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单元格。作者手稿；PMC 2012年1月21日提供。
以最终编辑形式发布为：
单元格。2011年1月21日；144(2): 253–267.
数字对象标识：2016年10月10日/j.cell.2010.12.018
预防性维修识别码：项目经理3038590
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院260687
PMID：21241894

RalB和外囊通过直接激活自噬体组装体介导细胞饥饿反应

布莱恩·博德曼,1 安东尼·奥维达尔,2 子陵城,1 罗莎琳·R·拉姆,1 欧一宏,1 艾蒂安·福斯特彻,三 Mekhala Maiti公司,1 C.克莱顿·黑泽利特,4 埃里克·沃森,5 玛丽亚·巴拉基列娃,6 雅克·卡莫尼斯,6 查尔斯·伊曼,4 贝斯·莱文,2和迈克尔·怀特1
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摘要

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对哺乳动物细胞中大分子自噬的研究表明，诱导、囊泡成核和膜伸长复合物是驱动自噬体生物发生的关键信号中间体。这些成分是如何被招募到新生的自噬体中的尚不清楚，尽管人们对抑制自噬的信号机制知之甚多，但促进自噬阳性诱导信号的性质仍不清楚。我们发现Ras-like小G蛋白RalB定位于新生的自噬体，在营养缺乏时被激活。营养缺乏诱导的自噬细胞增多需要RalB及其效应物Exo84，而RalB的激活足以促进自噬体的形成。通过与Exo84直接结合，RalB诱导在外囊上组装催化活性的ULK1和Beclin1-VPS34复合物，这是隔离膜形成和成熟所必需的。因此，RalB信号是对营养限制的一种主要适应性反应，通过核心囊泡成核机制的动员直接参与自噬细胞增生。

介绍

宏观自噬（以下简称自噬）在组织内稳态、细胞适应营养限制、清除病原体和功能失调的细胞器中的关键作用表明从头开始双膜自噬体的产生需要对指定位置、内容物和持续时间的诱导信号作出反应(Kissova等人，2004年;Noda等人，1995年;Yang等人，2006年). 已经确定了一些关键的信号事件，指明了自噬体的生物发生。其中最早的是ULK1-Atg13-FIP200诱导复合物上抑制性mTOR依赖位点的去磷酸化(细川等人，2009a;细川等人，2009b). 这可能释放了ULK1活性，以促进ULK1-ATG13-FIP200复合物的自动磷酸化和与维他滨特异性自噬蛋白ATG101的组装(Hosokawa等人，2009a;细川等人，2009b;Jung等人，2009年;Mercer等人，2009年). 通过目前未描述的机制，这导致自噬特异性III类PI（3）K复合物Beclin1-ATG14L-VPS34-VPS15复合物的激活。这种活性用磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI（3）P）包裹在杯状隔离膜上，PI（3(铃木等人，2001). 两种泛素样分子ATG12和LC3分别与ATG5和磷脂酰乙醇胺结合以促进自噬体的形成。ATG12被ATG7（E1）激活，转移到ATG10（E2），然后共价连接到Atg5上的内部赖氨酸(水岛等人，1998年a;水岛等人，1998年b). 在第二个结合系统中，LC3首先被半胱氨酸蛋白酶ATG4裂解，ATG4暴露出C末端甘氨酸残基。ATG7（E1）激活LC3并将其传输至ATG3（E2）(阿马尔等人，2006年;Tanida等人，2004年;Tanida等人，2002年). 然后在ATG5/12结合物的协助下，LC3与磷脂酰乙醇胺结合(Fujita等人，2008年;Hanada等人，2007年;Kabeya等人，2000年). 脂化LC3，LC3-II覆盖在自噬体的内外表面，与ATG5一起，分别作为自噬小体和自噬前体的离散标记(George等人，2000年;Kabeya等人，2000年;Kabeya等人，2004年;水岛等人，2001年). 这些关键信号事件与动态膜事件相协调，最终形成双膜自噬体。自噬体最终与溶酶体融合，溶酶体通过溶酶体/液泡酸水解酶促进吞噬物质的周转。在自噬体生物发生过程中，信号中间产物如何与动态膜事件相协调目前尚不清楚。

RalA和RalB是Ras GTPase超家族的创始成员的近亲。它们参与对有丝分裂、营养、，和激素信号由一组不同的鸟苷酸交换因子产生，这些因子分为两大类：通过羧基末端Ras结合域直接Ras反应的因子和通过羧基端pleckstrin同源域明显被磷脂酰肌醇第二信使激活的因子(Bodemann and White，2008年;Feig，2003年). 虽然已确定许多RalGTP效应蛋白将RalA/B激活与动态细胞生物过程耦合，但Ral GTPases的首要任务是直接调节Sec6/8或胞外复合物(Bodemann and White，2008年;Feig，2003年). 异体外胚囊复合体的两个成员，Sec5(EXOC2公司)和Exo84(EXOC8公司)，是真正的效应分子，介导RalA/B对动态分泌囊泡靶向和栓系过程的调节(博德曼和怀特，2008年;Moskalenko等人，2002年;Moskalenko等人，2003年;Sugihara等人，2002年). 依赖RalA的外囊完整复合体的动员对于维持极化上皮细胞的顶/基底外侧膜特性至关重要(Moskalenko等人，2002年;Moskalenko等人，2003年)胰岛素刺激的谷氨酸4传递到脂肪细胞的质膜(Chen等人，2007年). 与调节膜运输不同，RalB被证明可以调节支持宿主防御反应的信号转导级联。在Toll样受体激活后，RalB/Sec5复合物组装直接参与天然免疫信号激酶TBK1的激活，以促进干扰素反应(Chien等人，2006年). 囊泡运输/栓系和信号级联组装/激活的作用组合表明，Ral/外囊效应器复合体可能会将动态膜运输事件与刺激依赖性信号事件协调起来。

