丝氨酸/苏氨酸激酶mTOR存在于两个独立的复合物中。mTORC1控制细胞新陈代谢，包括mTOR和包括猛禽在内的几个调节亚单位，而mTORC2是一种包含猛禽的复合物，调节肌动蛋白细胞骨架动力学9。至少有两个独立的信号事件调节mTOR活性，以响应营养素的可用性。其中一个信号来自生长因子受体，该受体通过结节性硬化复合物（TSC1/2）和Ras-家族GTP-结合蛋白Rheb激活mTOR。这通过不同的上游途径发生，包括PI3激酶和Akt/PKB9-12氨基酸调节mTOR活性的机制还不太清楚，但Rag GTPases和Ragulator复合体可以通过使mTORC1接近其激活物Rheb，从而增强mTORC 1与晚期内体/溶酶体室的结合，从而调节这种反应三,4,13.mTORC1激活通过其磷酸化底物p70-S6激酶（S6K）和4E-BP刺激蛋白质合成10-12相反，饥饿使mTORC1失活，从而抑制合成代谢过程，并通过激活自噬释放营养储备。在自噬过程中，细胞质蛋白质、蛋白质复合体和细胞器被称为自噬体的双层膜囊泡吞噬，这些囊泡沿着微管向两端运输，最终与溶酶体融合，在溶酶体中其内容物被降解5,6,8因此，溶酶体密切参与营养反应，因为它们是mTORC1激活的位点和自噬的汇点。
据报道，营养缺乏会从溶酶体中释放mTOR，而氨基酸补充会恢复mTOR的溶酶体定位及其活性三,4。我们使用三种不同的饥饿方案扩展了这些观察结果（参见方法). 如前所述，完全营养剥夺三,4mTOR与晚期内胚体/溶酶体标记物LAMP1或LAMP2之间的共定位减少，并且抑制了mTOR活性，这是通过S6K在mTOR特异性磷酸化位点的磷酸化状态进行检测的(图S1a-c，数据未显示）。然而，更温和（但更生理性）的饥饿方案允许mTOR在溶酶体上保留，而不会阻止mTOR活性的丧失(,图S1d-i). 然而，我们注意到溶酶体和溶酶体相关mTOR的细胞内分布与营养状态和mTOR活性相关。所有三种饥饿方案都增加了以核周溶酶体为主的细胞比例，而在恢复后（单独补充氨基酸或与血清一起补充氨基酸），mTOR活性的恢复与LAMP1-和mTOR阳性小泡在细胞外围的定位增加平行，包括质膜投射，如跛足(,图S1a-l). 如前所述三,4与溶酶体相关的是mTORC1，而不是mTORC2，因为LAMP1阳性小泡与mTORC1-复合特异性亚单位猛禽共定位，而不是与mTORC 2特异性猛禽(图S2a，b).
饥饿反应中mTORC1信号的变化与溶酶体定位相关。（a-c）HeLa细胞未经处理，氨基酸/FBS饥饿5小时，或饥饿后在含有氨基酸/FBS的培养基中恢复，然后进行免疫染色，或使用所示抗体进行免疫印迹。彩色化面板显示mTOR和LAMP1信号之间的重叠。注意，溶酶体mTOR定位的变化（量化为LAMP1阳性小泡主要位于外周的细胞百分比，（a）和（c））与mTORC1活性相关（磷酸化S6K水平相对于总S6K，（b））。（d） 血清饥饿后恢复时激活的Akt的视觉化。营养恢复后，LAMP1阳性囊泡定位于具有较高浓度磷酸化Akt的外围区域。对于所有面板，数值均为三次独立实验的平均值±标准偏差。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005 t检验；其他比较不显著。显示了系列共焦光学截面的代表性最大强度投影。斑点的未裁剪图像如所示补充图7.
我们研究了mTORC1活性和溶酶体定位之间的相关性是否是一种副现象，或者它们是否有因果关系。首先，我们测试了LAMP1阳性囊泡定位的变化是否是mTOR活性改变的结果。然而，无论是通过猛禽或猛禽siRNA敲除或其特异性抑制剂雷帕霉素抑制mTOR信号传导，还是通过mTOR、猛禽或Rheb的过度表达上调mTORC1活性，都不会影响LAMP1阳性囊泡的定位(图S2a-k). 同样，溶酶体定位与mTORC1上游的Akt活性无关(图S2l-t). 因此，我们考虑了溶酶体定位影响mTORC1活性的另一种可能性，因为溶酶体mTORC2的外围定位将使其更接近细胞膜上的上游信号分子，例如Akt的活性形式，在恢复阶段，在靠近质膜的地方检测到一个主要的池（在饥饿期间是不活动的）()14,15.
