生物物理学杂志。2010年11月3日；99(9): 2879–2887.
膜结合蛋白的单分子扩散：脂质接触和双层动力学窗口
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杰斐逊·D·奈特
†科罗拉多大学化学与生物化学系分子生物物理项目
迈克尔·G·勒纳
†=====================================================================================================================================================================================================马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家心脏、肺和血液研究所计算生物学实验室
Joan G.Marcano-Velázquez女士
†科罗拉多大学化学与生物化学系分子生物物理项目
理查德·帕斯特
†=====================================================================================================================================================================================================马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家心脏、肺和血液研究所计算生物学实验室
约瑟夫·J。法尔克
†科罗拉多大学化学与生物化学系分子生物物理项目
†科罗拉多大学化学与生物化学系分子生物物理项目
†=====================================================================================================================================================================================================马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家心脏、肺和血液研究所计算生物学实验室
2010年5月6日收到；2010年8月12日接受。
- 补充材料
文件S1。表和图
GUID:A2D0B93B-1E65-4655-B63B-C5230E846615
电影S1。1PH在PC/PIP3（98:2）膜上的扩散
GUID:11A9EB56-8A1B-4954-993A-C30AE96FB9FA
电影S2。2PH在PC/PIP3（98:2）膜上的扩散
GUID:805434F2-5BA3-4953-8919-C375F09A8B51
电影S3。3PH在PC/PIP3（98:2）膜上的扩散
GUID:669F6B89-4A7B-441F-8BA6-3D2F2DC05BD4
摘要
膜靶向蛋白在细胞信号传递过程中被招募到特定的膜，包括趋化细胞前沿的信号。识别和结合特定脂质在靶向反应中起着重要作用，但仍难以分析此类蛋白-脂质相互作用的分子特征。我们认为，外周膜结合蛋白的表面扩散常数包含了有关蛋白样接触和膜动力学的有用信息。为了验证这一假设，我们使用单分子荧光显微镜来探索脂质结合化学计量对含有一到三个由柔性连接体偶联的pleckstrin同源结构域的工程蛋白扩散常数的影响。在误差范围内，这些工程结构的横向扩散常数与紧密结合的磷脂酰肌醇-（3,4,5）-三磷酸脂类的数量成反比。在通过模型系链连接的脂质多聚体的粗颗粒分子动力学模拟和流体动力学珠计算中也观察到了相同的趋势。总的来说，单分子扩散测量可以提供有关蛋白-脂质相互作用的分子信息。此外，实验和计算结果独立地表明，多个耦合但分离良好的脂类的摩擦贡献是相加的，类似于各向同性流体的自由排水极限，这对双层脂类动力学的理论描述具有重要意义。
介绍
膜靶向蛋白结构域是许多细胞信号通路的关键组成部分。这些结构域通常在第二信使（如Ca）积累时介导蛋白质选择性募集到特定的膜表面2+或信号脂质(1–6). 因为这些结构域可以有多种靶脂质和募集模式，所以许多全长蛋白质包含多个膜靶向结构域，例如多倍体同源性（PH）或C2结构域，这可能并不奇怪(2,7–11). 这些多个膜靶向结构域与一个以上的靶向脂质结合对于正确的靶向和调节至关重要，如需要三种脂质（磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸和二酰甘油）的传统蛋白激酶C亚型所示用于特异性质膜靶向和全激酶激活(12–15). 多个脂质靶点的识别被认为是快速、特异性膜靶向以及协同增强靶膜亲和力的关键(2、14、16–19).
了解膜靶向蛋白的招募以及一般外周膜蛋白的蛋白-脂质相互作用的核心是测量给定条件下高亲和力蛋白-脂质接触次数的能力。如果可以测量不同脂质组成的双层的化学计量比，则可以直接确定与特定外周蛋白结合的目标脂质的数量和类型。目前测定脂质结合化学计量比的方法通常包括测量：
1
与膜相关脂质的结构域结合，难以延伸到多结构域蛋白质；
2
与可溶性脂质或脂质头基结合的结构域或全蛋白，双层约束的丧失可能改变结合几何结构和化学计量；或
三。
不同膜结合或可溶性脂质存在时的蛋白质活性，这些脂质仅提供有关脂质化学计量的间接信息。
最近，我们使用单分子全内反射荧光显微镜（TIRFM）来检测蛋白质在双层膜上横向扩散的脂质依赖性(20). 我们的发现使我们假设，侧向扩散对蛋白-脂质接触高度敏感，扩散常数的定量可能是分析脂质结合化学计量学的一个强有力的新工具。
为了验证这一假设，我们系统地分析了具有代表性的外周膜蛋白的侧向扩散常数对紧密结合脂质数量的依赖性。模型系统是磷脂酰肌醇类一般受体亚型1（GRP1，也称为细胞粘附素3）的PH域。当与靶膜结合时，GRP1 PH结构域与其靶脂质磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP）紧密结合三)但与背景脂质磷脂酰胆碱（PC）的相互作用最小(20).