在这里，我们发现小G蛋白、RalB和外囊的一个依赖于Exo84的亚复合体对营养饥饿和病原体诱导的自噬体形成至关重要。天然RalB蛋白定位于新生自噬体形成的位点，并在营养有限的条件下以“活性”GTP结合状态积聚。RalB是自噬体生物发生所必需的，并且足以激活人类上皮细胞中的自噬。作用机制是通过在RalB效应蛋白Exo84上组装活性ULK1-Beclin1-VPS34起始复合物直接触发囊泡成核。因此，RalB-Exo84效应器复合物定义了细胞对营养剥夺反应的关键近端调控成分。

结果

外囊与自噬体组装机械的联系

累积的观察结果表明，异辛基胞外囊（aka Sec6/8）复合体直接参与了对病原体挑战的适应性反应(Bhuvanakantham等人，2010年;Chien等人，2006年;石川和巴伯，2008;石川等人，2009年). 最引人注目的是，通过TBK1和STING的核心先天免疫信号由外囊的Sec5亚单位支持(Chien等人，2006年;石川和巴伯，2008;石川等人，2009年). 为了帮助产生可能解释外囊成分参与宿主防御信号传导的分子线索，我们使用高通量酵母双杂交筛选来分离与外囊亚单位相关的一组蛋白质(Formstecher等人，2005年). 在这个队列中，两者都是阴性的(RUBICON公司)和积极的(FIP200型,ATG14L型)在Sec3的一级相互作用邻域中分离出自噬调节剂（参见方法）。鉴于Ral/胞外信号和自噬在病原体识别和清除中的功能趋同，我们检测了人类上皮细胞培养中胞外成分和自噬者蛋白的相关性。通过表达co-IP验证Sec3与RUBICON和ATG14L的相互作用(图1A、B). 此外，Exo84和Sec5可以与RUBICON和ATG14L相互作用，如果自噬体机制/外囊相互作用发生在多亚单位外囊复合体的背景下，这是可以预料的(图1C、D、E、F). 胞外核心亚单位Sec8的免疫沉淀可恢复胞外复合体的所有特征成分(Grindstaff等人，1998年). 因此，为了检查外囊是否与驱动隔离膜伸长的LC3修饰机制有关，我们探索了Sec8复合物中是否存在ATG5/ATG12结合物。如图所示，Sec8-ATG5/ATG12复合物从两个过度表达的co-IP中恢复(图1G)和内源性蛋白的免疫共沉淀(图1H)表明外囊和自噬体组装机械的物理整合。

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Ral-包囊复合体与自噬机制的物理和功能相互作用

A-G：外囊亚单位与自噬蛋白相互作用。所指示的蛋白质在HEK-293细胞中过度表达，然后用针对特定标签的抗体进行免疫沉淀。免疫沉淀物与（A，B）GFP-Sec3共沉淀；（C，D）红色标志；（E，F）标记-ATG14L；和（G）GFP-ATG5，如图所示。全细胞裂解物（WCL）、免疫沉淀（IP）。

高：内源性Sec8复合物含有ATG5-12共轭物。用抗Sec8抗体从HEK-293细胞中免疫沉淀内源性胞外复合物，并用抗ATG5抗体分析ATG5/ATG12结合物（Sec8 IP）的共沉淀。抗-Myc免疫沉淀物用作阴性对照（Myc IP）。显示了两个独立的实验。显示了输入的全细胞非变性裂解物中检测的蛋白质的表示（WCL）。

我：抑制Ral信号阻断LC3对氨基酸饥饿的反应。转染Myc-Rip（RBD）Hela细胞48小时后，在DMEM或EBSS中再培养4小时，如图所示。分别使用抗Myc和抗LC3抗体通过免疫荧光检测Myc-Rip（RBD）和LC3。载体控制细胞与未转染细胞相似。比例尺20μm。

记者：抑制Ral信号阻断LC3对病原体感染的反应。如图所示，用单体RFP-LC3和Myc-Rip（RBD）或空载体对照转染Hela细胞。转染48小时后，细胞感染鼠伤寒沙门菌-GFP 1小时，然后在感染后3小时选择细胞内沙门氏菌。使用各自的荧光融合物对内部沙门氏菌和LC3进行可视化。方框所示亚细胞区域的高倍放大显示在右侧的面板中。虚线表示在饱和曝光中可见的细胞边界。比例尺10μm。

克：EBSS处理的细胞在单细胞分辨率下对应于Myc-Rlip（RBD）（抗-Myc）和内源性LC3（抗-LC3）的总荧光强度，如（I）所示（n=82，R2=0.7722）。

我：RalB足以诱导LC3穿孔的积聚。表达单体RFP-LC3和GFP-ATG5或GFP-RalB的Hela细胞如图所示。比例尺10μm。

男：对（L）中处理的细胞中的mRFP-LC3点进行定量。mRFP-LC3点状细胞/细胞的分布显示为盒须图。方框的三个带表示第25（下）、第50（中）和第75（上）四分位数。晶须延伸至四分位间距的1.5倍或最高或最低点，以较短者为准。+表示平均值。使用学生的t检验计算P值。

