生物化学杂志。2009年11月13日;284(46): 32015–32027.
MicroRNA-122抑制肝癌细胞的致瘤特性并使其对索拉非尼敏感*![保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg](/pmc/articles/PMC2797273/bin/sbox.jpg)
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穆罕默德·纳赛尔
来自以下部门‡分子和细胞生物化学,
王波(Bo Wang)
来自以下部门‡分子和细胞生物化学,
卡尔帕纳·戈沙尔
来自以下部门‡分子和细胞生物化学,
这个‖俄亥俄州立大学综合癌症中心,俄亥俄州哥伦布市43210
来自以下部门‡分子和细胞生物化学,
§耳鼻咽喉头颈外科
¶病理学和
这个‖俄亥俄州立大学综合癌症中心,俄亥俄州哥伦布43210
1现住址:密歇根大学生物化学系,密歇根州安阿伯48109。
2这些作者为这项工作做出了同等贡献。
- 补充资料
补充数据
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摘要
微RNA是蛋白质编码基因的负调控因子。肝特异性microRNA-122(miR-122)在原发性肝细胞癌(HCC)中经常受到抑制。现场杂交显示miR-122在肝细胞中大量表达,但在原发性人类肝癌中几乎检测不到。miR-122在非表达HepG2、Hep3B和SK-Hep-1细胞中的异位表达逆转了它们在裸鼠中的致瘤特性,如生长、复制潜能、克隆存活、锚定非依赖性生长、迁移、侵袭和肿瘤形成。此外,表达miR-122的HCC细胞保留了与波形蛋白表达降低相关的上皮表型。ADAM10型(一 d日istintegrin公司一第米etalloprotease家族10)促进肿瘤发生的血清反应因子(SRF)和胰岛素样生长因子1受体(Igf1R)被证实为miR-122的靶点,并被microRNA抑制。相反,Huh-7细胞内源性miR-122缺失促进了其致瘤特性,同时伴随着这些靶点的上调。SRF或Igf1R的表达部分逆转了miR-122的抑癌功能。此外,miR-122阻碍内皮细胞的血管生成特性在体外值得注意的是,与匹配的肝组织相比,ADAM10、SRF和Igf1R在原发性人类肝癌中上调。共标记研究表明miR-122在良性肝脏中唯一定位,而SRF主要在肝癌中表达。更重要的是,经索拉非尼治疗后,表达miR-122的肝癌细胞的生长和克隆形成存活率显著降低,索拉非尼布是一种临床上有效对抗肝癌的多激酶抑制剂。总之,这些结果表明,多功能miR-122的缺失有助于HCC细胞的恶性表型,而miR-122模拟物单独或与抗癌药物联合可能是一种有希望的肝癌治疗方案。
介绍
肝细胞癌(HCC)4是第五大常见癌症,每年影响50多万人。尽管HCC在亚洲和撒哈拉以南非洲最为普遍,但在美国,HCC的发病率正在上升,在男性中,它是癌症相关死亡增长最快的原因(1). 主要危险因素是乙型和丙型肝炎病毒感染、酗酒、外源性药物、原发性胆汁性肝硬化、糖尿病、非酒精性脂肪性肝病以及血色素沉着症和α1-抗胰蛋白酶缺乏症等遗传疾病。高死亡率是由于其在晚期被检测到,且治疗选择有限。肝癌的5年生存率仅为5%,预计未来十年死亡率将大幅上升。尽管原发性肝癌是最常见的肝癌形式(>90%),但结肠癌、前列腺癌或乳腺癌的转移也可能导致肝癌。该病呈进行性,通常在最初诊断后10个月内死亡。
虽然在遗传水平上对肝癌发生的分子机制已经进行了很好的研究,但肝癌发生的其他潜在机制才刚刚开始出现。近年来,人们对理解microRNA在癌症中的作用产生了相当大的兴趣(2,三). MicroRNAs编码约21个核苷酸的小的非编码RNAs,现在被认为是植物、动物和病毒以及单细胞海藻中表达的一个大基因家族(4,5). MicoRNAs通过阻碍其翻译或破坏其mRNAs的稳定性,协同调节无数靶蛋白的表达(6). 大多数动物microRNAs在进化上是保守的,并且经常在集群中发现(7). 具有干环结构的初级microRNAs由RNA聚合酶II或RNA聚合物III转录,并在细胞核和细胞质中由类似RNase III的酶如Drosha和Dicer以及相关的辅因子进行处理,以生成成熟的microRNA。成熟的microRNA被特异蛋白识别,形成microRNA诱导的沉默复合物,促进其与主要位于靶mRNA 3′-UTR的同源序列的相互作用。microRNA表达失调发生在包括癌症在内的不同疾病中,某些microRNA作为致癌基因或肿瘤抑制因子发挥作用(8).
