拉·马丁内斯·穆尼奥斯，‡ 马里奥·梅拉多，‡ 理查德·兰索霍夫，§ 李美章，§ 布兰奇·沃尔，* 海伦·梁，* 乔安娜·格鲁姆，* 马塞尔·巴顿，* 理查德·哈维，† 卡洛斯·马丁内斯-A，‡ 查尔斯·麦凯，*和法比安·麦凯*‖
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摘要

趋化性细胞因子（趋化因子）吸引免疫细胞，尽管其最初的进化作用可能与胚胎发育关系更密切。我们注意到趋化因子受体CXCR7（RDC-1）在边缘区B细胞（一种与自身免疫疾病相关的细胞类型）上的差异表达。我们生成了抄送7−/−但发现CXCR7缺乏对B细胞组成几乎没有影响。然而，大多数抄送7−/−小鼠出生时死于室间隔缺损和半月心瓣膜畸形。有条件删除抄送7在内皮细胞中，使用Tie2-Cre铁路转基因小鼠重现了这种表型。基因剖析抄送7−/−心脏瓣膜小叶显示出对瓣膜形成、血管保护或内皮细胞生长和存活至关重要的因子的表达缺陷。我们证实CXCR7的主要趋化因子配体是CXCL12/SDF-1，它也结合CXCR4。CXCL12没有通过CXCR7诱导信号传导；然而，CXCR7与CXCR4形成功能性异二聚体，并增强CXCL12诱导的信号传导。我们的结果揭示了CXCR7在内皮生物学和瓣膜发育中的特殊作用，并突出了进化保守的趋化因子受体（如CXCR7和CXCR4）在发育中的独特作用。

关键词：趋化因子、心脏、异二聚体、免疫学、内皮

趋化因子是与G蛋白偶联的七跨膜受体（GPCR）结合的趋化细胞因子。它们促进白细胞迁移，但也可以在胚胎发生和血管生成中发挥作用(1，2). CXCL12（SDF-1）及其受体CXCR4对心脏、中枢神经系统和血管发育以及B细胞淋巴生成至关重要(三–7). 目标删除Cxcl12型或Cxcr4号机组在小鼠中导致类似的表型，包括室间隔缺损、小脑结构紊乱、造血功能受损以及妊娠第15天至第18天的胚胎致死。因此，CXCL12和CXCR4长期以来被认为是一对一夫一妻制。然而，最近的研究表明CXCL12与一个额外的趋化因子受体CXCR7（RDC1/Cmkor1）结合(8，9). 除CXCL12外，CXCR7与趋化因子CXCL11结合，尽管亲和力较低(9).抄送7编码一种在哺乳动物中高度保守的蛋白质，人类、小鼠和狗蛋白质之间的同源性>91%，相似性95%。它首先被鉴定为一种在人类甲状腺中表达的孤儿GPCR，与趋化因子受体CXCR2相关(10). CXCR7和CXCR4均在人类多种组织中表达，并在某些肿瘤中上调(9，11–13). 与CXCR4类似，CXCR7可以促进血管生成(9，14)和封锁CXCR7(9)或CXCR4(12)在几种小鼠模型中抑制肿瘤生长。

抄送7整个进化过程中的基因保护以及CXCR7对CXCL12的亲和力表明抄送7也可能在淋巴生成或胚胎发生中起作用。本研究报告描述了抄送7−/−小鼠或有条件缺乏抄送7在内皮细胞中。我们证明了这一点抄送7是心脏瓣膜形成所必需的基因，但似乎在造血或神经系统发育中没有明显作用。这种非信号受体可能通过与CXCR4的异二聚作用介导其某些作用，尽管这种作用的重要性体内目前尚不清楚。

结果

CXCR7在小鼠和人类B淋巴细胞亚群上表达。

我们检查了抄送7使用公共数据库(http://symatlas.gnf.org/symatlas) (15)发现在人类身上，CXCR7系列在广泛的组织中表达。使用Affymetrix基因芯片的大数据集分析人类免疫细胞的表达(16，17)我们发现，在免疫系统中，抄送7转录物仅存在于有限的白细胞亚群、一些T细胞亚群和NK细胞以及B细胞中(图1A类).抄送7转录物主要在B细胞中表达(图1 A–C)高水平，尤其是在人类记忆B细胞亚群中(图1B类)，如报告所示(18)在小鼠脾边缘区（MZ）B细胞和过渡型2 MZ前体细胞中(图1C类). 这种表达模式与其他CXCL12受体CXCR4的表达模式不同，表明其在免疫系统中具有不同的作用。