编号：表达RalB（23V）或转染载体对照的HBEC3-KT细胞在含有50μM氯喹（CQ）的生长培养基中培养4小时，以通过自噬体阻止LC3周转，然后用抗LC3抗体检测内源性LC3。

操作：RalB足以诱导自噬流量。如图所示，在生长培养基或无氨基酸的EBSS（厄尔平衡盐溶液）中培养HBEC3-KT细胞4小时，加入或不加入50μM氯喹（CQ），以防止LC3在自噬体中的周转。用抗LC3抗体进行免疫荧光，并对LC3点进行定量。数据表示为平均+/-SEM。

电话：将转染Flag-RalB（G23V）或载体对照的HBEC3-KT细胞的全细胞裂解物置于含有50μM氯喹（CQ）的培养基中培养4小时，分析LC3（I）和LC3（II）的相对积累。β-actin显示为一种负荷控制。

另请参见表S1.

RalB信号传导是诱导自噬体形成所必需和充分的

Ras-like GTPases RalA和RalB的主要职业是根据调节输入动员外囊组件(Balakireva等人，2006年;Cascone等人，2008年;Chen等人，2007年;Chien等人，2006年;Frische等人，2007年;Hase等人，2009年;Jin等人，2005年;拉利和霍尔，2005年;Moskalenko等人，2002年;Moskalenko等人，2003年;Rosse等人，2006年;Spiczka和Yeaman，2008年;Sugihara等人，2002年). 为了研究Ral-GTPase信号在自噬调节中的潜在参与，我们首先测试了阻断Ral-GTP/效应物相互作用对氨基酸饥饿诱导的自噬体积累和细菌病原菌分离膜包裹的影响。Ral效应器RalBP1/RLIP76（RLIP（RBD））的最小Ral-binding结构域的表达通过与Ral效应分子的直接竞争对内源性RalA和RalB蛋白的作用具有明显的抑制作用(Chien等人，2006年;Moskalenko等人，2002年). 如前所述(Fass等人，2006年;Pattingre等人，2005年)Earle’s碱性盐溶液（EBSS）对HeLa细胞的血清和氨基酸饥饿诱导内源性LC3蛋白从弥散的细胞溶质分布到浓缩的点状分布，并显著降低LC3总信号；与饥饿诱导的自噬体形成和成熟相一致。RLIP（RBD）表达阻断LC3点状形成和LC3翻转(图1I). 作为自噬流量的替代测量，我们定量了氨基酸饥饿后单个细胞的总内源性LC3信号，发现RLIP（RBD）的表达以剂量依赖的方式抑制了LC3蛋白的转换(图1K). 为了研究Ral信号对细胞膜的致病应答LC3修饰的作用，将表达mRFP-LC3的Hela细胞感染GFP-标记的细胞鼠伤寒沙门菌正如预期的那样，如果Ral信号支持这种反应，RLIP（RBD）表达会阻止LC3向内化沙门氏菌的募集(图1J). 此外，我们发现RalB的异位表达足以诱导宫颈癌细胞中LC3点的积聚(图1L、M)永生化支气管上皮细胞(图1N，O)在没有氨基酸饥饿或病原体暴露的情况下。值得注意的是，在营养丰富的条件下，RalB（G23V）的表达足以诱导LC3点状体的积累，其积累量是氨基酸缺乏诱导的4-5倍(图1O). 这种积累可能与自噬流量增加有关，因为氯喹介导的自噬体翻转抑制进一步增加了RalB（G23V）诱导的LC3点状细胞(图1O; P=0.011，学生T检验），这与磷脂酰乙醇胺结合LC3的积累相关(图1P). 因此，Ral信号似乎是参与自噬的必要且充分的。在果蝇dRal亚型（Ral35天)，具有与有丝分裂后细胞特异性凋亡相关的弱失峰表型(Balakireva等人，2006年). 通过体内表达相应的dsRNA，ATG14L、ATG1（ULK1）、ATG8a（LC3）、ATG16（Beclin）或VPS34的耗竭显著增强了Ral35天表型(表S1).

为了直接研究人类Ral GTPase和胞外蛋白对调节自噬体生物发生的个体贡献，我们接下来测试了siRNA-介导的RalA、RalB和胞外亚基缺失对营养素靶向诱导的自噬的影响。在稳定表达GFP-LC3的细胞系中，RalA的耗竭对GFP-LC2信号的积累或点状结构的形成没有影响。相反，RalB耗竭显著损害了饥饿诱导的LC3突起形成和LC3周转(图2A). 通过定量GFP-LC3点和总GFP-LC2信号强度监测到RalB耗竭时观察到的自噬体抑制程度，与已知自噬小体形成成分ATG5或Beclin1耗竭时的抑制程度相等(图2B、C). 外囊亚单位Sec8、Sec5和Exo84的等效分析表明，外囊成分对假定的自噬体形成有选择性贡献。核心外囊亚单位Sec8的耗竭与RalB、ATG5或Beclin1的耗竭具有同等后果。相反，在外囊中的两个Ral效应器Sec5和Exo84中，只有Exo84缺失会损害饥饿诱导的LC3点形成，并增加LC3积累(图2B、C). 对8个外囊亚单位中的每一个亚单位的评估表明，除了Sec8和Exo84外，Sec3和Exo70在支持自噬细胞增多方面也是有限的(图2D、和图S1A). Exo84与Sec5的选择性要求表明，RalB对自噬的调节可能独立于先前特征化的RalB/Sec5/TBK1信号通路(Chien等人，2006年). 通过检测饥饿诱导的内源性LC3定位和LC3翻译后修饰的变化，进一步观察到支持RalB选择性支持自噬体形成(图2E、F、G). 这些综合观察结果表明，在多种生物学背景下，RalB和外囊的离散成分是自噬体形成所必需的。内源性Ral GTP酶的激活也可能足以诱导自噬，因为在没有营养限制的情况下，内源性RalGAP的耗竭足以激活RalB并诱导自噬流量(图S1B、C、D、E).