miR-122被鉴定为最丰富的肝脏特异性microRNA,占肝脏microRNA总量的70%,同时从小鼠不同组织中克隆小RNA(9,10). 这种进化保守的microRNA在妊娠期开始表达,并在成人肝脏中达到最大水平。miR-122促进复制(11)和翻译(12)丙型肝炎病毒核糖核酸,并积极调节胆固醇和甘油三酯水平(13,14). 用抗坏血酸耗竭miR-122小鼠肝脏RNA的微阵列分析表明,miR-122耗竭后诱导的大多数基因通常在肝脏中受到抑制,这意味着肝细胞去分化(15). 其表达已被证明受昼夜节律调节(16). miR-122在小鼠和人肝细胞中的水平很高,但在大多数肝癌和转化细胞系中,miR-122要么沉默,要么表达很低(9). 我们是第一个报道miR-122在缺乏胆碱饮食的大鼠和原发性人类肝癌的癌前结节和肝癌中表达下调的人(17). 最近研究表明,miR-122表达的缺失与肝癌的不良预后和转移相关(18,–20). 它在非酒精性脂肪性肝病患者中也被抑制,这种疾病通常会导致肝癌(21). 因此,合理的设想是miR-122功能的丧失会使肝细胞易发生肿瘤转化。在这里,我们检测了miR-122的抑癌特性在体外在培养的肝癌细胞和裸鼠体内,确定其可能在肝癌发生中起因果作用的靶点。此外,我们的数据还表明miR-122增强了索拉非尼在肝癌细胞中的生长抑制功能。
实验程序
细胞培养、索拉非尼治疗和组织获取
根据供应商提供的方案培养从ATCC获得的人肝癌细胞系(HepG2、Hep3B和SK-Hep-1)。收集细胞进行RNA分离,并对整个细胞提取物进行Western blot分析。原发性肝细胞癌和邻近正常组织样本来自俄亥俄州立大学詹姆斯癌症医院的合作人类组织网络。组织标本是根据俄亥俄州立大学癌症内部审查委员会的指导原则采购的。根据供应商的方案培养从Clontech获得的HepG2-脱细胞。用不同浓度的索拉非尼(从LC生化公司购买)溶解在二甲基亚砜中处理肝癌细胞。从Biowittaker(Walkersville,MD)购买的原始人类皮肤微血管内皮细胞(HDMEC)保存在含有5%胎牛血清和生长补充剂的内皮细胞基础培养基-2中。
表达miR-122的稳定HCC细胞系的产生在补充“材料和方法”使用miRVana试剂盒(Ambion)从福尔马林固定石蜡包埋(FFP)块中分离出微小RNA,如所述(22).
TaqMan RT-PCR定量miR-122
如前所述,从FFP组织切片中分离出RNA(23). 用DNase I(2个单位)在37°C下处理总RNA的等分试样(100 ng)15分钟,然后在65°C下加热灭活DNase I 5分钟。使用TaqMan MicroRNA试剂盒(Applied Biosystems)测定10 ng RNA。使用2−Δ计算机断层扫描方法(24). Northern blot分析按所述进行(25).
实时RT-PCR分析
用SYBR-Green方法,从DNA酶Ⅰ处理的总RNA合成的cDNA中检测ADAM10、SRF、GAPDH mRNA和18S rRNA(26). 引物序列见补充材料.
质粒的构建及稳定细胞系的产生
使用Accuprime Taq聚合酶(Invitrogen)从小鼠基因组DNA中扩增miR-122基因,并将其克隆到pBabe(SK-Hep-1)、pMSCV-PIG(Hep3B)或p-RevTRE(Clontech)(HepG2)载体中(27). 这些细胞被凤凰细胞中产生的逆转录病毒感染,如下所述(28). 72小时后,用2μg/ml嘌呤霉素筛选细胞。引物序列在补充数据.
从人淋巴细胞DNA中扩增出ADAM10、Igf1R和SRF的3′-UTR和miR-122位点缺失的3′-UTR,并将其克隆到TA克隆载体(Qiagen)中。用MluI和NheI检索插入物,并克隆到荧光素酶报告载体pIS0的相同位点(29). 通过测序确认了正确的克隆。引物序列在补充数据.
用miR-122模拟物、抑制剂(抗miR-122)和相应的阴性对照RNA转染细胞
按照制造商的方案,使用脂质内酰胺2000试剂(Invitrogen),用miR-122模拟物(Dharmacon)或miR-122抑制剂(Dharmcon)或相应的阴性对照RNA瞬时转染HCC细胞或HDMEC。24小时后,对细胞进行胰蛋白酶消化、计数,并按说明用于监测生长、迁移和侵袭(30). 对于miR-122分析和Western blot分析,分别在48小时后采集RNA和蛋白质细胞。
原位杂交(ISH)和共标记
现场用LNA修饰探针(Exicon)检测FFP组织切片中的miR-122,如下所述(23,24). 用一个打乱的探针作为阴性对照。为了进行联合标记,首先对组织切片进行ISH,然后根据公布的方案用抗SRF抗体进行免疫组织化学分析(31).
细胞增殖测定
如前所述,使用细胞增殖试剂盒I(MTT)(罗氏应用科学公司)监测细胞增殖(23). 所有实验均一式四份。
胸腺嘧啶掺入试验按所述进行测量(26,32). 按照说明进行软琼脂试验(33). 按照说明进行细胞运动分析(23). 中描述的细胞侵袭试验补充“材料和方法”Matrigel公司在体外按照描述进行内皮管形成测定(30).
