MicroRNA-122抑制肝癌细胞的致瘤特性并使其对索拉非尼敏感^*

TaqMan RT-PCR定量miR-122

如前所述，从FFP组织切片中分离出RNA(23). 用DNase I（2个单位）在37°C下处理总RNA的等分试样（100 ng）15分钟，然后在65°C下加热灭活DNase I 5分钟。使用TaqMan MicroRNA试剂盒（Applied Biosystems）测定10 ng RNA。使用2^{−Δ计算机断层扫描}方法(24). Northern blot分析按所述进行(25).

实时RT-PCR分析

用SYBR-Green方法，从DNA酶Ⅰ处理的总RNA合成的cDNA中检测ADAM10、SRF、GAPDH mRNA和18S rRNA(26). 引物序列见补充材料.

质粒的构建及稳定细胞系的产生

使用Accuprime Taq聚合酶（Invitrogen）从小鼠基因组DNA中扩增miR-122基因，并将其克隆到pBabe（SK-Hep-1）、pMSCV-PIG（Hep3B）或p-RevTRE（Clontech）（HepG2）载体中(27). 这些细胞被凤凰细胞中产生的逆转录病毒感染，如下所述(28). 72小时后，用2μg/ml嘌呤霉素筛选细胞。引物序列在补充数据.

从人淋巴细胞DNA中扩增出ADAM10、Igf1R和SRF的3′-UTR和miR-122位点缺失的3′-UTR，并将其克隆到TA克隆载体（Qiagen）中。用MluI和NheI检索插入物，并克隆到荧光素酶报告载体pIS0的相同位点(29). 通过测序确认了正确的克隆。引物序列在补充数据.

用miR-122模拟物、抑制剂（抗miR-122）和相应的阴性对照RNA转染细胞

按照制造商的方案，使用脂质内酰胺2000试剂（Invitrogen），用miR-122模拟物（Dharmacon）或miR-122抑制剂（Dharmcon）或相应的阴性对照RNA瞬时转染HCC细胞或HDMEC。24小时后，对细胞进行胰蛋白酶消化、计数，并按说明用于监测生长、迁移和侵袭(30). 对于miR-122分析和Western blot分析，分别在48小时后采集RNA和蛋白质细胞。

原位杂交（ISH）和共标记

现场用LNA修饰探针（Exicon）检测FFP组织切片中的miR-122，如下所述(23,24). 用一个打乱的探针作为阴性对照。为了进行联合标记，首先对组织切片进行ISH，然后根据公布的方案用抗SRF抗体进行免疫组织化学分析(31).

细胞增殖测定

如前所述，使用细胞增殖试剂盒I（MTT）（罗氏应用科学公司）监测细胞增殖(23). 所有实验均一式四份。

胸腺嘧啶掺入试验按所述进行测量(26,32). 按照说明进行软琼脂试验(33). 按照说明进行细胞运动分析(23). 中描述的细胞侵袭试验补充“材料和方法”Matrigel公司在体外按照描述进行内皮管形成测定(30).

SK-Hep-1细胞的体外肿瘤生长

体外SK-Hep-1细胞的肿瘤生长如所述进行(34). 为了观察小鼠肿瘤生长情况，首先通过转染pCMV-荧光素酶并用G418筛选产生表达荧光素酶的Hep3B细胞。接下来用pMSCV-miR-122或pMSCV单独转染这些细胞，并用嘌呤霉素筛选。将其中500万个细胞注射到裸鼠的侧翼，每周在150μl盐水中注射4.2 mg荧光素（金生物技术）后立即使用IVIS成像系统（Xenogen Corporation）监测肿瘤生长。