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RalB和包含Exo84的外囊亚复合物对于氨基酸饥饿诱导的自噬是必需的

答：RalB缺失抑制GFP-LC3点的积聚。通过siRNA转染，稳定表达GFP-LC3的Hela细胞中的指示蛋白被耗尽。转染96小时后用GFP荧光成像细胞。比例尺10μm。

B类：Sec5和Exo84选择性参与GFP-LC3突起的积累。对（A）中处理的细胞中的GFP-LC3点进行定量。GFP-LC3点状细胞/细胞的平均分布以条形图显示，数据以平均值+/-SEM表示。通过单因素方差分析和Dunnett多重比较测试计算P值。

抄送：抑制GFP-LC3点刺与LC3蛋白的积累有关。量化如（A）所述处理的细胞中GFP-LC3的平均总强度。平均总GFP强度的分布以条形图显示，数据以平均+/-SEM表示。P值通过单向方差分析和Dunnett多重比较测试计算。

医生：外囊亚单位的一个子集限制了GFP-LC3点的积累。所示的siRNA按照（B）进行评估。

电子邮箱：RalB缺失抑制LC3-脂质结合物的积累。从稳定表达GFP-LC3的HBEC3-KT细胞的全细胞裂解液中检测转染所示siRNAs的GFP-LC2（I）和GFP-LC4（II）的相对积累。β-actin显示为一种负荷控制。转染后96小时显示siRNA-介导的靶点缺失（右图）。

传真：RalB参与内源性LC3点的积累。通过siRNA转染去除Hela细胞中的指示蛋白。转染后96小时，细胞在无氨基酸的EBSS中孵育4小时。内源性LC3通过抗LC3免疫荧光成像。比例尺10μm。

德国：对（E）中处理的细胞内内源性LC3点进行定量。LC3点状细胞/细胞的平均分布显示为条形图，数据表示为平均+/-SEM。P值通过单向方差分析计算，然后进行Dunnett多重比较测试。

另请参见图S1.

RalB被招募到新生自噬体形成的部位

为了研究RalB与自噬体形成的物理接近性，我们检测了内源性RalB的亚细胞定位以及自噬小体起始和延伸机制的组成部分。在端粒酶和CDK4永生化正常人气道上皮细胞（HBEC30-KT）中，我们注意到内源性Beclin1和内源性RalB在核周结构中显著共存。在氨基酸饥饿（EBSS持续30分钟）后，我们观察到RalB和Beclin1在整个细胞体的囊泡结构中重新分布(图3A). 大多数RalB阳性结构与GFP-2X-FYVE报告子共同标记，该报告子定位于PI-（3）-P富集位点(Gilloly等人，2000年)，Beclin1-associated class III PI3K VPS34的产品(图3B). 此外，我们发现在饥饿培养基中培养90分钟后，内源性RalB与GFP-ATG5显著共定位(图3C). 到4小时时，GFP-LC3点刺已经累积，其中许多是RalB阳性(图3D).

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Native RalB与自噬机制共存

答：Beclin1和RalB在细胞自噬诱导前后共定位。如图所示，在新鲜生长介质或EBSS中培养90分钟，HBEC30-KT细胞中的Beclin1（抗Beclin 1）和RalB（抗RalB）的内源性免疫荧光。虚线表示单元格轮廓。比例尺10μm。

B-D：RalB与自噬体生物发生的早期和晚期标记物共定位。HBEC30-KT细胞转染（B）GFP-2X-Fyve；（C） GFP-ATG5；和（D）GFP-LC3。将细胞在EBSS中孵育（B）30分钟；（C） 90分钟；或（D）3小时。显示GFP荧光和内源性RalB（抗RalB）免疫荧光。底部面板中显示了方框指示的10μm×10μm区域的高倍率。比例尺10μm。

电子邮箱：ATG5和RalB被招募到早期隔离膜形成的部位。感染HBEC30-KT细胞的ATG5（anti-ATG5）和RalB（anti-RalB）内源性免疫荧光鼠伤寒沙门菌-GFP。细胞暴露于鼠伤寒沙门菌-GFP治疗1小时，然后在感染后3小时针对细胞外沙门氏菌进行抗生素选择。比例尺2μm。

传真：SenV感染可选择性改变RalB与RalA的亚细胞分布。HBEC3-KT细胞中RalA（anti-RalA）和RalB（anti-RalB）的内源性免疫荧光模拟感染或感染仙台病毒5小时。比例尺10μm。

德国：SenV感染诱导内源性RalB/ATG5-12复合物的积累。用抗RalB抗体从模拟感染或仙台病毒感染的HBEC3-KT细胞中免疫沉淀内源性RalB复合物，并分析ATG5/ATG12结合物的共沉淀。

为了研究在LC3修饰过程中RalB向离散膜位点的募集，我们利用GFP表达鼠伤寒沙门菌作为液泡LC3修饰的可检测近端信号。在感染后选择抗生素清除细胞外沙门氏菌三小时后，我们发现内源性ATG5存在于内化的GFP-沙门氏菌表面，与RalB共定位(图3E). 最后，HBEC细胞对仙台病毒暴露的自噬反应诱导了RalB而非RalA在胞浆泡状结构中的重新分布，并促进了内源性RalB-ATG5/ATG12蛋白复合物的积累(图3F、G).