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抄送7−/−小鼠建立了正常的免疫系统。(A类)CXCR7系列和CXCR4系列人类静止白细胞亚群的表达模式。色标表示转录信号，其中黑色=缺失，黄色=中度表达，红色=高度表达。抄送7实时PCR定量人mRNA水平(B类)和老鼠(C类)T细胞和B细胞分别相对于原始或滤泡（FO）B细胞。数值±SEM(D类)用B220和CD43抗体对E17.5胎肝细胞进行染色。在淋巴细胞散射门内进行流式细胞术计数。显示标记门中单元格的百分比。(E类)成人组织学分析抄送7−/−脾脏。切片用B220（绿色）和CD1d（红色）抗体染色。显示脾脏MZ（bar）。。

正常造血、CNS和胃肠血管抄送7−/−小鼠和MZ B细胞数量的适度减少。

剖析抄送7在发育和/或免疫反应中，我们产生了抄送7-使用条件法的缺陷小鼠[支持信息（SI）图6A–C]并注意到95%以上的婴儿出生后迅速死亡抄送7−/−24小时内的新生儿(SI图6D类). 胎肝和骨髓中的B细胞和粒细胞发育正常(图1D类和SI图7)与报告的结果相反Cxcl12型−/−或Cxcr4号机组−/−老鼠(三). 两例幸存成人脾脏分析抄送7−/−小鼠的MZ-B细胞数量出现了适度但持续的减少，尽管如此，这些细胞仍然正常定位于脾脏MZ(图1E类). 这在中得到了证实Mx1-芯/+抄送7液氧/液氧polyI:C注射后诱导CXCR7缺失的小鼠(19)（未显示）。此外，与Cxcl12型−/−或Cxcr4号机组−/−小鼠的神经发育抄送7−/−小鼠与WT小鼠没有区别(SI图8)，与正常水平保持一致Cxcr4号机组在中枢神经系统中的表达(SI图9)以及胃肠道血管化(SI图10). 因此，CXCR7不介导CXCL12驱动的造血功能，似乎对MZ B细胞定位到脾脏MZ和CXCL12介导的神经和胃肠血管发育功能都不重要。

心脏瓣膜发育异常抄送7−/−老鼠。

五名幸存者中有一人突然死亡抄送7−/−成年小鼠发现主动脉瓣严重钙化（未显示）。在另外两个幸存下来的抄送7−/−成人主动脉瓣叶增厚，其中一个融合，有明显的软骨化迹象(图2 A–F). 在10%的成人中也观察到类似的表型抄送7+/−老鼠。80%抄送7−/−新生儿，心脏异常，右心室扩张(图2 G公司和小时). 50%的患者发现了膜下室间隔缺损抄送7−/−小鼠，在某些情况下有相关的主动脉覆盖(SI表1和图2 我和J型). 还观察到房间隔缺损(SI表1). 全部抄送7−/−小鼠至少有一个半月瓣（SLV）存在缺陷(SI表1和图2 K–V型). 90%以上抄送7−/−新生儿肺动脉瓣异常，大多数时间为三尖瓣，小叶明显增厚（77%的病例；比较图2 O（运行）和P（P）)有时为二尖（10%，图2问)偶尔会被过度生长的小叶所阻挡（5%，图2R（右）). 在70%的主动脉瓣中检测到类似范围的异常抄送7−/−新生儿(图2 K–N（K–N），SI表1). 组织学分析证实了这些发现(图2 S–V型). 直到E17.5（未显示），胚胎心脏在流出道和房室垫结构上没有显示任何差异，表明垫形成的早期步骤没有受到影响。我们从未观察到主动脉和肺动脉间隔异常。此外，三尖瓣和二尖瓣在所有检查阶段均正常(SI图11A–H).