因此，我们研究了独立于营养物质可利用性变化而改变溶酶体定位的因素是否影响mTORC1活性。用微管解聚药物诺卡唑进行短期治疗，将溶酶体均匀地分散在细胞中，消除了饥饿/恢复治疗期间溶酶体定位的任何差异(). 诺卡唑在全组织培养基的基础条件下倾向于抑制mTORC1活性，并阻止饥饿后营养恢复时mTORCl信号的完全恢复().
改变溶酶体定位的因素也会影响mTORC1信号。（a） 和（b）诺卡唑能消除溶酶体mTOR定位的差异，并抑制mTORC1信号，以应对营养物质可用性的变化。细胞被视为然后在固定/溶解前的最后2小时内用二甲基亚砜（载体）或诺康唑孵育。样品通过免疫荧光（a）或免疫印迹（b）进行分析。phopho-S6K水平的量化如（b）所示。（c-f）驱动蛋白或小GTPase家族成员诱导的溶酶体定位变化（c，d）与mTORC1活性变化（e）相关。如图所示，用过表达构建物或siRNA转染HeLa细胞，然后进行免疫荧光（c，d）或免疫印迹（e）分析。数值为三次独立实验的平均值±标准偏差。所有比较均与各治疗条件下的对照组比较，*p<0.05，***p<0.005 t检验；n.s.不重要。斑点的未裁剪图像如所示补充图7.
我们通过过度表达两个驱动蛋白超家族成员KIF1Bβ和KIF2来验证我们的假设，这两个超家族成员将溶酶体重新分配到细胞外周16,17驱动蛋白诱导的LAMP1-和mTOR-阳性小室周围定位增加与mTORC1活性增加相关(). 小GTPase ARL8B（类ARF，也称为Gie2）定位于溶酶体并将其分布到外围18-20我们证实了这些数据，并发现ARL8B的过度表达，像驱动蛋白一样，增加了溶酶体mTORC1在细胞外周的定位并增强了其活性(,图S3a). 我们还通过敲除KIF2和ARL8B来测试相反的情况，发现它导致溶酶体聚集在微管组织中心（MTOC）周围，这与mTORC1活性降低有关(). 短期诺卡唑治疗消除了ARL8B引起的溶酶体定位差异，也消除了ARL 8B敲除或过度表达的差异效应(图S3b). 因此，ARL8B对mTORC1活性的影响不太可能是由于ARL8B与mTORC2的直接相互作用，而是微管依赖性的，与溶酶体定位相关，与溶菌体定位调节的mTORCl活性一致。
通过ARL8B过度表达迫使溶酶体到达细胞外周，或通过ARL8 B或KIF2敲除诱导溶酶体的核周聚集，阻止了通常发生在饥饿/恢复期的溶酶体分布的变化(). 这使我们能够测试在饥饿/恢复期间mTORC1信号的变化是否需要适当的溶酶体定位。饥饿期间，未检测到mTORC1活性（通过S6K磷酸化进行评估），即使溶酶体由于ARL8B过度表达而保持外围状态，这表明在营养素诱导的上游信号缺失的情况下，溶酶体和溶酶体mTOR的外围定位不足以实现mTORC2信号传递(). 然而，ARL8B过度表达介导的主要外周溶酶体定位增强了饥饿后添加营养素时mTORC1信号的诱导，同时通过ARL8B或KIF2敲除阻止溶酶体传播减少了恢复期mTOR信号的恢复(). 因此，溶酶体分布似乎调节了mTORC1对营养物质的信号反应强度。
溶酶体定位调节饥饿后mTOR信号的恢复。（a-c）转染ARL8B或KIF2 siRNA的HeLa细胞，或转染ARL 8B过表达构建物（非靶向siRNA和空pCDNA载体用作转染对照）的HeLa细胞，未经处理，血清/氨基酸饥饿5小时，或饥饿后在氨基酸和含FBS的培养基中恢复30分钟。使用LAMP1抗体（a）对细胞进行免疫染色，并使用所示抗体（b）或免疫印迹（c）对LAMP1阳性囊泡主要位于外周的细胞百分比进行量化。磷酸-S6K水平相对于总S6K的定量如（c）所示。数值为三次独立实验的平均值±标准偏差。所有比较均与各治疗条件下的对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，**p<0.005 t检验；n.s.不重要。斑点的未裁剪图像如所示补充图7.