Exo84-Beclin1复合物的营养保护和RalB驱动组件

考虑到Beclin1是一个参与对不同刺激启动自噬反应的中央调节节点，与RalB共定位，我们检查了Beclin 1与胞外亚单位之间的关系。我们发现，营养饥饿诱导HEK293细胞中Exo84/Beclin1复合物的显著组装(图4A). 与此形成鲜明对比的是，在营养丰富的生长条件下存在的丰富的Sec5/Beclin1复合物在营养缺乏的90分钟内被分解(图4B)可以通过添加非必需氨基酸来逆转(图4C). 另一方面，Sec8/Beclin1复合物在富营养和贫营养生长条件下均存在(图4D). Beclin1缺失结构的分析表明，Exo84和Sec5都需要氨基末端BCL2相互作用域才能与Beclin 1相互作用（88-150），而进化保守域（244-337）是不必要的(图S2A). 然而，Exo84和Sec5可能在BCL2相互作用域内有不同的结合决定簇，因为不能结合BCL2的Beclin1（F123A）干扰Sec5而不是Exo84关联(图4E、F). 重要的是，我们发现，在饥饿条件下，缺乏营养细胞与充满营养细胞的内源性Beclin1免疫沉淀导致内源性Exo84选择性共沉淀(图4G). 这些观察结果表明，Beclin1被招募到不同的外囊亚复合物中，以响应营养物质的可用性。我们小组先前的观察表明，可以通过密度梯度离心法在嗜铬细胞瘤细胞中检测到离散大分子Exo84和Sec5复合物(Moskalenko等人，2003年). 因此，我们发现内源性Exo84和Sec5在上皮细胞中显示出非常不同的定位模式(图4H). 同样，Exo84或Sec5的异位表达足以将Beclin1差异性地招募到这些不同的亚细胞隔室(图4 I，J). Exo84室和Sec5室与内源性Beclin1分别在营养缺乏状态和营养缺乏状态下观察到的染色模式相似(图3A). 来自增殖细胞的清除裂解物的尺寸排除色谱表明，内源性Exo84和Sec5的大部分分别在～500 kDa和>700 kDa的不同组分中洗脱，这两种组分均与Beclin1部分共分。有趣的是，ATG1正交曲线ULK1显示出双峰分布，可能代表不同的高、低分子量络合物(图S2B).

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营养剥夺驱动Exo84/Beclin1复合物的组装

答：营养限制诱导Beclin1/Exo84相互作用并抑制Beclinl/Sec5相互作用。用标记的Beclin1和胞外表达构建物转染后48小时，HEK-293细胞在含有1×非必需氨基酸的DMEM、EBSS或EBSS中培养90分钟或4小时，如图所示。然后用针对特定标签的抗体对指示的蛋白质进行免疫沉淀。分析免疫沉淀物与Flag-Beclin1的共沉淀。全细胞裂解物（WCL）、免疫沉淀物（IP）。

E、 传真：Beclin1（F123A）突变体与Exo84相互作用，但不与Sec5相互作用。如图（A-D）所示，与所示蛋白质进行共表达，即Co-IP。

德国：内源性Beclin1/Exo84复合物积累是对营养剥夺的反应。从在EBSS（顶部面板）或DMEM（底部面板）中培养90分钟的HEK-293细胞中免疫沉淀内源性Beclin1，并分析Exo84（IP）的共沉淀。宿主物种匹配的非特异性IgG免疫沉淀物作为阴性对照。显示了输入的全细胞非变性裂解物中检测的蛋白质的表示（WCL）。

高：Exo84和Sec5在不同的亚细胞隔室中富集。MDCK细胞中Sec5（抗Sec5）和Exo84（抗Exo84）的内源性免疫荧光。比例尺10μm。

I、 J：Exo84和Sec5可以将Beclin1募集到不同的亚细胞隔室。用（F）Flag-Beclin1和Myc-Exo84转染HEK-293细胞；（G） 标志-Beclin1和HA-Sec5。对所示融合标签进行免疫荧光。底部面板中显示了方框指示的10μm×10μm区域的高倍率。比例尺10μm。

另请参见图S2.