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SLV畸形发生抄送7−/−老鼠。成人主动脉瓣脱离对照；(A类，C类、和E类)和抄送7−/−(B类，D类、和如果)老鼠。箭头表示传单边界。(A类和B类)俯视图。中显示的截面平面D类和如果指示。(C–F类)中所示的阀门截面A类和B类. (C类和D类)藏红O染色；红色表示蛋白聚糖和氨基葡聚糖。(E类和如果)Movat五色染色；蓝色表示蛋白多糖。新生儿表型：(G公司和小时)解剖控制和抄送7−/−（−/−）心。右心室（RV）常在抄送7−/−老鼠。(我和J型)对照组和抄送7−/−红心。在突变体中可以看到膜状室间隔缺损（VSD，红色箭头），有时还可以看到覆盖主动脉。主动脉夹层(K–N（K–N）)和肺部(O–R（运行-恢复）)控制阀和抄送7−/−新生儿。箭头表示传单边界。控制主动脉(K（K）)和肺部(O（运行）)阀门。(L–M（L–M），P–R（P–R）)：变异瓣膜的典型改变包括增厚，偶尔瓣膜小叶融合(L（左）和P（P）)形成二叶瓣(M（M）和问)过度生长的小叶阻塞瓣膜(N个和R（右）). (S–V型)新生儿主动脉切片(S公司和T型)或肺部(U型和V（V）)控制阀(S公司和U型)或抄送7−/−(T型和V（V）)老鼠。黑色箭头指向活瓣说明书。AV，主动脉瓣；PV，肺动脉瓣；左心室；主动脉。

抄送7以心脏微血管表达，且具有特异性抄送7内皮细胞的缺失导致心脏缺陷抄送7−/−老鼠。

检查抄送7胚胎发生期间的表达，使用就地杂交（ISH），揭示抄送7E9.5中形成心脏的内皮层转录物(图3 A类和C类). 在此阶段，在神经管、大脑和横隔（未显示）也检测到强烈表达。在E12.5处，抄送7在形成瓣膜的间质以及心肌中的许多微血管中检测到表达(图3E类). 从E14.5开始，在间质中不再检测到表达，并且抄送7主要在与心肌、瓣膜和大血管相关的微血管中转录(图3小时).Cxcr4号机组转录物在E10.5处对瓣膜形成区的内皮细胞及其相应的间质具有特异性，与抄送7在流出道(图3 B类和D类). 来自E12.5，Cxcr4号机组和抄送7以非常相似的方式表达，瓣膜间质中转录物水平降低，发育中的瓣膜和心肌微血管中强烈表达(图3 E类，如果，小时、和我). 在相同的阶段Cxcl12型在瓣膜原基中检测不到，但在主动脉壁和心肌相关微血管中大量存在(图3 G公司和J型). 的表达式Cxcr4号机组和Cxcl12型WT和抄送7−/−小鼠（数据未显示）。总之，在发育中的心脏，Cxcl12型，Cxcr4号机组、和抄送7在心肌微血管中表达，而只有Cxcr4号机组和抄送7在瓣膜间质和相关微血管中转录。

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的表达式抄送7，Cxcr4号机组、和Cxcl12型在心脏胚胎发生期间。带有特定探针的ISH抄送7(A类，C类，E类、和小时),Cxcr4号机组(B类，D类，如果、和我)、和Cxcl12型(G公司和J型). (A类和B类)解剖的E10.5心脏。(C类和D类)通过内皮垫的切片A类和B类. (E–G公司)E12.5胚胎SLV的切片。(H–J型)E14.5胚胎心肌切片。房室管；Oft；尿路点；Vm，瓣膜间质。箭头指向微血管；箭头在小时指向未染色的冠状动脉。

我们特别删除了抄送7内皮细胞中的基因使用Tie2-Cre铁路转基因小鼠(20). 百分之四十Tie2-Cre铁路/+抄送7液氧/液氧新生儿出生时SLV有缺陷，与抄送7−/−老鼠(SI表1)从而证实了SLV缺陷的内皮起源抄送7−/−老鼠。观察到的较低渗透Tie2-Cre铁路/+抄送7液氧/液氧小鼠可能是由于不完全删除抄送7由Tie2-Cre铁路转基因，以及抄送7在未受影响的心脏中检测到Tie2-Cre铁路/+抄送7lox/loxISH的幼崽（未显示）。