为了研究溶酶体定位变化对营养素的响应机制，我们测试了饥饿/恢复方案是否影响pH值我控制溶酶体定位1所有三种饥饿方案都增加了pH值我从~7.1到~7.7，营养恢复后恢复到基础水平(). 这种pH值我这些变化足以影响全组织培养基中溶酶体的定位和mTORC1活性(). 重要的是，通过调节ARL8B或KIF2水平改变溶酶体定位不会影响pH值我(). 这些结果表明，营养水平控制pH值我改变溶酶体定位，从而影响mTOR信号。
营养素通过调节pH值控制溶酶体定位我KIF2和ARL8B的溶酶体水平。（a） 饥饿会增加pH值我使用三种不同的方案让HeLa细胞挨饿（参见方法)有或没有后续恢复。（b-d）改变pH我从7.1到7.7足以影响溶酶体的定位和mTORC1活性。酸碱度我在含有尼葛酸的全组织培养基中滴定，该培养基可以强制改变pH值我通过改变培养基中的pH值，然后使用如图所示的抗体进行免疫染色（b、c）或免疫印迹（d）。（e） 溶酶体定位的变化对pH值没有影响我ARL8B和KIF2在HeLa细胞中过度表达或被敲除，随后pH值升高我测量。（f，g）营养素和pH我影响溶酶体组分中ARL8和KIF2的水平。经过1小时营养剥夺/恢复（f）或1小时pH变化的HeLa细胞总细胞裂解物或分离溶酶体组分中的蛋白质水平及其定量我在全组织培养基中显示了含有尼日尔菌素（g）。（h，i）营养素和pH值的影响我ARL8和KIF2与聚合微管的结合。HeLa细胞按面板（f）和（g）处理，然后分离聚合微管部分和western印迹。星号表示非特定带。
对于所有面板，数值均为三次独立实验的平均值±标准偏差。在每种治疗条件下，所有比较均与对照组进行，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005 t检验；n.s.不重要。斑点的未裁剪图像如所示补充图7.
我们推测营养素和pH值我可能通过影响KIF2或ARL8B等蛋白质与溶酶体或微管的结合来影响溶酶体运动。营养缺乏和pH值升高我降低溶酶体组分中这些蛋白质的水平，同时恢复营养或基础pH值我完全或部分逆转了这种表型(). 然而，饥饿和高pH值我似乎不会通过减少KIF2和ARL8B与聚合微管的结合来降低它们移动溶酶体的能力(). 因此，营养素可以通过维持较低的pH值来刺激溶酶体向细胞外围的再分配我有利于控制细胞内定位的蛋白质向溶酶体募集，而饥饿会增加pH值我并从溶酶体中置换这些蛋白质。
通过影响mTORC1活性，溶酶体定位可以调节自噬体的形成。溶酶体的核周定位也应有助于自噬体与溶酶体融合，方法是将更多的溶酶体放置在细胞内随机形成并沿着微管向MTOC方向移动的自噬体内5因此，溶酶体定位可以在起始和终止阶段协调自噬通量(). 这与以下观察结果一致：饥饿，同时增加自溶体形成（检测到稳定表达mRFP-GFP串联荧光标记LC3（tfLC3）的细胞中GFP-猝灭、仅mRFP-微管相关蛋白1轻链3（LC3）阳性点的比例增加）21)在某些细胞中，可以减少自噬体的稳态数量（这与LC3（LC3-II）的脂化、自噬相关形式相对于肌动蛋白的水平有关22)表明饥饿同时增加了自噬体/LC3-II的形成和降解速率(,图S4a-c).