SK-Hep-1细胞的体外肿瘤生长
体外SK-Hep-1细胞的肿瘤生长如所述进行(34). 为了观察小鼠肿瘤生长情况,首先通过转染pCMV-荧光素酶并用G418筛选产生表达荧光素酶的Hep3B细胞。接下来用pMSCV-miR-122或pMSCV单独转染这些细胞,并用嘌呤霉素筛选。将其中500万个细胞注射到裸鼠的侧翼,每周在150μl盐水中注射4.2 mg荧光素(金生物技术)后立即使用IVIS成像系统(Xenogen Corporation)监测肿瘤生长。
Western Blot分析
根据公布的方案,用不同抗体对从细胞或肿瘤组织中提取的蛋白质进行免疫印迹(24). 所用抗体的目录号见补充文本). 使用以牛血清白蛋白为标准的Bio-Rad蛋白质检测试剂盒评估蛋白质。柯达成像软件用于量化溴化乙锭染色凝胶和扫描x射线胶片(Western blot数据)。
统计分析
各组间差异的统计显著性由未配对学生的t吨测试,以及第页≤0.05被认为具有统计学意义。成对学生的t吨该试验用于实时RT-PCR分析肿瘤和配对非肿瘤组织中microRNA和mRNA表达水平的差异。所有实时RT-PCR(一式三份)、Western blotting和转染实验重复两次,获得可重复的结果。通过双尾Pearson相关检验分析miR-122和Igf1R mRNA水平之间的相关性。单星号和双星号表示第页分别≤0.05和≤0.01。
结果
miR-122在原发性人类肝癌中的表达显著降低
我们早些时候通过Northern blot分析从20个冷冻肝癌样品中分离的RNA,发现miR-122在肿瘤中被特异性抑制(17). 在这里,我们通过TaqMan实时RT-PCR测量了FFP组织中miR-122的表达(n个=16)(详见“实验程序”)。结果表明,与邻近正常肝脏相比,14例肝癌组织中miR-122的表达显著降低,2例肝癌组织的miR-122表达增加(A类). 每个样本中的归一化miR-122水平如所示补充表S1我们还通过LNA-ISH分析了miR-122在FFP切片中的表达,结果显示其在良性肝组织中的稳健表达(蓝色)但在肝癌中几乎检测不到(B类). 带有干扰RNA的LNA-ISH未发出任何信号(数据未显示)。LNA-ISH对18个不同肝癌样本的分析表明,miR-122仅在22%的肝癌中检测到。值得注意的是,肝硬化中miR-122也下调(31%)。因此,肝硬化中miR-122表达的缺失可能会导致肝细胞发生转化。
原发性肝癌中miR-122的表达降低。 A类与匹配的肝组织相比,原发性人类肝癌中miR-122的表达显著下调。显示了使用miR-122和RNU6B(snRNA U6B)引物和探针的TaqMan RT-PCR分析。每个样品分析一式三份。结果是三个独立实验的平均值±S.D。B类,代表就地显示miR-122在肝脏中表达但在HCC中不表达的杂交数据。miR-122的表达通过就地用LNA修饰的反义miR-122探针杂交。将组织切片与生物素标记的寡核苷酸(反义miR-122或加扰)杂交,该寡核苷酸被碱性磷酸酶结合的β-抗坏血酸捕获,信号(蓝色)用硝基蓝四氮唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸进行开发。细胞核用固红染色。不同良性、肝硬化和肝癌样本中miR-122阳性样本的定量见下部面板.
miR-122抑制肝癌细胞的致瘤特性
接下来,我们通过转染miR-122模拟物或通过生成表达miR-122的稳定细胞系来检测miR-122在不同人类肝癌细胞系中的抗肿瘤功能。miR-122仅在转染miR-122的SK-Hep-1细胞中检测到,但其水平低于肝脏中的水平(A类). 功能研究表明,miR-122的表达显著抑制了这些细胞的生长,并随着时间的推移而增加(B类)与48%的复制潜力降低相关(C类). 同样,miR-122异位表达后,单个细胞在软琼脂中形成集落的能力降低了22%(D类和补充图S1). miR-122的表达也阻碍了SK-Hep-1细胞向放置在跨孔板底室的含有血清的培养基的迁移(E类). miR-122还降低了SK-Hep-1细胞在裸鼠体内产生肿瘤的能力(F类)癌细胞的另一个特征。与对照组相比,1-4只小鼠的肿瘤生长分别减少了64、64、50和40%。这些结果证明了miR-122在SK-Hep-1细胞中的抑癌特性。与裸鼠移植前SK-Hep-1细胞相比,肿瘤中miR-122水平显著下降,这可能解释了这种microRNA对肿瘤生长的适度抑制作用(G公司).