血管生成因子表达受损赫贝格夫和血管保护剂肾上腺髓质素在里面抄送7−/−心脏瓣膜。

我们对WT和抄送7−/−新生儿SLV小叶。异常重塑抄送7−/−心脏瓣膜如所示图2 K–V型细胞外基质成分表达的改变，如埃尔恩，Fmod公司，第9a1列，第14a1列、和14毫米(图4A类). 最近，SLV畸形发生与槽口1(21),电子号码(3个) (22),磷脂酶Cε1(插图1) (23),Nfatc1号机组(24),纤维蛋白1(Fbn1公司) (25),亚当19(26),Smad6型(27)以及HB-EGF途径的各种成员(赫贝格夫，Egfr公司，亚当17、和第11页) (28–32). ISH评估的大多数这些基因的转录水平(SI表2)和/或基因芯片(图4B类)WT和抄送7−/−出生时和胚胎发育期间的瓣膜。然而赫贝格夫在新生儿中下调2到4倍抄送7−/−SLV，我们通过定量PCR证实(图4D类). 其他器官，包括心肌，保持正常的表达水平(图4D类). 阀门增厚赫贝格夫−/−小鼠与妊娠中期骨形态发生蛋白信号转导和瓣膜细胞增殖增加有关(30). 我们在抄送7−/−心脏瓣膜(图4 E–H（E–H）). 基因剖析抄送7−/−SLV传单还显示肾上腺髓质素(管理员)与对照组相比(图4C类). 此外，一些与Adm功能相关的基因的表达，如补体因子H(Cfh（立方英尺）)，von Willebrand因子(Vwf（沃尔沃）)、和第9a1列(33)，在抄送7−/−小型货车(图4C类).管理员其他新生儿的表达未受影响抄送7−/−测试的组织(图4D类). 因此，下调管理员，比如赫贝格夫似乎不是一般缺陷，但仅限于SLV传单。瓣膜微血管细胞无法从数量足够高的小叶中分离出来进行培养。这阻止了任何试图证明体外调制赫贝格夫和管理员表达对CXCL12或CXCL11的反应。我们测试了培养的内皮细胞的其他系统，但无法显示这两个基因对CXCL12或CXCL11的调节（数据未显示）。这表明赫贝格夫和管理员表达是抄送7这些基因的CXCR7依赖性表达仅限于发育中的瓣膜小叶。

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新生儿基因图谱抄送7−/−SLV。ECM和粘附基因在WT和抄送7−/−分离的SLV传单(A类)，与SLV缺陷相关的基因(B类)和与Adm功能相关的基因(C类). 信号强度为彩色编码(A–C). (D类)qRT-PCR分析赫贝格夫和管理员在各种控制和抄送7−/−新生儿器官。数值±SEM(E–H（E–H）)E14.5对照组（+/+）和抄送7−/−（−/−）SLV。显示每种染色和基因型SLV阳性细胞核的百分比。*，P（P）< 0.01; **,P（P）< 0.001.

CXCL12和CXCL11是CXCR7仅有的两个趋化因子配体。

SLV在年正常发展Cxcl12型−/−老鼠(4)表明CXCL12不同的配体可能参与了CXCR7在瓣膜形态发生中的功能(18). 我们测试了一系列趋化因子与之竞争的能力125I-CXCL12与人CXCR7转染体结合(SI图12A类). 只有CXCL12（SDF-1）和CXCL11（ITAC）可以取代125I-CXCL12绑定，CXCL11不如冷CXCL12有效(SI图12B类)，与最近发表的研究结果相似(8，9). 然而Cxcl11号机组不同小鼠品系的序列显示，C57BL/6抄送7−/−小鼠是天生的空突变体Cxcl11号机组(SI图12C类)，因为在C57BL/6序列的起始密码子之后不久的2-bp插入产生了导致过早终止密码子的移码。因为C57BL/6小鼠在缺乏功能拷贝的情况下正常发育Cxcl11号机组，CXCL11/CXCR7相互作用不太可能在SLV形成中发挥非冗余作用。

CXCR7和CXCR4形成异二聚体，增强对CXCL12的响应信号。

我们和其他人(9)在CXCL12或CXCL11刺激后，未能检测到CXCR7表达细胞的钙流量或迁移行为。此外，DRYLAIV基序在大多数趋化因子受体中保守，被认为是G蛋白偶联和钙信号传递的必要基序(34)在CXCR7中更改为DRYLSIT。因此，CXCR7可能不是一个经典的趋化因子受体，而是一个诱饵或趋化因子转运受体，类似于其他内皮表达受体，如D6、CCX-CKR和DARC(34). 另一种解释是，CXCR7可能不是单独起作用，而是通过形成异二聚体复合物来调节CXCR4的功能，如其他趋化因子受体所示(35–37)尽管这一现象的重要性体内未知。我们使用FRET测试了这一假设，FRET是一种允许异二聚体复合物的时间和空间分辨率的技术。