在本研究中，测量了GRP1 PH结构域单体、二聚体和与PIP结合的三聚体的横向扩散常数三嵌入到支持的PC/PIP中三双层。扩散由TIRFM监测，具有单粒子跟踪功能，允许解析多个PH域种群。针对主要流动人口，研究结果揭示了摩擦系数对紧密结合的脂质分子数量的简单加性依赖性，表明扩散系数是该体系中脂质结合化学计量的有用报告。此外，二聚体和三聚体PH结构域的测量扩散常数之比与粗颗粒（CG）二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）双层的分子动力学模拟结果密切一致，其中两个或三个脂质分别栓在每个小叶上，以及各向同性介质中栓系小球的流体动力学估计。总之，实验和计算结果对双层膜中脂质扩散的理论描述具有重要意义。
材料和方法
试剂
合成磷脂1,2-二油酰基-锡-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC，PC）；1,2-二油酰-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺-N个-（赖氨酸罗丹明B磺酰基）（LRB-DOPE，LRB-PE）；和1,2-二油酰基-锡-甘油-3-磷酸肌醇-3,4,5-三磷酸（DOPI（3,4,5）P3，PI（3,1,4,5P3）来自Avanti Polar Lipids（Alabaster，AL）。Alexa Fluor 555（AF555）C2-亚麻酰胺来自Invitrogen（加利福尼亚州卡尔斯巴德）。2-巯基乙醇来自Fluka（Buchs，德国）。CoA三锂盐来自西格玛（密苏里州圣路易斯）。
多聚GRP1 PH结构域表达载体的构建
GRP1 PH结构域的多聚体和酶标记序列被克隆到Falke实验室先前生成的用于谷胱甘肽S-转移酶融合表达的载体中(16). 对于1PH，合成了寡核苷酸（Integrated DNA Technologies，Coralville，IA），编码Sfp磷酸泛硫烯转移酶的11-氨基酸识别序列() (21). 将该序列插入原始表达质粒中GRP1 PH序列的上游(16). 类似地，2PH质粒包含Sfp识别序列和PH域编码序列，即5-氨基酸连接子()和第二个PH域编码序列。
本研究中使用的工程化多PH结构域构建体。示意图中，椭圆代表单个人类GRP1 PH结构域（残基255–392），其他符号代表工程化N末端和连接肽（序列如图所示）。每个结构体在N末端、11残基标记序列下划线的丝氨酸残基处用Alexa Fluor 555-CoA进行酶标记(21,23). 2PHΔPIP3蛋白在第一个PH域中含有K273A/R284A双突变(灰色)已知可使PIP失活三结合位点(45).
对于3PH，编码第三个PH结构域的DNA被插入到2PH质粒的第一个编码序列之前。为了尽量减少由于相同的PH域编码序列而导致的重组，将来自小鼠GRP1 PH域的DNA用于第三个域，该域来自于B.Tycko（Saxena et al(22)). 小鼠和人类的DNA序列编码相同的氨基酸序列。
对于2PH-XL，将编码GSSGSGS的DNA插入2PH质粒的连接区。对于2PHΔPIP3，使用定点突变（德克萨斯州斯特拉赫内，锡达河）生成了包含K273A/R284A双突变的GRP1 PH域编码序列。通过内切酶消化从2PH质粒中删除第一个PH域序列，并将突变的PH域连接到该位置。DNA测序证实了所有构建物的正确全序列。所有PH域均由人类GRP1蛋白的255–392个氨基酸组成(16,20).