异位miR-122的表达抑制SK-Hep-1细胞的致瘤性。 A类,对这些细胞的总RNA(15μg)进行Northern blot分析32P标记的抗miR-122或抗5 S rRNA寡核苷酸作为探针。B类,细胞(1000个细胞/孔)接种在96周板中,每24小时用MTT法监测细胞生长。d日表示培养中的天数。每种细胞类型分析一式四份。第1天的吸光度值指定为1。结果是三个独立实验的平均值±S.D。C类,细胞(10000个细胞/孔,24孔板)隔夜无血清,然后添加血清和[三H] 胸腺嘧啶持续2小时,以及[三H] 在闪烁计数器中测量掺入DNA的胸苷。每项实验一式三份,重复两次。D类miR-122表达细胞中的锚定非依赖性生长受到抑制。单元格(105在60mm培养皿中)进行软琼脂试验,2周后形成的菌落用结晶紫染色并计数。每个样品分析一式三份。菌落形成效率通过任意指定对照组中形成的菌落为100来确定。E类,miR-122抑制细胞通过跨西插入物(8-μm孔径)的迁移。单元格(1×104)在无血清培养基中,在37°C的温度下,将无血清培养液分层放置在双室板的顶部腔室中,然后迁移到含有补充血清培养基的底部腔室中48小时。迁移到插入物底部的细胞悬浮在含有5%乙酸和5%甲醇的磷酸盐缓冲盐水中,用Hema 3染色。显影的颜色在595 nm处测量。将迁移至含有无血清培养基的底室的细胞的吸光度用作阴性对照。结果是三个实验的平均值±S.D。F类,miR-122抑制裸鼠肿瘤生长。电池(2×106)将转染有对照RNA或miR-122模拟物的细胞与50%Matrigel混合,并皮下注射到裸鼠的侧翼。4周后,切除肿瘤并进行分析。面板i,小鼠肿瘤发育照片。第二组,各组肿瘤的平均重量。G公司,通过实时RT-PCR在裸鼠移植前的细胞和4周后发展的肿瘤中表达miR-122。数据归一化为RNU6B。
为了证实miR-122的抗肿瘤特性不仅限于SK-Hep-1细胞,我们在另外两个肝癌细胞系中测试了其功能。用稳定表达miR-122的逆转录病毒载体转染不表达可检测miR-122基因的Hep3B细胞(补充图S2A类). 培养5天后,miR-122表达细胞的生长略有下降,但显著下降(A类)与G区细胞数量增加相关1期(对照组和miR-122表达细胞分别为64%和74%)和S期(对照和miR-122-表达细胞分别是30%和18%)(B类). 同样,在miR-122表达细胞中,Hep3B细胞的克隆形成存活率也显著降低(~50%)(补充图S2B类). 接下来,我们使用生物发光成像技术测试miR-122抑制裸鼠Hep3B细胞生长的能力(C类). 为此,将共同表达萤火虫荧光素酶和miR-122的稳定细胞系以及空载体分别注射到每周成像的裸鼠的左右两侧。裸鼠肿瘤图像的代表性照片如所示C类(面板i). 荧光素酶信号的量化显示,与对照组相比,所有四只小鼠中miR-122表达细胞形成肿瘤的能力都有所降低,尽管水平不同(1-4只小鼠分别为81%、25%、82%和55%)(C类,第二组).
miR-122的异位表达抑制了Hep3B和HepG2细胞的致瘤特性。 A类,Hep3B细胞的生长通过MTT分析进行测量,如图例所述.结果是三个独立实验的平均值±S.D。B类,通过荧光激活细胞分选仪分析表达和控制Hep3B细胞的细胞周期曲线miR-122。单元格(1×106)转染后72小时在−20°C的70%乙醇中固定过夜并清洗,在FACSCaliber中测量用RNase A处理的细胞中碘化丙啶的掺入。C类,裸鼠肿瘤生长。Hep3B细胞(5×106将表达荧光素酶或与miR-122联合表达的100μl磷酸盐缓冲盐水分别注射到裸鼠的左右两侧皮下(详见“实验程序”)。每周(最多3周),向小鼠注射荧光素(4.2 mg,150μl生理盐水),通过IVIS系统成像监测肿瘤生长。刻度表示最小和最大光子强度。面板i,四只小鼠肿瘤的照片。第二组显示了在每只小鼠的每个肿瘤中捕获的荧光素酶信号,即感兴趣区域(ROI)。D类实时RT-PCR分析表达miR-122或载体的稳定HepG2-tet-off细胞中的miR-122。miR-122表达归一化为miR-191。E类miR-122表达的HepG2-tet-off细胞的形态与转染载体的细胞不同。相同的数字(1×106)接种在100毫米培养皿中的细胞可以生长14天,并在第3天和第14天在相差显微镜下拍照。F类间充质细胞标记物波形蛋白的Western blot分析,以及全细胞提取物中的GAPDH。文中给出了归一化为GAPDH的波形蛋白水平。
miR-122在另一个不表达的HCC细胞系HepG2中的表达也导致培养中的生长和通过基底膜的侵袭小而显著的减少(补充图S3). 为了研究miR-122对这些细胞形态的影响,我们建立了表达miR-122的稳定细胞系(D类). 值得注意的是,表达miR-122的HepG2细胞的形态与转染载体的细胞不同。在培养3天后,两种细胞类型均显示出上皮形态,但在表达miR-122的细胞中,细胞间的接触非常显著(E类). 在培养14天后,对照细胞中的上皮形态消失,可能是因为过度生长和向间充质表型的转化,如间充质细胞标记物Vimentin的表达所示(F类). 相反,miR-122表达细胞在培养14天后仍保持上皮形态(E类)与这些细胞中波形蛋白表达显著下降(50%)相关(F类),暗示miR-122参与维持HepG2细胞的上皮表型。
接下来,我们研究了表达miR-122的Huh-7细胞中miR-122是否耗竭,尽管其水平低于肝脏(补充图S4A类),可以增强其致瘤性。抗miR-122转染(50 n米)导致其表达减少约50%(补充图S4A类)与促进增长相关(补充图S4B类),复制潜力(补充图S4C类),迁移(补充图S4D类)和克隆生存(补充图S4E类)总之,这些结果证明了miR-122在HCC细胞中的抗肿瘤特性。
miR-122负调控ADAM10的表达(一 D类istintegrin公司一第M(M)etalloprotease家族10),在人类原发性肝癌中上调
接下来,我们试图确定miR-122的靶mRNA,它们可能在肿瘤发生中起作用。数据库搜索揭示了几个生长调节mRNA,它们在3′-UTR中保存了miR-122识别位点。我们将注意力集中在ADAM10上(A类,面板i)因为ADAM家族蛋白参与多种生物过程,如细胞粘附、细胞融合、细胞迁移和侵袭、膜蛋白脱落和蛋白水解(35,36).