与细胞对营养剥夺反应中的哨兵作用一致，RalB被营养剥夺激活，如GTP-结合构象的积累所示。另一方面，拉拉没有受到影响(图5A). 因此，组成活性RalB变异体（RalB（23V））的表达足以在没有营养剥夺的情况下诱导Beclin1/Exo84复合物的形成(图5B). 为了研究RalB是否需要直接的RalB-Exo84效应器相互作用来驱动Exo84-Beclin1关联，我们采用了从Exo84与Sec5选择性解偶联的部分功能缺失RalB变体(Cascone等人，2008年;Jin等人，2005年). 与Exo84相比，RalB（G23V，A48W）对Sec5的亲和力高43倍，而与Sec5相比，RalB（G23GV，E38R）对Exo84的亲和力则高104倍(Jin等人，2005年). 如图所示，RalB（G23V，E38R）在促进Exo84/Beclin1复合物形成方面比其Exo84-binding缺陷对应物RalB更有效（G23V，A48W）(图5C). 与Exo84相比，Beclin1/Sec5复合物可以在营养丰富的条件下分离。有趣的是，RLIP（RBD）表达对Ral信号的抑制消除了Beclin1/Sec5复合物的积累，这表明在营养丰富的条件下RalA/B信号是这种相互作用所必需的(图5D). Sec5（T11A）Ral-binding结构域的点突变消除了与Ral-GTP的结合，也消除了Sec5-Beclin1相互作用(图5E). 未观察到Beclin1与RLIP76（一种外源性依赖Ral效应器）的相互作用(图5F); 表明Sec5/Beclin1和Exo84/Beclin1复合物的Ral家族调控是特异性的。RalB相互作用驱动Sec5-Beclin1和Exo84-Beclin1复合物的充分性，再加上我们对这些复合物对营养状态的选择性反应的观察，表明营养物的可用性可能导致不同的RalB效应器耦合。事实上，在营养不良条件下，内源性RalB优先与Exo84相关，在营养丰富条件下与Sec5相关(图5 G、H). 重要的是，内源性ULK1，一种促进自噬启动的关键激酶(Chan等人，2007年;细川等人，2009a;Jung等人，2009年)，在养分耗尽时选择性地富集在RalB免疫沉淀物中(图5G). 这些观察结果表明，RalB/胞外效应器直接相互作用可将Beclin1传递到Sec5或包含Exo84的亚复合物，以响应营养物质的可用性，并且RalB/Exo84复合物可能指定自噬体形成的激活。与此一致，我们发现抑制自噬的Rlip（RBD）对Ral信号的抑制促进了自噬抑制剂蛋白RUBICON与Exo84的关联(图5I).

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RalB通过直接RalB-Exo84效应器结合驱动Exo84/Beclin1复合物的组装

答：氨基酸缺失激活RalB。通过GST-Sec5-RBD介导的亲和纯化从在EBSS中孵育指定时间的HEK-293细胞中收集内源性GTP-结合的RalA和RalB，并用特异性抗RalA抗体和抗RalB抗体进行可视化。RalA和RalB的标准化GTP加载指数计算如下拉尔夫（GTP）/总Ral生成散点图。

B-F：RalB调节Beclin1/外囊-亚复合物相互作用。所示蛋白在HEK-293细胞中表达，并用抗体免疫沉淀到适当的标签上。如图所示，分析免疫沉淀物与Flag-Beclin1、Flag-RalB（23V）和内源性Sec8的共沉淀。全细胞裂解物（WCL）、免疫沉淀（IP）。

德国：营养状况规定了不同的内源性RalB/效应器相互作用。用来自HEK-293细胞的抗RalB抗体在DMEM或EBSS中孵育90分钟，免疫沉淀内源性RalB，并分析Exo84、Sec5、ATG14L、UVRAG和ULK1的共沉淀。

高：转染48小时后，HEK-293细胞在DMEM或EBSS中培养90分钟，如图所示。对Flag-RalB免疫沉淀物进行HA-Sec5的共沉淀检查。通过将免疫沉淀Sec5除以总表达Sec5，然后将计算值归一化为DMEM条件，计算所示的归一化IP/输入比。

我：Ral-inhibition诱导Exo84/Rubicon相互作用的积累。如（B-F）所示，与所示蛋白质进行共表达、共IP。

RalB/Exo84效应器途径动员VPS34活性

为了进一步探讨Exo84与Sec5复合物与自噬体动员的关系，我们研究了营养素耗竭或Ral激活对VPS34向胞外/Beclin1复合物募集的影响。Beclin1被认为是VPS34脂激酶的正调控辅因子，被认为是启动自噬体隔离膜组装和延伸的生化触发因子(Vergne等人，2009年;Zeng等人，2006年). 像Exo84/Beclin1关系一样，我们发现营养物质的消耗导致Exo84/VPS34复合物的积累(图6A). 再次，正如我们在Beclin1中看到的那样，在Sec5中观察到了相反的关系(图6B). 在没有养分消耗的情况下，活性RalB的表达反映了这些观察结果。即，RalB（G23V）驱动Exo84/VPS34复合物的组装(图6C)并以依赖于RalB/效应器直接相互作用的方式推动Sec5/VPS34复合物的分解(图6D).

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RalB表达驱动Exo84/Vps34和Exo84/ATG14L复合物的组装

A-F：VPS34和ATG14L/外囊亚复合物受营养限制和RalB激活调节。如图所示，表达所示蛋白的HEK-293细胞在DMEM或EBSS中培养90分钟。标记的外囊亚单位进行免疫沉淀，并与标记的VPS34和标记的ATG14L进行共沉淀分析。

德国：RalB/Exo84效应器相互作用动员VPS34活性。如图所示，Hela细胞表达GFP-2X-Fyve以及RalB部分功能丧失突变体Flag-RalB（E38R）或Flag-Ral B（A48W）。

高：对按（G）处理的细胞中的GFP-2X-Fyve点刺进行定量。GFP-2X-Fyve点状细胞/细胞的分布显示为盒状和须状图。使用学生的t检验计算P值。

我：RalB（G23V）和RalB。将稳定表达GFP-LC3的Hela细胞转染所示结构，然后通过所示标记的免疫荧光显示。GFP-LC3点状细胞/细胞的分布显示为盒须图。使用学生的t检验计算P值。