蛋白质表达、纯化和标记
蛋白质表达于大肠杆菌作为N-末端谷胱甘肽S-转移酶融合物，并如前所述使用谷胱甘蛋白亲和珠纯化凝血酶(16). 根据公布的方案，使用Sfp用Alexa Fluor 555（AF555）标记蛋白质(23). 简单地说，～2μM蛋白与2.5孵育μM AF555-CoA共轭物和0.5μM Sfp在室温下放置2 h。使用Vivaspin浓缩器（德国哥廷根Sartorius Stedim）通过缓冲液交换去除多余荧光团，直到流道没有明显着色。根据AF555的吸光度测定标记蛋白的浓度。
单分子实验样品制备
如前所述，在玻璃盖玻片上制备支撑脂质双层(20). 简言之，将玻璃盖玻片（加利福尼亚州雷丁市佩拉）在食人鱼溶液中浸泡1小时，用Milli-Q水（马萨诸塞州比勒里卡市Millipore）充分冲洗，在N2，并在PSD-UV臭氧清洁剂中照射0.8小时（Novascan，Ames，IA）。使用超声处理PC/PIP通过囊泡融合方法形成双层三如前所述制备的囊泡(16,20). 用Milli-Q水（Millipore）充分冲洗双层膜，然后将其交换至分析缓冲液（140 mM KCl，0.5 mM MgCl2，15 mM NaCl，20 mM 2-巯基乙醇，25 mM HEPES，pH 7.5）。
TIRFM测量
TIRFM测量基本上如前所述(20). 在添加荧光蛋白前后对支撑的脂质双层（如上）进行成像，以确保背景荧光污染可以忽略不计。添加蛋白质后，让样品平衡5分钟以接近室温，在这些实验中，室温为20±1°C。为了最大限度地减少扩散测量过程中固定荧光颗粒的贡献，施加高功率漂白脉冲（比成像高约30倍）2-5秒，然后在数据采集前允许荧光恢复60秒。应该注意的是，在这一恢复步骤中，任何与双层结合的固定颗粒，或被固定的移动颗粒，都可以在电影S1,电影S2、和电影S3在中支持性材料，但由于数据分析中使用的排除，不会对测量的扩散常数产生影响。使用MetaMorph软件（AG Heinze，Lake Forest，CA）采集每个样本20帧/秒和50帧/秒帧速率的电影，然后使用ImageJ进行后续分析(24)，并使用Mathematica（Wolfram Research，Champaign，IL）进行数据处理和拟合。
为了测定流动分数，省略了漂白脉冲。在之前未曝光的区域录制电影（200帧，20帧/秒）。移动分数是指1s内观察到的移动斑点数除以记录第一帧中可见的斑点总数。该分析是在2次以上实验的多部电影上进行的。
单粒子跟踪和分析
与我们之前的研究一样(20)，使用ImageJ的粒子跟踪器插件确定单分子的扩散轨迹(24)，然后导入Mathematica进行进一步分析。所选的跟踪参数导致了对噪声的一些虚假检测，这些噪声可能会连接成短轨迹。这些虚假检测，以及快速离解的颗粒和异常明亮或暗淡的污染物，都是使用Mathematica中的一系列排除标准从分析中排除的，我们之前已经描述和验证过这些标准(20). 由此产生的排除轨迹短于五帧，或平均强度超出经验确定的范围。
单分子扩散分析
为了将大量扩散轨迹分解为观察到的静止、缓慢和移动人群，将所有50毫秒帧速率电影的数据汇集在一起并进行分析。Δ处所有轨迹的位移t吨计算=8帧（0.4 s），并将其转换为概率分布直方图，其中包含100个等间距的箱子。这些数据适合于单个瑞利分布(等式1)，两个瑞利分布之和(等式2)，或三个瑞利分布之和(公式3),
哪里N个S公司(第页)表示步数随距离的分布第页，的σ我与扩散常数有关D类我通过σ我2= 2D类我Δt吨、和P（P）我是不同成分的相对数量。在所有情况下，使用Fisher F检验，三组分拟合在统计学上都是优越的，因此被用于详细信息请参见图S2.