作为miR-122靶点的ADAM10在原发性人类肝癌中显著上调。 A类,面板i,ADAM10的3′-UTR中保守的miR-122同源位点。面板ii,ADAM10的3′-UTR驱动的荧光素酶活性被miR-122的异位表达所抑制。用缺失miR-122互补位点的萤火虫荧光素酶-3′-UTR-(ADAM10)或ADAM10的3′-UTR与miR-122模拟物或对照RNA(50 n)共转染Hep3B细胞米)与pRL-TK(作为内部控制)一起使用Lipofectamine 2000。48小时后,萤火虫(RLU-1)和雷尼利亚使用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素素酶(RLU-2)活性。结果表示为萤火虫荧光素酶归一化为雷尼利亚荧光素酶是四次重复实验的平均值±标准偏差。B类,细胞提取物进行免疫印迹分析,数据归一化为Ku-70。miR-122的相应表达如下部面板。在两个独立的实验中获得了可重复的结果。C类通过实时RT-PCR分析检测肝癌和匹配肝组织中ADAM10 mRNA和miR-122的表达。数据显示为盒子状图。这个水平线在每个箱代表分别归一化为GAPDH或RNU6B的ADAM10 mRNA或miR-122的中值。方框表示分数的第50和75百分位范围(如图所示),而络腮胡子表示最高和最低值。D类、肝癌及匹配肝提取物中ADAM10的Western blot分析。使用柯达成像软件对每条车道上的信号进行量化。规范化数据显示在下部面板.
为了证明miR-122通过与其3′-UTR相互作用直接调控ADAM10的表达,我们与miR-122或对照RNA共同转染了携带萤火虫荧光素酶报告子下游ADAM10 3′-UCR的pIS0,第页=0.04)在miR-122表达后的pIS0-ADAM10中特异性地观察到荧光素酶活性,当miR-122位点从ADAM10–3′-UTR中缺失时,这种活性被消除(A类,第二组). 这些结果表明,miR-122通过与其3′-UTR相互作用负调控ADAM10的表达。
为了证实miR-122调节HCC细胞中内源性ADAM10蛋白的表达,我们在表达异位miR-122的SK-Hep-1和Hep3B细胞或缺乏内源性miR-122的Huh-7细胞中测量了其水平。结果表明,异位表达miR-122后,SK-Hep-1和Hep3B细胞中ADAM10水平分别降低了50%和80%(B类). 相反,在转染50和100 n的Huh-7细胞中,其表达分别增加了40%和100%米抗miR-122(B类). 每种细胞类型中的相对miR-122水平分别显示在下部面板属于B类这些数据还表明,miR-122对ADAM10蛋白的影响比对异源荧光素酶蛋白的影响更为显著。值得注意的是,ADAM10和ADAM17的RNA水平,这是miR-122的另一个有效靶点(20),也被miR-122抑制(补充图S5).
原发性人类肝癌中ADAM10 RNA水平分析显示显著升高(第页=0.02)与匹配的肝组织相比(C类). 相反,miR-122在大多数HCC样本中表达下调(C类). ADAM10和miR-122 RNA水平的相对表达见补充表S2和S3分别是。标准化为Ku-70的ADAM10蛋白水平也显著(第页=0.01)与匹配的肝组织相比,HCC升高(~67%)(D类). 这些结果提示miR-122的抑制可能是原发性肝癌ADAM10上调的机制之一。
miR-122靶点SRF在原发性肝癌中上调
SRF是一种广泛表达的多效性转录因子,通过与血清反应元件结合,激活即刻早期基因以响应生长因子和有丝分裂刺激(37). 它调节细胞增殖、分化和细胞骨架重组。接下来,我们将注意力集中在SRF上,因为它有助于上皮-间充质转化(38)内皮细胞的血管生成(39). 因为SRF的3′-UTR包含一个保守的miR-122同源位点(补充图S6A类),我们试图确认SRF是否是miR-122的真正靶点。为此,用pIS0-3′-UTR-SRF(野生型)或pIS0-3'-UTR(Δ-miR-122)-SRF以及miR-122模拟或控制RNA转染的细胞检测荧光素酶活性(补充图S6B类). 因此,miR-122通过直接与SRF的3′-UTR相互作用调节荧光素酶活性。实时RT-PCR分析显示,表达miR-122的HepG2(65%)、Hep3B(63%)和SK-Hep-1(33%)细胞中SRF mRNA水平显著降低(A类). 异位表达miR-122后,HepG2和SK-Hep-1细胞中的SRF蛋白水平也分别降低了70%和45%(B类).