溶酶体定位调节自噬。（a） 图示溶酶体定位如何协调mTOR信号和自噬。外周溶酶体定位（营养诱导）增加mTOR活性（阻止自噬体合成）并减少自噬小体与溶酶体的融合。饥饿诱导的溶酶体聚集降低mTOR活性（激活自噬体合成）并促进自噬小体-溶酶体融合。（b，c）5 h血清和HeLa细胞的氨基酸饥饿降低了LC3-II水平（b），但增加了使用tfLC3（c）检测到的自溶体数量。对于tfLC3，GFP-和RFP阳性的点状物代表溶酶体融合前的自噬体，而RFP阳性/GFP阴性的点状物代表自溶体-GFP被低溶酶体pH值更快地猝灭（见方法). 自溶体增加表明饥饿诱导的LC3向溶酶体的通量增加。（d） ARL8B敲除增加自噬体合成。将siRNA-转染的HeLa细胞培养48小时，然后不处理或用巴非霉素A1培养。对LC3-II水平与肌动蛋白进行量化（下图）。星号：非特定带。（e） ARL8B过度表达抑制自噬体的合成和降解。对过表达ARL8B或空载体的HeLa细胞进行分析，如（d）所示。（f） 用ARL8B过表达构建物或siRNA（非靶向siRNA和空pEGFP载体为转染对照）与mCherry-LC3共同转染HeLa细胞48 h。固定后，对细胞进行内源性LAMP1和DNA（DAPI）染色。显示了连续共焦光学切片的代表性最大强度投影。彩色化面板显示重叠的mCherry-LC3和LAMP1信号。（g-i）HeLa细胞自噬体-溶酶体融合的定量。定量自溶体（mCherry-LC3和LAMP1均阳性）与自噬体（m樱桃-LC3阳性，LAMP1阴性）的百分比。在面板（i）中，我们分析了固定前用诺康唑处理2小时的细胞，诺康唑分散了核周溶酶体簇（参见). （j） ARL8B过度表达和敲除后tfLC3表达细胞中的自噬体和自溶体数量。(图S5o显示了具有代表性的单元格）。在小组（g-j）中，我们在三个独立实验中分析了20个细胞/组。数值为三次独立实验的平均值±s.e.m，一式三份。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005 t检验；其他比较不显著（n.s.）。斑点的未裁剪图像如所示补充图7.
因此，我们研究了自噬通量是否受到调节溶酶体分布的因素的影响，重点关注对溶酶体定位和mTORC1活性影响最大的ARL8B。我们测量了稳态自噬体/LC3-II水平以及自噬小体形成（在存在阻止其降解的溶酶体抑制剂bafilomycin A1的情况下LC3-II水平）22.符合我们的预测()，ARL8B敲除增加了自噬体的形成（在巴非霉素A1存在下LC3-II水平）()与mTOR活性下降一致(). 当mTOR活性被抑制时，营养饥饿条件下ARL8B的敲除对自噬体的形成没有显著影响(图S4d). ARL8A是ARL8B的一个紧密同源物，ARL8B表型和这两个基因对自噬有加性作用(图S4e、f). 这些ARL8效应通过使用不同的智能池siRNA集以及单个siRNA寡核苷酸进行确认(图S4e-j). 与ARL8A/B类似，KIF2的敲除增加溶酶体核周定位并降低mTORC1活性()，也增加了自噬体的合成(图S4k-n).
ARL8B过度表达诱导的溶酶体散射增加了稳态LC3-II水平和自噬小泡的数量，而在巴非霉素A1的存在下，LC3-II的水平未受影响，甚至降低(,图S5a-e). 因此，ARL8B可以减少自噬体的形成（在bafilomycin A1存在下的LC3-II），以及自噬小体与溶酶体的融合（在正常培养基中LC3-II增加）。KIF2A过表达在LC3-II水平上模拟了这种作用，尽管其作用不太明显(图S5a-e). 我们可以通过同时敲除显示siRNA特异性的任一蛋白来挽救ARL8B和KIF2A过度表达的影响(图S5a-e). 正如之前在ARL8A敲除中所见，其过度表达现象复制了ARL8B过度表达对LC3-II水平的影响(图S5f).
为了进一步测试溶酶体定位是否会影响自噬体-溶酶体融合，我们测量了ARL8B对自噬体（用mCherry-LC3标记）与溶酶体（用抗LAMP1抗体或用lgp120-EGFP标记）共生的比例的影响。正如预测的那样()ARL8B的过度表达降低了自噬体-溶酶体的共定位(;图S5g，h). 这种自噬体-溶酶体融合缺陷不是由于溶酶体数量减少所致，因为ARL8B的过度表达并没有改变LAMP1、LAMP2或成熟组织蛋白酶D的表达(图S5i). ARL8B过度表达对自噬体-溶酶体融合的影响也不是由于mTOR活性增加和自噬小体合成减少所致。首先，尽管自噬体形成减少，但ARL8B过度表达增加了自噬小体总数()表明融合阶段出现了阻塞。其次，ARL8B过度表达导致自噬体/LC3-II水平增加，即使雷帕霉素阻断了mTORC1活性(图S5j). 事实上，雷帕霉素减少突变亨廷顿蛋白（一种自噬底物）积累的能力被ARL8B过度表达所阻断(图S5k). 最后，ARL8B以驱动蛋白和微管依赖的方式抑制自噬体-溶酶体融合(图S5l-n).