表1
| 分子 | D类1(μ米2/s） | P（P）1 | D类2(μ米2/s） | P（P）2 | D类三(μ米2/s） | P（P）三 | n个（样本） | n个（电影） | n个（轨迹） |
|---|
| 脂质（LRB-DOPE） | 0.003 ± 0.001 | 1±1% | 0.03 ± 0.01 | 4 ± 1% | 2.8 ± 0.1 | 94 ± 1% | 8 | 14 | 3489 |
| 1相 | 0.0020 ± 0.0004 | 4 ± 1% | 0.04 ± 0.01 | 5 ± 1% | 2.7 ± 0.1 | 92 ± 3% | 4 | 8 | 1038 |
| 2相 | 0.0023 ± 0.0001 | 10 ± 1% | 0.05 ± 0.01 | 7 ± 1% | 1.4 ± 0.1 | 83 ± 2% | 4 | 8 | 1204 |
| 第三方 | 0.0013 ± 0.0001 | 61 ± 1% | 0.05 ± 0.01 | 10±1% | 0.9 ± 0.1 | 29 ± 2% | 8 | 11 | 782 |
| 2PH-XL型 | 0.0016 ± 0.0001 | 13 ± 1% | 0.08 ± 0.02 | 5 ± 1% | 1.4 ± 0.1 | 83±2% | 三 | 6 | 1359 |
| 2PHΔPIP3 | 0.0020 ± 0.0003 | 4 ± 1% | 0.08 ± 0.02 | 5±1% | 2.6 ± 0.1 | 91 ± 2% | 4 | 8 | 1405 |
为了进行比较，我们前面描述的单成分分析(20)，基于Schütz等人的方法。(25)此外，还对流动人口的扩散系数进行了测定。对于每部电影，累积概率分布1-P（P）(第页2, Δt吨)平方位移第页2在给定的时间间隔Δ内或更大t吨计算Δt吨值从一帧到八帧。据观察，一些通过排除标准的轨迹表示分子在移动和不移动或极慢移动状态之间来回切换。为了重点分析流动人口，总扩散常数<0.1的轨迹μ米2/s（即在轨迹持续时间内不动）被排除在外。从剩下的轨迹来看，只有第页2> 0.4μ米2对于Δ的每个值t吨符合以下给出的单组分扩散模型等式4(25),
其中〈第页2〉是均方位移。这个量与Δ成线性关系t吨如所述等式5,
哪里D类是二维扩散常数。发现〈第页2基于Δ的值t吨=1帧或2帧始终低估了扩散常数，这可能是由于每帧中分子位置在曝光时间内的平均值。因此，D类每部电影的数值都是从线性拟合到〈第页2〉与Δt吨对于Δt吨值从三帧到八帧，如所示图S3并在中进行了总结表S2.
扩散的计算模拟
使用GROMACS 4.0.5进行分子动力学（MD）模拟(26)MARTINI粗粒度（CG）力场(27). 采用一个简化模型：在10、40或60℃下，将DPPC双层的每个小叶中的两个脂质栓系，以模拟实验性同型二聚体；将三种脂类连接在一个线性阵列中，相邻的脂类之间相隔60º，以模拟同源三聚体。采用这些简化是因为PIP三在MARTINI部队领域尚不可用。因此，只有多聚体与单体扩散常数的比值才适合与实验进行比较。由于CG模型的简化，绝对值远大于实验值(27)以及脂质的差异。全原子模型有望产生更接近实验的扩散常数(28); 然而，这样的模拟目前是不可行的。
模拟了两种系统尺寸：1）512种脂质和6000种水；2）2048种脂质和50784种水。每种方法均平衡100 ns，然后使用周期性边界条件和20 fs时间步长，在50°C下模拟额外500 ns的恒压（NPT）生产。快照每50 ps保存一次。
二聚体和三聚体系统是通过从生产过程中随机选择快照，并在每个传单上以所需距离栓系一个多聚体来制备的。通过力常数为1250 kJ mol的谐波约束将脂质栓系在上述距离处−1纳米−2在所有对磷酸盐颗粒之间；这与马丁脂质的两个结合颗粒之间使用的力常数相同。首先，对512个脂质10？和40？二聚体系统的100个重复进行50 ns的平衡，然后进行460 ns的NPT生产。在验证了统计收敛性之后，对每个剩余系统的50个重复进行了50 ns的平衡模拟，随后进行了460 ns的NPT生产模拟，得出了类似的统计收敛性。总计138μ对生产数据进行了分析。
通过构造，分子动力学模拟仅包含一组可移动的系留粒子。计算单个分子在其整个轨迹上的均方位移，并在等量位移上取平均值，对所有分子和复制品的曲线取平均值。然后使用等式5在1–200ns范围内（这忽略了亚纳秒时间尺度上的快速运动）。通过比较上下叶分子的扩散常数计算标准误差。
珠子模型流体力学
尽管二维扩散和三维扩散之间存在差异(29，30)，包含由Oseen张量在各向同性介质中相互作用的珠子扩散的结果，并假设单个珠子的扩散受Stokes-Einstein关系支配，这是很有用的。为了模拟实验，只有扩散张量上的两个分量，D类xx个和D类zz（嗡嗡声）平均值；即，忽略了沿双层法线的扩散。二聚体的扩散张量可以用解析方法计算(31). 对于半径相同的珠子一以距离分隔第页在Stokes定律给出的摩擦条件下，二聚体和单体的扩散常数之比为
（前面的比率是1/2+一/(2第页)何时D类年已添加。）三聚体和较大多聚体的扩散张量最简单地通过数值矩阵反演得到；Pastor和Karplus中有详细描述(32). 对于此处的计算，一=4.5º，对应于64º2/脂质。
结果
策略：构建标记的多PH域蛋白
本研究的目的是探讨多个独立的脂质结合位点对膜结合蛋白侧向扩散的影响。使用TIRFM单分子追踪法很容易测量膜结合蛋白的横向扩散常数。这种技术可以在微米尺度上进行可靠的扩散测量，并可以区分在秒级或较慢时间尺度上相互转换的多个状态(33–35).