SRF和Igf1R是miR-122的靶点。 A类转染(50 n)的肝癌细胞SRF mRNA水平米)通过实时RT-PCR测量对照RNA或模拟物(HepG2、Hep3B和SK-Hep-1),并将数据归一化为GAPDH。B类表达miR-122的肝癌细胞中SRF蛋白水平。用对照或miR-122模拟物转染的细胞提取物中SRF和GAPDH的蛋白质印迹分析(50米).C类,面板i、肝癌和匹配肝组织SRF的Western blot分析。用SRF和Ku-70抗体对全组织提取物进行免疫印迹分析。这个星号表示SRF上调的样本。第二组,SRF级别归一化为Ku-70级别。D类miR-122和SRF在原发性人肝癌FFP切片中的联合标记。将组织切片与生物素化和LNA修饰的反义miR-122探针杂交,该探针由碱性磷酸酶结合的抗坏血酸蛋白酶捕获,信号(蓝色)用硝基蓝四氮唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸进行开发。接下来,用抗SRF抗体对切片进行免疫组化,以快速红色染料作为染色原。E类,Igf1R RNA的表达(上部面板)和蛋白质(下部面板)在转染miR-122的细胞中(在HepG2中,面板i)或抗miR-122(在Huh-7中,面板ii)分别通过实时RT-PCR和Western blot分析。
然后我们评估了原发性人类肝癌样本中的SRF水平。Western blot分析显示,与匹配的肝组织相比,7例HCC组织中有6例的SRF水平增加(C类). 肝癌患者的SRF水平平均增加了~3倍。通过联合LNA-ISH(检测miR-122)和免疫组织化学(检测SRF)分析组织中SRF和miR-122的水平(D类). 正如所料,miR-122在良性肝脏中大量表达,但在HCC中未检测到(D类,左侧面板). 相反,SRF在HCC中的表达较高,但在肝脏中可以忽略不计(D类,右侧面板). 这些结果证明了原发性肝癌中miR-122及其靶SRF的相互调节。
miR-122及其靶点Igf1R在原发性肝癌中相互调节
Igf1R是一种对IGF-1和IGF-2具有高亲和力的受体酪氨酸激酶,可刺激细胞生长、存活、分化和增殖。通过IGF1R的信号调节癌细胞的启动、进展和转移以及对治疗的抵抗(40,41). 因为Igf1R含有一个保守的miR-122结合位点(补充图S7A类),我们首先验证它是miR-122的靶点。Igf1R 3′-UTR控制的荧光素酶活性确实因miR-122的异位表达而降低(补充图S7B类). 实时RT-PCR分析表明,miR-122表达下调HepG2细胞中Igf1R表达45%(E类). 相反,Huh-7细胞中miR-122的缺失导致其水平增加4.25倍。Western blot分析证实,miR-122对HepG2和Huh-7细胞中的Igf1R蛋白水平进行了负调控(E类).
通过实时RT-PCR对Igf1R表达的评估显示,与配对对照相比,HCC显著增加(补充图S7C类). 相关分析显示显著(第页=0.01)原发组织中Igf1R和miR-122的负相关(第页= −0.584) (补充图S7D类). 这些数据证实了Igf1R在原发性人类肝癌中的上调,并暗示miR-122是参与其调控的因素之一。
SRF和Igf1R cDNA异位表达可逆转miR-122的生长抑制特性
为了证明miR-122功能,至少部分是通过这些靶点介导的,我们用缺乏各自3′-UTR的SRF或Igf1R表达载体转染表达miR-122的肝癌细胞。Western blot分析表明,与转染载体的细胞相比,SK-Hep-1细胞中这些蛋白的表达增加(A类). MTT分析显示Igf1R的过度表达(B类)和SRF(C类)逆转miR-122对生长和克隆存活的抑制作用(D类). 在HepG2细胞中也得到了类似的结果(补充图S8).