相反，ARL8B的敲除增强了自噬体与溶酶体的共定位()同时敲除ARL8B和ARL8A可增加自噬体-溶酶体融合(). 这反映了自噬体-溶酶体融合增加，而不仅仅是在紧密的核周簇中增加了邻近性，因为在随后的诺康唑治疗使溶酶体簇分散在细胞质中后，也观察到共定位增加(). 在tfLC3表达细胞中，ARL8B对自噬体-溶酶体融合的影响也得到了证实(,图S5o).
为了测试我们结果的潜在生理和临床相关性，我们使用不同的自噬底物研究了ARL8和KIF2过度表达和敲除对自噬流量的影响。其中包括与亨廷顿病相关的亨廷顿蛋白突变型（EGFP-httQ74）23，突变体A53Tα-突触核蛋白，可导致某些家族型帕金森病（EGFP-A53T）24和牛结核分枝杆菌变种Calmette-Guérin芽孢杆菌（卡介苗）与结核分枝杆菌相关25,26在这些疾病模型中，ARL8或KIF2敲低通过降低致病性自噬底物的水平而受到保护，而过表达具有相反的作用(图S6a-n). 与其在mTOR信号转导和自噬敲除中的作用一致果蝇ARL8同源物降低S6K磷酸化并抑制聚谷氨酰胺毒性体内(图S6o，p).
总之，溶酶体改变其细胞内定位以响应营养物质的可用性，从而协调mTORC1活性、自噬体合成和自噬-溶酶体融合。在饥饿期间，mTORC1活性受到抑制，从而诱导自噬体的形成。饥饿会增加pH值我，导致溶酶体聚集在MTOC附近，促进自噬体-溶酶体融合。这可能是由于调节溶酶体顺行运动的蛋白质在溶酶体中的pH依赖性丢失。相反，营养补充可恢复基础pH值我诱导溶酶体散射，将溶酶体mTORC1带到细胞外围，并通过增加其与来自质膜的信号分子梯度的耦合来刺激其活性14,15如本文所述，活性Akt的细胞内梯度与之前的观察结果一致，例如，Akt在趋化细胞前沿的定位和激活27.
我们的数据与调节mTORC1信号的多种独立机制一致三,4,10,11,13mTORC1的溶酶体结合是氨基酸激活其所必需的，但对溶酶体的组成性靶向性并不能完全消除其对氨基酸的敏感性，这暗示了其他调节机制三虽然饥饿后恢复阶段的溶酶体再分配可能不是mTOR激活的最初或唯一触发因素，但溶酶体定位允许另一水平的控制，调节和加强mTOR的其他信号输入。
虽然大多数已知的自噬诱导信号都会影响自噬体的合成，但这里我们表明，典型信号饥饿在合成和自噬-溶酶体融合阶段都会产生影响，这将大大提高自噬底物分解代谢的传递效率，与增加自噬体合成相比。这将增强饥饿期间自噬介导的营养物质释放，促进二次能源的快速利用，从而促进细胞存活。这可能是一种适应，在高等真核细胞中具有特殊优势，其中自噬体通常形成于远离溶酶体的位置，而酵母自噬小体起源于液泡附近。
最后，自噬被越来越多地认为是多种人类疾病的中心细胞过程，包括癌症、神经变性和传染病。在这种情况下，我们的发现可能具有治疗潜力，因为ARL8蛋白是GTPases，因此提供了潜在的药物靶点。例如，mTORC1活性增加和自噬减少与肿瘤发生有关，溶酶体扩散与转移有关28我们的数据表明，所有这些现象都可能是ARL8抑制的靶点。此外，由于ARL8活性的抑制增加了多种疾病相关自噬底物的清除，因此ARL8抑制可能为各种感染性疾病和神经变性疾病提供一个可控制的治疗靶点。