GRP1 PH结构域的共价低聚物被选为多个独立的脂质结合位点的模型系统。我们之前发现，当呈现PC/PIP时三（98:2）双层，该PH结构域与PIP的头部组具有高亲和力和特异性三，但显示出最小的双层渗透，并且仅与背景PC脂质弱相互作用(16,20). 在这些条件下，PH结构域发生穿透溶解微解离事件的概率（定义为与一个目标PIP的解离三并快速重新绑定到附近的另一个PIP三)在给定的50毫秒帧内≤0.25%，可以忽略不计(20). 引人注目的是，膜结合的PH结构域的横向扩散常数与同一双层中的脂质分子的横向扩散常数在误差范围内相同(20). 由此可见，蛋白质-脂质复合物的扩散主要取决于双层包埋的脂质所经历的摩擦，而不是暴露于水的蛋白质，这并不奇怪，因为双层的有效粘度比水的有效粘度高两个数量级(20).
构建质粒以表达一个、两个或三个由五氨基酸（GSGRS或GSGNS）或12-氨基酸连接物（GSGRSGSSGS）连接在一起的GRP1 PH结构域。PH结构域N端和C端的天然灵活性增加了连接子的长度和灵活性，每个连接子都包含11个残基，这些残基不涉及结构域已知晶体结构定义的二级结构元素(36). 这些设计如图所示.
对于单分子测量，用Alexa Fluor 555标记蛋白质。我们之前对单个GRP1 PH结构域的研究使用了通过马来酰亚胺偶联到单个工程半胱氨酸残基的标记蛋白质。这种方法需要将三个固有的Cys残基突变为Ala或Ser，从而产生比野生型结构域更难纯化的蛋白质。本研究在所有结构中使用野生型结构域，并添加了11个残基标签序列(21,23)N末端到第一个PH域，允许用AF555进行酶标记。如SDS-PAGE凝胶的荧光成像所示，标记的单、双和三个PH域纯度>90%，与预期质量相对应(图S1).
使用单分子TIRFM采集法测量这些PH结构域和控制荧光脂质的侧膜扩散常数，如材料和方法简单地说，脂质双层由98%DOPC和2%DOPI（3,4,5）P组成三在超清洁玻璃盖玻片上制备。蛋白质被添加到双分子层上方的溶液中，以便于PIP的使用三在裸露的双层传单上。对于脂质扩散测量，制备了含有98%DOPC、2%DOPI（3,4,5）P的双层膜三和150 ppb的赖氨酸罗丹明B-DOPE（LRB-DOPE）。使用TIRFM成像双层相关荧光分子。在每种情况下，都检测到固定化荧光粒子的一个亚群，并对其部分种群进行估计，总结如下表S1荧光脂质或单个PH域中观察到的低水平固定化颗粒是支撑双层研究的典型特征，并被认为是由先前讨论的高度局部化双层或玻璃缺陷引起的(20). 这些固定化颗粒对扩散分析的贡献通过预先移动漂白和恢复步骤最小化，该步骤破坏了固定荧光，并允许移动荧光重新填充窗口。经过漂白和恢复后，大部分观察到的荧光粒子是可移动的()，这些被观察到随机扩散(,电影S1,电影S2、和电影S3). 通过跟踪软件定义单个粒子的轨迹，如果轨迹符合一组旨在排除移动荧光污染物的选择标准，则将其纳入分析。
单、双和三个PH域的单粒子轨道。显示了每个流动物种的代表性横向扩散轨迹，其中每个轨迹是单个蛋白质在PC/PIP上扩散的42帧三（98:2）以20帧/秒的速度采集双层。使用ImageJ的粒子跟踪器插件跟踪分子(24). 为了清晰起见，轨迹坐标已经偏移。注意，净横向位移随着PIP的数量减少三-束缚域增加。
将所得的浸出后轨迹合并并分析为1），从不同的缓慢和不动成分中分辨出可移动成分；和2），确定各成分的扩散系数。总结如下详细信息请参见图S2混合数据最适合于三组分模型，得出了流动人口的分数总体和平均扩散系数（P三,D类三)，缓慢（P2,D类2)和不动（P1,D类1)组件。更快的P三人口总是支配慢P2组分并显示出扩散常数D类三至少17倍和7000倍大于D类2和D类1分别为(). 对于荧光脂类和单体PH结构域，流动组分超过90%的人群(). 对于工程化的二聚体和三聚体PH结构域构建物，分数流动成分分别下降到83±2%和29±2%，而不流动成分分别增长到10±1%和61±1%。因此，不稳定性随畴数的增加呈非线性增加，可能是由于错误折叠或微团聚粒子与非天然膜相互作用所致。耦合在一起完全相同β-三明治结构域可能刺激结构域间β-串交换(37)并且可能产生连接剂缠结；这种过程可以解释多域结构的不稳定性增加的原因。缓慢组分总是很小的，产生了4–10%的贡献，可能是由于超出排除标准的缓慢移动的污染物，以及对给定Δ的部分（但不是全部）具有流动性的瞬时不动蛋白引起的t吨窗口(图S2).