ATG14L在与Beclin1和VPS34的复合物中的存在被认为指定了该复合物参与自噬，而不是与VPS34活性相关的其他细胞过程(Itakura等人，2008年;Matsunaga等人，2009年;Sun等人，2008年;Zhong等人，2009年). 我们发现Exo84和Sec5与ATG14L的动态相互作用也与Beclin1观察到的动力学相互作用非常相似。具体而言，在营养丰富的生长条件下，RalB（G23V）表达诱导Exo84与ATG14L的关联(图6E)而先前存在的Sec5/ATG14L复合物在显性抑制肽Rlip（RBD）的存在下受到抑制(图6F). 此外，如GFP-2X-FYVE探针的积累所示，RalB（E38R）而非RalB的表达足以驱动活性VPS34产物PI-（3）-P阳性点的积累(图6G、H). 对于GFP-LC3斑点的积累也观察到了类似的结果(图6I). 这些观察结果表明，自噬的诱导是通过Beclin1-ATG14L-VPS34复合物在Exo84上的组装进行的，而这些成分与Sec5的相互作用可能代表了启动前复合物和/或信号终止复合物中非活性成分的组织。重要的是，在RalB（G23V）表达时观察到的GFP-LC3积累增加被激酶死亡突变体ULK1（K46N）的共同表达所逆转，这表明RalB可能作用于ULK1上游以促进自噬(图6I).

诱导自噬后活性ULK1在Exo84上组装

在Atg蛋白中，ULK1激活是最顶端阳性的诱导信号，但已被确定为启动自噬。我们发现RalB在营养缺乏时被激活，这与RalB/ULK1复合物的诱导有关(图5A和5G分别）。值得注意的是，RalB（G23V）的表达足以促进ULK1/Beclin1复合物的组装，这一点以前没有描述过，但可能代表了ULK1活化和VPS34囊泡成核复合物之间的机械联系(图7A). 此外，营养物质耗竭或RalB（G23V）表达足以诱导ULK1/Exo84复合物的组装(图7B、F). Exo84的耗尽消除了RalB（G23V）诱导ULK1/Beclin1复合物形成的能力，这表明该组装事件需要Exo84(图7C). 与ULK1/Exo84相互作用相比，当Ral信号被Rlip（RBD）表达阻断时，我们观察到Sec5/ULK1复合物组装增加(图7D). Beclin1缺失结构的分析表明，与Exo84和Sec5不同，ULK1需要Beclin 1关联的进化保守域（aa 244-337）(图S3A). 重要的是，在营养不良的条件下，Exo84和Sec5复合物中都存在ULK1(图7E、F)，只有Exo84相关的ULK1表现出显著的催化活性(图7F、G).

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活性ULK1与Exo84相关

答：RalB诱导ULK1/Beclin1复合物形成。如图所示，在RalB（23V）表达后，分析ULK1免疫沉淀物与Flag-Beclin1的共沉淀。

B类：ULK1/Exo84复合物受RalB调节。所示蛋白在HEK-293细胞中表达。对Myc标记的Exo84进行免疫沉淀，并分析其与HA-ULK1的共沉淀。

抄送：RalB诱导的ULK1/Beclin1复合物需要Exo84。首先用siControl或siExo84 siRNA转染HEK-293细胞，24小时后表达所示蛋白。如图所示，在RalB（23V）表达后，分析ULK1免疫沉淀物与Flag-Beclin1的共沉淀。

D类：ULK1/Sec5复合物在Ral抑制后积聚。如（B）所示，与所示蛋白质进行共表达，即Co-IP。

电子邮箱：ULK1/Sec5复合物在营养缺乏时分解。如（B）所示，与所示蛋白质进行共表达，如所示，在DMEM或EBSS中额外培养90分钟。

F类：氨基酸饥饿诱导Exo84与催化活性ULK1的关联。如图所示，对Exo84和Sec5复合物与ULK1的共沉淀和相关蛋白激酶活性进行了分析。

德国：EBSS刺激的Exo84和Sec5沉淀物的归一化活性比通过MBP的除法计算32由（F）共沉淀的HA-ULK1信号并入P。

小时：RalB/外囊依赖性自噬动员的工作模型。

另请参见图S3.

据报道，ULK1和mTORC1通过相互磷酸化相互抑制(细川等人，2009a;Lee等人，2007年). 与催化活性的Exo84/ULK1复合物相一致，RalB（G23V）和Exo84的表达足以抑制基线mTORC1活性，正如p70S6K上磷酸三烯389的积累减少所观察到的那样(图7B). 相反，RalB（G23V）和Sec5的表达导致磷酸化p70S6K的积累增加(图7D). 值得注意的是，Sec5中存在内源性mTORC1，而Exo84免疫沉淀物中不存在(图S3B). ULK1与Exo84的组装和Sec5中Beclin1的分解对mTOR抑制有反应，但仅在长期接触雷帕霉素时，表明这是模拟营养饥饿的间接作用的结果(图S3C、D). 这些综合观察结果表明，RalB/Exo84效应器关系通过直接调节ULK1/Beclin1启动复合物参与自噬。

讨论

我们的发现与Ras-like G蛋白RalB作为调节开关，通过动员ULK1/Beclin1/VPS34自噬起始复合物的组装，促进自噬体的生物发生，以响应诱导信号事件的模型一致(图7H). RalB在自噬反应期间被激活，定位于早期自噬体形成的部位，对于诱导自噬通量是必要的和充分的。作为对RalB激活的响应，直接RalB效应器Exo84被用作催化活性自噬诱导（ULK1/FIP200）和囊泡起始（Beclin1/ATG14L，VPS34）复合物的重要组装平台。