用瞬时转染CXCR4–氰基荧光蛋白（CFP）和CXCR7–黄色荧光蛋白（YFP）的HEK293细胞进行FRET分析。在没有配体的情况下，在细胞膜上检测到CXCR4和CXCR7的预成型二聚体，也有证据表明细胞内存在异二聚体池(图5A类). 使用HEK293细胞（内源性表达CXCR4）、CXCR7稳定转染的HEK292细胞或自然表达CXCR4+低水平CXCR7的IM-9细胞进行免疫沉淀实验(SI图13A–D)在CXCL12存在或不存在的情况下，证实在两种细胞系中均存在CXCR7/CXCR4异二聚体(SI图13A类和D类).

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CXCR4和CXCR7形成功能性异二聚体。(A类)瞬时转染CXCR4-CFP和CXCR7-YFP的未刺激HEK293细胞的FRET测量。显示了YFP漂白之前（CFPpre）和之后（CFPpost）的CFP发射以及假彩色合并图像（FRET）。数据表示为FRET效率±SD的百分比(B类)代表性Ca2+CXCL12在同时表达CXCR7和CXCR4或仅表达CXCR4的HEK293细胞上触发的通量。结果以最大趋化因子诱导钙的百分比表示2+响应。(C类)CXCL12刺激HEK293或CXCR7转染的HEK293.后的抗磷酸ERK免疫印迹。用抗ERK抗体控制蛋白质负荷。

趋化因子受体异二聚体增加趋化因子反应的敏感性和动态范围(35). 我们评估了CXCL12诱导的钙2+HEK293和CXCR7中的通量稳定地转染了HEK293.细胞。添加CXCL12诱导了更强的Ca2+共表达CXCR4和CXCR7的细胞比对照（仅限CXCR4）细胞的通量(图5B类). 趋化因子触发MAPK激活(38，39)异二聚体可以激活不同于同二聚体激活的信号通路(35). 我们使用稳定转染的HEK293细胞评估CXCR7共表达是否会影响CXCL12通过CXCR4诱导的ERK1/2磷酸化。然而，在仅表达CXCR4的细胞中检测到ERK的双相激活，在3和30分钟时达到峰值，而在CXCR4和CXCR7共存的细胞中，CXCL12诱导ERK激活的延迟峰值没有初始峰值(图5C类和SI图13E类). 总之，CXCR4/CXCR7形成异二聚体，这两种受体的共表达诱导更强的Ca2+流量比CXCR4单独和调节下游信号通过ERK1/2。

讨论

CXCR7是一种高度保守的趋化因子受体，与趋化因子CXCL12具有高亲和力。与其他CXCL12受体CXCR4类似，CXCR7广泛表达并在胎儿发育中发挥作用。抄送7−/−小鼠出现了房间隔缺损和膜下室间隔缺损以及SLV重塑受损，但迄今为止没有明显的免疫或脑表型。

内皮特异性失活使用Tie2-Cre铁路小鼠重述抄送7−/−小鼠表型，支持CXCR7在内皮生物学中的主要作用。

我们在抄送7−/−尽管该受体对其配体CXCL12没有明显的信号传导。一种可能的解释是，CXCR7与CXCR4形成异二聚体，并调节CXCR4向CXCL12的信号传导。在心里，抄送7表达仅与Cxcr4号机组在瓣膜形成区，尤其是流出道间质中表达，随后在微血管中表达。因此，这些位点上相应蛋白质的异二聚体化可能是正确的瓣膜形态发生所必需的。最近的研究表明，许多G蛋白偶联的七跨膜受体，包括趋化因子受体，以同二聚体和异二聚体的形式存在，这些构象在受体生物学方面可能很重要，从个体发育到药理学和信号传递特性的调节(37，40，41). 在免疫突触处，CXCR4/CCR5异二聚体招募Gαq个亚单位（而不是Gα我)并向T细胞诱导共刺激信号(36). 事实上，异源二聚体和相关的信号传导效应可能是内皮细胞中非信号化趋化因子受体广泛表达的原因之一(34). 然而，趋化因子受体异二聚体化的意义体内仍不确定。描述的表型差异抄送7−/−（此处报道）和Cxcr4号机组−/−老鼠(三，5–7)以及最近研究这些受体在斑马鱼发育中的作用的工作(42，43)支持另一种假设，即CXCR7和CXCR4可以具有不同的生物学作用。