除非另有说明，否则所有后续分析都将重点放在每个数据集的移动部分上，观察到这些数据集是随机自由扩散的(,电影S1,电影S2、和电影S3). 通过三组分拟合确定的这些流动颗粒的扩散系数是稳健的，因为有一种替代方法只定量流动组分(和图S3)在误差范围内产生了相同的扩散系数（比较和表S2).
PH域结构和模拟栓系脂质的均方位移与时间曲线。均方位移与Δ的关系图t吨显示的是(A类)1PH、2PH和3PH的流动人群；(B类)2PH、2PHXL和2PHΔPIP3的流动种群；和(C)单体DPPC和二聚体和三聚体栓系DPPC来自2048脂质系统的粗颗粒（CG）模拟。对于单分子蛋白质扩散(A类和B类)，所示的代表性图是每个物种的单个代表性电影中4400-8500步的数据集。线性拟合(实线)平均得出的扩散常数表S2误差线按说明计算(46)当不可见时，和小于符号。无论是实验系统还是模拟系统，线性特征都表明流动粒子的扩散缺乏大规模障碍，这表明存在均匀的双层。
脂质和GRP1PH单体的扩散
与我们之前的报告一致，单个GRP1 PH结构域的扩散速度与PC/PIP上的脂质分子扩散速度一样快三（98:2）双层(20). 脂质的扩散常数和流动1PH的扩散常数相差2.8±0.1和2.7±0.1μ米2/s、 分别(D类三在里面)与我们之前对相同脂质和马来酰亚胺标记的单半胱氨酸PH结构域（3.0±0.2和3.0±0.3）的测量值相比，也在误差范围内μ米2/s、 温度稍高（～21.5°C）(20).
串联同型二聚体的扩散
GRP1 PH结构域的串联同二聚体（2PH）同时与两个PIP结合三支撑双层上的分子。这种结构的可移动分子在双层中表现出自由扩散(,电影S2)扩散系数约为单个区域的一半，1.4±0.1μ米2/秒().
验证串联二聚体中的两个结构域结合两个PIP三分子独立，我们设计了第二个版本的2PH，在两个域（2PH-XL，). 该蛋白质也以1.4±0.1的相同扩散常数自由扩散μ米2/s、 证明在这两种结构中，链接器都足够长，可以防止对绑定或扩散的干扰().
作为进一步的对照，通过诱变其PIP使两个PH结构域中的一个失活，生成了串联二聚体的一个版本三结合位点（2PHΔPIP3，). 该突变二聚体稳定且可溶，但表现出明显低于标准二聚体的膜亲和力，类似于根据生成给定密度的膜结合荧光粒子所需的蛋白质浓度判断的单体结构域的较低亲和力。此外，突变二聚体的扩散常数为2.6±0.1μ米2/s、 显著大于标准二聚体，且在单域测量值的误差范围内()，证实扩散与暴露于水溶剂的总表面积无关。这些对照表明，二聚体结构的扩散常数仅取决于紧密结合的PIP的数量三分子。
三PH同源三聚体的扩散
与PIP结合的三重PH域同源三聚体（3PH）三横向扩散常数为0.9±0.1的扩散μ米2/秒()约为单个脂质或单个PH结构域的三分之一。在纯化和标记过程中，这种3PH结构的稳定性和溶解性与2PH相似(图S1)但当与膜结合时，表现出相对较高的不动态种群(,表S1、和电影S3). 多组分单分子分析的一个优点是能够排除不动粒子，并且只关注自由流动人口的扩散系数，这对于分析这种结构至关重要。
连接磷脂的理论分析和模拟扩散
所有2048-脂质系统MD模拟的均方位移与时间的关系如图所示 C虽然MD扩散系数的绝对值明显快于相应的实验值，但趋势与实验结果非常相似。这种更快的扩散是预期的，因为模拟的是50°C下的CG饱和脂质（实验研究使用了20±1°C的不饱和脂质）。列出了模拟得到的扩散常数，并将多聚体/单体比率与珠模型和实验得出的比率进行了比较。理论比率和实验比率之间的一致性极好。测得的比率介于40℃和60℃时计算的比率之间，但接近60℃；因此，模拟预测有效实验链路长度可能接近60º。三聚体在MD模拟中被限制为线性。放宽这一限制将导致结构更加紧凑，从而实现更大的流体动力筛选和更快的扩散。如珠子模型所示()，这种影响相对较小。当系链长度减少到10º时，流体动力筛选的效果很明显。在这种情况下，模拟得出的二聚体/单体比率为0.7±0.2，而模拟得出的比率为0.75±0.2等式6.