缺少3′-UTR的SRF或Igf1R的联合表达可部分逆转miR-122的生长抑制特性。将表达miR-122或载体的SK-Hep-1细胞与SRF、Igf1R表达载体或相应的空载体共转染。A类48h后分离细胞提取物进行Western blot分析。B类和C类MTT分析(转染后72小时)。D类细胞克隆存活率(转染后2周)。
miR-122体外抑制内皮细胞的血管生成潜能
肿瘤微环境中的内皮细胞需要形成新血管或新生血管来维持肿瘤生长(42). 血管生成是一个涉及内皮细胞增殖、迁移和毛细血管形成的多步骤过程。由于miR-122抑制裸鼠肿瘤生长,我们研究它是否直接影响内皮细胞(HDMEC)的血管生成功能在体外在HDMEC细胞中转染miR-122或对照RNA导致miR-122水平显著升高,但其水平远低于肝脏(A类). 由于miR-122的表达,这些细胞的生长被抑制了60%(B类). 通过细胞向抓痕的横向迁移来测量miR-122表达细胞的运动受到了显著阻碍(补充图S9). 值得注意的是,即使在72小时后,表达miR-122的细胞的划痕仍保持开放状态。同样,由于miR-122表达,这些细胞在Matrigel中形成互连管的能力受到损害(减少57%)(C类). miR-122的所有三个靶点,即内皮细胞中的ADAM10、SRF和Igf1R均减少(D类)在异位表达miR-122时,其在miR-122介导的抑制这些细胞血管生成特性中的作用。
miR-122抑制内皮细胞的生长和管形成在体外.转染50 n的HDMEC细胞米对miR-122或使用Lipofectamine 2000的对照RNA进行胰蛋白酶消化、计数,并在24小时后用于不同的分析。A类,转染后96小时细胞中miR-122水平。B类MTT法检测转染后48 h HDMEC细胞的增殖情况。C类, 1.6 × 10三将添加有2%血清的内皮细胞基础培养基-2中的细胞添加到Matrigel涂层孔中,并在37°C下孵育16–18 h。孵育结束时,将培养基从Matrigel表面抽吸出来,用甲醇固定细胞,并用Diff-Quick溶液II染色。每个腔室在显微镜下拍照,使用NIS-Elements-BS(尼康)计算每个腔室中内皮细胞衍生管所占的总面积,并表示为血管生成评分。D类,用特异性抗体对细胞裂解物进行蛋白质印迹分析(转染后72小时)。ADAM10、SRF和Igf1R水平归一化为微管蛋白。
miR-122的表达使肝癌细胞对索拉非尼敏感
索拉非尼是美国食品和药物管理局最近批准的唯一一种口服多激酶抑制剂,在提高晚期HCC患者的总体生存率方面已证明有效(43). 因为microRNA可以调节癌细胞对化疗药物的敏感性(22,23),我们测试了miR-122是否能使细胞对索拉非尼敏感。为此,我们用该药物治疗表达miR-122的肝癌细胞株,并通过MTT或集落形成试验测定细胞存活率。MTT分析表明,当暴露于浓度为2.5至10μg的索拉非尼时,表达miR-122的HepG2细胞的存活率显著降低米与对照细胞相比(A类). 在表达miR-122的Hep3B细胞中也获得了类似的结果(补充图S10). TUNEL阳性HepG2细胞的定量显示,索拉非尼治疗后表达miR-122的凋亡细胞增加了35%(B类). 未经处理的细胞凋亡可以忽略不计(数据未显示)。同样,与对照组相比,索拉非尼治疗后表达miR-122的SK-Hep-1细胞的克隆形成存活率显著降低,且呈剂量依赖性(C类).
索拉非尼治疗后,表达miR-122的肝癌细胞的存活率显著降低。 A类将转染载体和表达miR-122的细胞接种在不同浓度索拉非尼处理的96-well板中24 h,用MTT法测定细胞存活率。未处理细胞的存活率为100%。B类,用10μ米索拉非尼48小时后,使用就地细胞死亡检测试剂盒(Roche Applied Science),并在10倍放大率下对四个区域的阳性细胞进行计数。面板i和ii(ii),TUNEL-positive的代表性照片(绿色)和细胞总数(相位对比度)。C类miR-122表达或载体转染SK-Hep-1细胞在索拉非尼存在下的克隆形成存活。细胞(500)在60毫米的培养皿中培养,48小时后用药物治疗。每72小时更换一次培养基和药物。10天后对菌落进行染色和计数。D类用不同抗体处理索拉非尼后的细胞提取物进行Western blot分析。
为了了解潜在的机制,我们测量了用不同浓度索拉非尼处理的HepG2细胞中磷酸-MAPK(索拉非尼布的靶点)的水平。结果表明,对照(载体转染)细胞的p-MAPK水平较高,仅在10μ米索拉非尼(D类). 相反,miR-122表达细胞中p-MAPK的基础水平至少降低了30%,随着索拉非尼浓度的增加,该水平进一步降低。同样,随着索拉非尼浓度的增加,miR-122表达细胞中抗凋亡Mcl-1的表达逐渐减少。相反,仅在用10μ米索拉非尼(D类). 总之,这些结果表明miR-122的表达促进了索拉非尼对HCC细胞的生长抑制特性。
讨论
自从拉各斯-金塔纳等。(10)从肝脏中克隆出miR-122,人们将注意力集中在试图理解这种发育调控的肝脏特异性microRNA的功能上(有关综述,请参阅参考文献。44). 它是一种可以通过全身施用修饰的抗微小RNA在肝脏中有效消耗的微小RNA。它的消耗导致血清胆固醇和甘油三酯的降低,表明它对脂质代谢有积极调节作用(13,14). 由于其对高胆固醇血症的潜在疗效,这一观察结果引起了极大的兴奋。在非酒精性脂肪性肝炎诱发肝癌的啮齿动物模型中分析microRNA时,我们偶然发现miR-122是一种潜在的肿瘤抑制因子(17). 将这项研究扩展到人类表明,miR-122的缺失与原发性肝癌患者的不良预后和转移相关(18,–20). 此外,在人类非酒精性脂肪性肝炎患者中其含量也降低(21)提示其表达缺失可能是包括肝癌在内的不同肝病的预后标志物。有趣的是,miR-122可能是肝损伤的潜在生物标志物,因为它在接受对乙酰氨基酚治疗的小鼠血清中升高(45).