最近的一项研究表明，CXCR7促进血管生成，而阻断CXCR7则抑制小鼠模型中的肿瘤生长(9). 我们没有观察到抄送7−/−老鼠；然而抄送7与新生儿瓣膜中至少两个内皮表达的血管生成基因下调相关，赫贝格夫和管理员HB-EGF途径成分的突变导致骨形态发生蛋白信号和增殖增加，与瓣膜增厚相关(27，30，32，44). 在中观察到类似的变化抄送7−/−SLV，表明抄送7−/−小鼠部分源于赫贝格夫通过ISH赫贝格夫和抄送7在妊娠中期非常相似赫贝格夫使用Tie2核心综述了在完全缺失等位基因纯合子胚胎中发现的瓣膜缺陷(31). 然而，更多赫贝格夫−/−小鼠存活率（40%）高于抄送7−/−老鼠(30)这意味着其他的改变也有助于抄送7−/−老鼠。我们观察到管理员出生时，一种已知的对胚胎发育至关重要的血管保护剂(45).管理员所有其他受试组织中的表达均未受影响，尚不清楚SLV中其下调是观察到的心脏瓣膜表型的原因还是结果。两者联合下调赫贝格夫和管理员可能引发SLV功能的严重损伤，并可能导致观察到的早期致命性抄送7−/−老鼠。

SLV在年正常发展Cxcl12型−/−老鼠(4)表明CXCL12不同的配体可能参与了CXCR7在瓣膜形态发生中的功能。然而，因为Cxcl12型−/−小鼠在129xC57BL/6混合背景下产生并表达CXCL11，我们不能排除CXCL11通过CXCR7在这些小鼠中的代偿信号作用。此外，由于C57BL/6小鼠在缺乏Cxcl11号机组，CXCL11/CXCR7相互作用不太可能在SLV形成中发挥非冗余作用。因此，尽管CXCL12和CXCL11通常在功能上是多余的，但也可能存在CXCR7的as-yet-unidentified配体参与瓣膜形态发生。

缺乏的小鼠的表型Cxcl12型，Cxcr4号机组，或抄送7强调某些趋化因子和受体在胚胎发育中的重要作用。可以想象，趋化因子受体最初的进化功能是在胚胎或胎儿发育过程中充当引导分子，CXCL12与CXCR4结合在这一过程中有明确的作用(1). 免疫系统可能已经接受、复制和精炼了特定的免疫细胞迁移受体。我们的结果揭示了CXCL12受体CXCR7和CXCR4的不同作用。CXCR7在心脏发育中起着重要作用，需要进一步研究以确定该作用与其在肿瘤血管生成中的作用之间的确切联系(9). 无论如何，通过基因缺失对CXCR7作用的研究为心脏瓣膜形态发生提供了深入的见解，这最终可能与确定导致人类心脏瓣膜缺陷的其他因素有关。

材料和方法

的生成抄送7液氧/+老鼠。

抄送7液氧/+小鼠在Ozgene（澳大利亚Bentley DC）出生。简言之，LoxP位点被插入C57BL/6中编码CXCR7的外显子2周围抄送7基因组DNA。电穿孔Bruce 4 C57BL/6 ES细胞。嵌合体雄性抄送7液氧/+将ES细胞与C57BL/6J雌性交配以获得抄送7液氧/+老鼠。抄送7液氧/+小鼠与C57BL/6杂交CMV-Cre公司(46)或C57BL/6Tie2-Cre铁路/+转基因小鼠(20)产生生殖系或内皮特异性缺失抄送7(SI图6). 所有涉及小鼠的实验程序均按照加文研究所/圣文森特医院动物伦理委员会和动物资源中心/奥兹金动物伦理委员会批准的方案进行。