表2
DPPC双层中栓系脂质的MD模拟中的扩散常数总结，以及MD、珠模型和实验中多聚体和单体扩散常数的比值
| 系统 | D类(μ米2/s） | MD比率 | 胎圈型号比∗ | 测量的比率∗,† |
|---|
| 512脂类，DPPC | 81.7±0.5 | | | |
| 10？二聚体 | 60 ± 10 | 0.7 ± 0.2 | 0.75 | |
| 40？二聚体 | 48 ± 3 | 0.58 ± 0.03 | 0.56 | |
| 60º二聚体 | 39±6 | 0.48 ± 0.07 | 0.54 | |
| 2048脂类，DPPC | 93 ± 4 | | | |
| 60º二聚体 | 46±9 | 0.5 ± 0.1 | 0.54 | 0.52 ± 0.06 |
| 60°三聚体 | 30 ± 9 | 0.32 ± 0.08 | 0.38–0.41†===================================================================================================================================================================================================== | 0.33 ± 0.05 |
作为一个技术点，对于512脂质和2048脂质系统，MD扩散常数的绝对值及其比率都不同。Yeh和Hummer(38)结果表明，由具有周期性边界条件的立方盒的MD计算的平移扩散常数表现出系统尺寸依赖性。尽管对于非立方盒中的双层，分析公式仍在开发中（M.G.Lerner和R.W.Pastor，未出版），但此处显示的结果也有类似的影响。
讨论
横向扩散常数反映了膜结合蛋白的基本特征。这项研究得出了三个广泛的结论：
1
单分子TIRFM是测量膜靶向蛋白质横向扩散的一种优越方法，尤其是那些可能表现出复杂扩散行为的蛋白质；
2
多PH结构域低聚物在PC/PIP上的扩散三膜与紧密结合的PIP的数量大致成反比三分子，表明该方法在分析简单外周蛋白的脂质化学计量比方面具有广泛的用途；和
三。
实验、理论和计算分析表明，在各向同性流体中的三维扩散中定义良好的流体动力自由排水极限，也是脂质在双层中二维扩散的一个重要极限。
流体中的各向同性分子扩散通常用Stokes-Einstein关系来描述，
在哪儿D类是扩散常数，k个B类是玻尔兹曼常数，T型是温度，以及（f）是摩擦阻力系数。聚合物通常被建模为具有摩擦常数的串珠（单体）（f）我当单体之间的分离变大时，总摩擦只是单体摩擦和聚合物的扩散常数之和N个单体由所谓的自由排水极限给出(31,32,39),
对于三维聚合物在各向同性介质中的扩散，建立了自由排水极限(32)，但尚未提出描述脂质双层中的二维扩散。如果自由排水限制确实适用于紧密结合的蛋白质N个充分分离的结合部位的脂质，如果蛋白质与其他脂质接触很少，等式8预测蛋白质扩散常数D类P（否）将
哪里D类L（左）表示双层中单个脂质的横向扩散常数。该方程表明，总扩散率与紧密结合的脂质数量成反比，如果只有一种脂质结合，则蛋白质的扩散系数与单个脂质的扩散系数相同。
在这里，我们发现与外周膜蛋白紧密结合的多个脂质分子的摩擦系数确实是误差范围内的相加，如等式8PIP的横向扩散常数三-结合GRP1 PH结构域多聚体从2.7±0.1下降μ米2/s（单个域）至1.4±0.1μ米2/对于二聚体，s为0.9±0.1μ米2/三聚体的s(). 如所示扩散常数对PIP数量的依赖性三-结合PH域很好地表示为等式9，假设单个PIP的扩散系数三分子为2.7μ米2/s、 测量的脂扩散常数2.8±0.1误差范围内的值μ米2/秒(). 因此，数据支持这样的假设，即PIP的摩擦系数三与不同PH域结合的分子是加性的，表明流体动力自由排水极限与双层中分离良好的脂质有关。由于D类P（否）和N个，对于大量紧密结合的脂质，扩散常数的变化将变得更加难以量化(等式9). 虽然这些结果表明，2PH和3PH扩散常数的分辨率是可能的()，分辨率为N个=3来自N个≥4可能变得不切实际。更普遍地说，弱结合的脂质也可能减缓扩散并使化学计量分析复杂化，如在PC/PS/PIP上观察到的GRP1PH结构域与磷脂酰丝氨酸（PS）的弱结合三（73.5:24.5:2）双层(20). 然而，单分子扩散方法的一个优点是能够从支撑的双层中消除弱结合的脂质，从而只关注紧密结合的脂质。