在所有检查的案例中，我们发现Exo84上活性自噬体生物发生机制的动态组装与Sec5中相同机制的拆卸相协调。Exo84和Sec5都是Ral家族G蛋白效应器和exocsyt的亚单位，exocsyt是一种异辛基分泌囊泡运输复合物(Lipschutz和Mostov，2002年). 先前的研究表明，不同的Exo84和Sec5亚复合物直接参与Ral信号传导，以动员外囊完整复合物的形成，支持刺激依赖性胞吐所需的动态囊泡靶向和栓系事件(Moskalenko等人，2002年;Moskalenko等人，2003年). 值得注意的是，这里描述的Sec5/自噬蛋白分解事件和Exo84/自噬蛋白质组装事件都需要与活性RalB蛋白直接相互作用。因此，通过RalB激活诱导自噬触发了以两个独立的胞外亚单位为中心的动态自噬蛋白重组事件。自噬体生物发生机制与不同的胞外亚复合物之间的联系可能为局部自噬触发物提供适当的时空分辨率。与此一致，我们发现Sec5和Exo84积累在离散的细胞隔室中，这些隔室与Beclin1诱导自噬前（Sec5）和后（Exo84）的定位相分离。确定这些位置是否分别代表构建自噬体隔离膜所需的膜蛋白的来源位置和组装位置将是非常有趣的。指定亚细胞定位模式的已知胞外囊亚单位自主机制包括与细胞器特异性蛋白质和膜选择性磷酸肌醇的相互作用(何和郭，2009年).

最近的观察表明，通过Toll样受体检测保守的病原体相关分子模式（PAMPs）将激活自噬和典型固有免疫途径激活(Delgado等人，2008年;Shi和Kehrl，2010年). 在宿主防御监测和应答系统的背景下，我们先前已经证明，RalB可以激活Sec5来激活先天免疫信号激酶TBK1和随后的IRF3转录因子依赖性干扰素应答(Chien等人，2006年). 我们在这里的观察表明，RalB可以分别与Exo84结合，以促进自噬激酶ULK1的激活和自噬体生物发生的诱导。总之，这表明RalB和外胚囊通过TBK1和Beclin1/VPS34的分叉激活，代表了一个调节中枢，有助于同时激活基因表达和支持系统病原体识别和清除的细胞器生物发生反应。这种时间和位置特异性反应所需的协调可能是后生动物外囊功能适应支持信号转导级联的原因。

RalA和RalB G蛋白是与有丝分裂、营养和细胞因子信号系统耦合的信号传播分子(Bodemann and White，2008年;费格，2003年). 这种连接性可能为不同细胞环境的自噬反应提供适当的功能耦合。Ral活化是通过5个Ral特异性鸟苷酸交换因子家族中的一个或多个参与而发生的，这些鸟苷酸互换因子可以通过尚待确定的机制选择性地与RalA或RalB偶联(Bodemann and White，2008年). 值得注意的是，最近研究表明，RalA可能通过PLD1和磷酸依赖性mTORC1/2组装促进mTORC1活化(Maehama等人，2008年;Toschi等人，2009年;Voss等人，1999年). 鉴于mTORC1通过直接抑制磷酸化事件抑制ULK1活性的能力，这种调节关系可能直接对抗自噬体的生物合成(细川等人，2009a;Jung等人，2009年). 这些监管机构是独立的还是相互关联的，尚待确定。然而，RalB GDP/GTP循环及其效应器关系构成了一种调节机制，可以直接控制支持细胞生长与细胞维持的代谢状态之间的动态转换。

材料和方法

质粒和抗体

有关质粒和抗体来源、免疫荧光协议、图像捕获程序和图像定量的详细信息在补充方法中进行了描述。

酵母双杂交

将全长人类SEC3（GenBank gi:7023219）的编码序列克隆到pB27中，作为与LexA的C末端融合，并用作诱饵，以饱和筛选高复杂性随机定时人类胎盘cDNA文库，如前所述(Fromont-Racine等人，1997年).

免疫沉淀和激酶分析

使用非变性细胞提取物（20 mM Tris-HCl pH 7.4，137mM NaCl，1%Triton-X-100，0.5%脱氧胆酸钠，10mM MgCl）的标准程序对标记或天然蛋白质进行免疫分离2，2mM EGTA）。在（25 mM MOPS pH 7.5，1mM EGTA，0.1mM钒酸钠，15mM MgCl2，5 mMβ-磷酸甘油）。有关详细信息，请参阅补充方法。

鼠伤寒沙门菌感染

暴露于表达GFP的环境鼠伤寒沙门菌（取自密歇根大学玛丽·奥里尔丹）按照所述进行(Radtke等人，2007年).

补充材料

01

单击此处查看。（1.0M，pdf格式）

02

单击此处查看。（750万，pdf）

致谢

我们感谢Noboru Mishuzima的GFP-Atg5和GFP-LC3，感谢Zhenyu Yue的Flag-ATG14L和Flag RUBICON，感谢Noriko Okazaki的HA-ULK1和HA-ULK1（K46N）。我们感谢怀特和莱文实验室的成员进行了富有成效的讨论。我们感谢Melanie Cobb对激酶分析的有益讨论和帮助。这项工作得到了国家卫生研究院（CA71443和CA129451至MW，CA84254和CA109618至BL）、ARC4845至JC和韦尔奇基金会（I-1414至MW）的资助。BB获得了国防部奖励编号W81XWH-06-1-0749的支持。RR由T32GM008203支持。YO得到了CPRIT RP101496的支持。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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