肝癌中这种肝脏特异性microRNA的显著减少提示我们,这种最丰富的microRNA可能在维持肝功能方面发挥作用,其中的异常可能导致肝细胞去分化,从而导致肝癌。在本研究中,我们试图检测抗肿瘤特性在体外和体外肝癌细胞中miR-122的表达。我们的结果表明,miR-122抑制癌细胞的所有特性,如克隆形成存活、凤尾鱼非依赖性生长、迁移、侵袭、上皮-间充质转化以及裸鼠体内形成肿瘤的能力。这些结果支持miR-122在肝脏中发挥抑癌作用的观点。事实上,在缺乏内源性miR-122的小鼠中,肝脏中通常被抑制的基因的激活暗示了其在维持肝脏分化状态中的作用。此外,我们的结果还表明miR-122直接抑制内皮细胞的血管生成特性在体外,暗示其在抗癌治疗中的潜在应用。
miR-122的预测靶点包括与分化、细胞周期进展、炎症、转录、蛋白质生物合成、胆固醇和碳水化合物代谢有关的因素(参考文献。21). 我们的研究确定了miR-122的三个关键靶点,即ADAM10、Igf1R和SRF,它们在各种癌症的肿瘤发生中起着关键作用。事实上,针对Igf1R的抗体和小分子抑制剂目前正在临床前和临床试验中作为针对不同恶性肿瘤的治疗方案进行测试。
众所周知,某些微RNA会产生耐药性(22)或灵敏度(23)癌细胞。我们很想研究miR-122是否能增强肝癌细胞对任何化疗药物的敏感性。直到最近,HCC患者的总体生存率仍然很低,因为检测到的时间较晚,并且没有有效的药物。索拉非尼是唯一能提高肝癌患者总体生存率的药物(43). 因为它是不同Ser/Thr和Tyr激酶的广谱抑制剂,包括miR-122的靶点Igf1R,我们测试了miR-122是否可以协同其抑制功能。培养HCC细胞的良好结果为在动物模型中测试miR-122模拟物和索拉非尼的联合治疗提供了理论基础。
在我们编写这份手稿的过程中,另一个小组发表了一篇论文,通过靶向ADAM17证明miR-122在原位肝癌小鼠模型中的抑癌作用(20). ADAM家族蛋白ADAM10和ADAM17通过其胞外区脱落酶活性参与生长因子、细胞因子和Notch信号以及细胞间粘附(35,36). ADAMs的下调可以解释肝癌的致瘤特性,因为它们是表皮生长因子受体和G蛋白偶联受体诱导不同肿瘤迁移和侵袭的关键调节因子。目前正在进行深入研究,以开发ADAM10和ADAM17蛋白酶活性的有效抑制剂。miR-122靶向两个ADAM家族成员表明其在调节这些蛋白酶方面的潜在治疗应用。
SRF是一种MADS(Mcm1、Ag、Defa和SRF)盒转录因子,调节涉及细胞生长、分化、迁移、细胞骨架组织、能量代谢和肌生成的多个基因(38). 最近有报道称,SRF在高级别HCC中特异性上调,其表达促进HCC细胞的迁移、侵袭和间充质转化(46). SRF是血管内皮生长因子信号转导的下游靶点,对VEGF诱导的内皮细胞血管生成至关重要。我们的研究表明miR-122可以直接抑制血管生成在体外同时抑制所有三个靶标,即ADAM10、SRF和Igf1R。
所有阐明miR-122抑癌特性的功能研究都基于培养的HCC细胞或体外在小鼠中。miR-122的真正生物学功能及其在肝癌发生中的作用可以通过敲除小鼠来解决。这些方面的研究正在进行中。
致谢
我们感谢John Taylor博士和David Bartel博士分别提供Huh-7细胞和pIS0。我们感谢Samson T.Jacob博士、Sarmila Majumdar博士和Tasneem Motiwala博士批判性地阅读了手稿。我们还感谢Sarmila Majumder博士对TUNEL分析的帮助。
4使用的缩写如下:
- 肝癌
- 肝细胞癌
- miR-122型
- 微RNA-122
- 战略参考框架
- 血清反应因子
- LNA-ISH公司
- 就地锁定核酸修饰反义探针杂交
- 隧道
- 脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记
- 免疫球蛋白1R
- 胰岛素样生长因子1受体
- 超光速
- 非翻译区域
- HDMEC公司
- 人皮肤微血管内皮细胞
- FFP公司
- 福尔马林固定石蜡包埋
- RT公司
- 反转录
- GAPDH公司
- 甘油醛-3-磷酸脱氢酶
- MTT公司
- 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴
- MAPK公司
- 丝裂原活化蛋白激酶。
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