脂质化学计量依赖于扩散常数。1PH、2PH和3PH的测量扩散常数(实心圆)位于预测曲线的误差范围内等式9(实线)最适合的单脂扩散系数为D类L（左）= 2.7 ± 0.2μ米2/第条。
对于表现出附加摩擦系数的多结合脂类，系留脂类必须很好地分离，否则它们可能会通过流体动力学相互屏蔽（如当分离度降至10º时）。计算和理论方法表明，邻近脂质分子的扩散是耦合的：当一种脂质向特定方向移动时，其相邻脂质也会表现出向该方向移动的偏好(40,41)尽管这种耦合的距离尺度存在争议。全原子MD模拟表明，次近邻的平移跳跃（即高达1.6 nm的分离）是相关的(28); 没有观察到较长的长度尺度相关性，但由于模拟的系统尺寸相对较小（288个脂质），因此不能完全排除这种相关性。在这里，我们通过对连接脂质的首次系统实验和计算研究表明，相距约4-6 nm的两种脂质的流动性在我们实验测量的毫秒时间尺度上处于自由排水极限。以前的研究提供了额外的证据来支持这一观点。1988年，塔姆(42)在荧光回收-光漂白后实验中观察到，与支撑双层上相距至少3nm（一个FAB结构域的直径）的两种脂质结合的二价抗体的横向扩散常数为脂质分子的一半。他提出，如果两种结合脂质具有附加摩擦系数，并且如我们和其他人所观察到的那样，水溶液中的摩擦可忽略不计，那么抗体的扩散常数将是单个脂质的一半(43). 同样，Gambin等人。(44)发现两个相距2nm的跨膜螺旋的扩散常数是单个跨膜螺旋扩散常数的一半。虽然这一结果被解释为支持1/R（右）由于跨膜蛋白扩散的依赖性，这也与在没有相互流体动力学筛选的情况下扩散的栓系粒子的附加摩擦系数一致。
总之，现有数据表明，广泛使用的Saffman-Delbrück双层扩散描述需要修订。尽管Saffman-Delbrück理论可以扩展到束缚二聚体和三聚体，但原始研究的参数预测，自由排水极限将不适用于本文研究的系统（M.G.Lerner和R.W.Pastor，未发表），这与我们的实验和计算结果相矛盾。
总之，本文的研究结果表明，双层中耦合的、分离良好的脂类的摩擦系数是相加的，并且此类脂类处于流体动力自由排水极限。绑定到多个PIP的Multi-GRP1 PH域构造三PC/PIP上的分子三膜表现出这种可加性，表明其结合的PIP三配体被充分分离以有效地消除流体动力相互作用。更普遍地说，单分子横向扩散测量可以揭示包含多个脂质结合域的全长蛋白质的脂质结合化学计量学。由于该方法测量扩散常数的比值，因此它与双层和玻璃支架之间的任何摩擦无关，并且在独立双层或囊泡中也应同样有效。这种潜在的应用说明了单分子荧光显微镜在确定蛋白质-膜相互作用的分子机制方面的另一种强大功能，一次一个分子。
致谢
作者感谢Christopher Walsh教授（哈佛医学院）为Sfp表达提供质粒DNA，以及Ben Tycko教授提供小鼠GRP1PH构建体。
美国国立卫生研究院（NIH）向J.J.F.提供了编号为R01 GM-063235的拨款，美国国立卫生院、国家心脏、肺和血液研究所（NHLBI）向R.W.P.和M.G.L.提供了研究支持。本研究使用了科罗拉多大学博尔德分校的共享单分子TIRFM设施（由W.M。Keck Foundation，致Art Pardi教授，P.I.），以及马里兰州贝塞斯达NIH的高性能计算设施（NHLBI LoBoS集群）。
脚注
杰斐逊·D·奈特现在的地址是科罗拉多大学丹佛分校化学系，科罗拉多州丹佛市，邮编80217。
支持材料
电影S1。1PH在PC/PIP3（98:2）膜上的扩散： 电影S2。2PH在PC/PIP3（98:2）膜上的扩散： 电影S3。3PH在PC/PIP3（98:2）膜上的扩散： 工具书类
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