免疫组织化学和细胞化学。

4%多聚甲醛固定蜡包埋后进行免疫组织化学和细胞化学。在柠檬酸盐缓冲液中在亚沸点下进行抗原回收步骤8分钟后，应用抗磷Smad1/5/8（9511S；细胞信号技术，马萨诸塞州贝弗利）和磷组蛋白H3（06-570；Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY）。对两个对照组和两个突变株的每个SLV的至少三个片段进行计数（每个基因型>2000个细胞）。使用χ进行统计分析2测试。按照制造商的方案，使用酯酶活性染色试剂盒（西格玛-奥尔德里奇，密苏里州圣路易斯市）对E17.5胚胎的股骨石蜡包埋切片进行氯乙酰酯酶的细胞化学。按照制造商的方案，用Russell-Movat五色染色试剂盒（加利福尼亚州洛迪市美国Master Tech Scientific）对肌腱测微计切片进行染色。其他切片用番红花O染色。

RNA提取、基因芯片杂交和基因图谱分析。

Affymetrix 430 2.0基因芯片与从显微镜下解剖的新生儿SLV RNA合成的cRNA杂交。在独立杂交中使用了两个不同的WT和突变SLV RNA库。cRNA被制备，基因芯片被杂交并如前所述进行扫描(16). 基因图谱分析在SI文本.

qRT-PCR。

按照制造商的指示，使用Reverse-IT RTase Blend Kit（Abgene，Surrey，U.K.）从100 ng总RNA合成cDNA。对至少三个独立的WT和抄送7−/−对每个组织的样本进行分析，并一式三份进行实验。用β-actin标准化cDNA总量。引物序列可以在SI表3.

ISH公司。

ISH是使用传统方案进行的（参见SI文本). 使用中描述的引物扩增探针模板SI表3并通过测序进行验证。

法国。

通过以1:1的比例瞬时转染CXCR4-CFP和CXCR7-YFP并在盖玻片室（Nunc，Rochester，NY）中培养48小时的HEK293细胞（美国型培养物收集系TIB202）的光漂白来测量FRET。CXCR7-CFP和CX3CR4-YFP获得了相同的结果。细胞通过激光扫描共焦显微镜成像（日本东京奥林巴斯；IX81）。转染CXCR4-CFP和CXCR7-CFP的HEK293细胞作为阴性对照。数据报告为平均值±标准偏差。使用未配对学生的t吨测试。有关典型FRET实验的详细描述，请参阅SI文本.

西部印记。

20 nM浓度的CXCL12刺激的HEK293细胞或CXCR7稳定转染的HEK2903细胞或IM-9细胞（2×107)在20 mM三乙醇胺（pH 8.0）、300 mM NaCl、2 mM EDTA、20%甘油、2%洋地黄素、10 mM原钒酸钠、10μg/ml亮氨酸肽、10μg/ml抑肽酶中在4°C下溶解30 min，然后离心（15000×克，15分钟，4°C），并用抗磷酸-ERK1/2（加州圣克鲁斯圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术公司）进行Western blot处理。

钙的测定。

未转染或CXCR7稳定转染HEK293细胞（2.5×106细胞/ml）重新悬浮在含有10%FCS和10 mM Hepes的RPMI培养基1640中，并与Fluo-3（加州La Jolla Calbiochem）孵育。清洗细胞，将其重新悬浮在含有2 mM CaCl的RPMI中2，并在添加CXCL12之前保持在4°C。在525nm处用EPICS XL流式细胞仪（佛罗里达州希亚莱的库尔特）测量钙通量。

补充材料

支持信息：

致谢

我们感谢O.Prall、M.Costa、M.Furtado、S.Liu、J.Zanders和R.Bouveret对手稿的评论，以及R.G.Graham的有益讨论。这项工作得到了澳大利亚国家卫生和医学研究委员会、英国惠康信托基金和新南威尔士州癌症研究所的支持。

缩写

SLV公司半月瓣
ISH公司就地杂交
E类n个胚胎期n个
MZ公司边缘地带
CFP公司色荧光蛋白
YFP公司黄色荧光蛋白。

脚注

作者声明没有利益冲突。

这篇文章是PNAS直接提交的。

数据存储：本文报告的数据已存储在基因表达综合数据库（GEO）中，网址：www.ncbi.nlm.nih.gov/geo（加入编号。GSE8710型).

本文包含在线支持信息，网址为www.pnas.org/cgi/content/full/0702229104/DC1.

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文章来自美国国家科学院院刊由以下人员提供美国国家科学院