Western Blot分析

根据公布的方案，用不同抗体对从细胞或肿瘤组织中提取的蛋白质进行免疫印迹(24). 所用抗体的目录号见补充文本). 使用以牛血清白蛋白为标准的Bio-Rad蛋白质检测试剂盒评估蛋白质。柯达成像软件用于量化溴化乙锭染色凝胶和扫描x射线胶片（Western blot数据）。

miR-122抑制肝癌细胞的致瘤特性

接下来，我们通过转染miR-122模拟物或通过生成表达miR-122的稳定细胞系来检测miR-122在不同人类肝癌细胞系中的抗肿瘤功能。miR-122仅在转染miR-122的SK-Hep-1细胞中检测到，但其水平低于肝脏中的水平(图2A类). 功能研究表明，miR-122的表达显著抑制了这些细胞的生长，并随着时间的推移而增加(图2B类)与48%的复制潜力降低相关(图2C类). 同样，miR-122异位表达后，单个细胞在软琼脂中形成集落的能力降低了22%(图2D类和补充图S1). miR-122的表达也阻碍了SK-Hep-1细胞向放置在跨孔板底室的含有血清的培养基的迁移(图2E类). miR-122还降低了SK-Hep-1细胞在裸鼠体内产生肿瘤的能力(图2F类)癌细胞的另一个特征。与对照组相比，1-4只小鼠的肿瘤生长分别减少了64、64、50和40%。这些结果证明了miR-122在SK-Hep-1细胞中的抑癌特性。与裸鼠移植前SK-Hep-1细胞相比，肿瘤中miR-122水平显著下降，这可能解释了这种microRNA对肿瘤生长的适度抑制作用(图2G公司).

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图2。

异位miR-122的表达抑制SK-Hep-1细胞的致瘤性。 A类，对这些细胞的总RNA（15μg）进行Northern blot分析³²P标记的抗miR-122或抗5 S rRNA寡核苷酸作为探针。B类，细胞（1000个细胞/孔）接种在96周板中，每24小时用MTT法监测细胞生长。d日表示培养中的天数。每种细胞类型分析一式四份。第1天的吸光度值指定为1。结果是三个独立实验的平均值±S.D。C类，细胞（10000个细胞/孔，24孔板）隔夜无血清，然后添加血清和[^三H] 胸腺嘧啶持续2小时，以及[^三H] 在闪烁计数器中测量掺入DNA的胸苷。每项实验一式三份，重复两次。D类miR-122表达细胞中的锚定非依赖性生长受到抑制。单元格（10⁵在60mm培养皿中）进行软琼脂试验，2周后形成的菌落用结晶紫染色并计数。每个样品分析一式三份。菌落形成效率通过任意指定对照组中形成的菌落为100来确定。E类，miR-122抑制细胞通过跨西插入物（8-μm孔径）的迁移。单元格（1×10⁴)在无血清培养基中，在37°C的温度下，将无血清培养液分层放置在双室板的顶部腔室中，然后迁移到含有补充血清培养基的底部腔室中48小时。迁移到插入物底部的细胞悬浮在含有5%乙酸和5%甲醇的磷酸盐缓冲盐水中，用Hema 3染色。显影的颜色在595 nm处测量。将迁移至含有无血清培养基的底室的细胞的吸光度用作阴性对照。结果是三个实验的平均值±S.D。F类，miR-122抑制裸鼠肿瘤生长。电池（2×10⁶)将转染有对照RNA或miR-122模拟物的细胞与50%Matrigel混合，并皮下注射到裸鼠的侧翼。4周后，切除肿瘤并进行分析。面板i，小鼠肿瘤发育照片。第二组，各组肿瘤的平均重量。G公司，通过实时RT-PCR在裸鼠移植前的细胞和4周后发展的肿瘤中表达miR-122。数据归一化为RNU6B。

为了证实miR-122的抗肿瘤特性不仅限于SK-Hep-1细胞，我们在另外两个肝癌细胞系中测试了其功能。用稳定表达miR-122的逆转录病毒载体转染不表达可检测miR-122基因的Hep3B细胞(补充图S2A类). 培养5天后，miR-122表达细胞的生长略有下降，但显著下降(图3A类)与G区细胞数量增加相关₁期（对照组和miR-122表达细胞分别为64%和74%）和S期（对照和miR-122-表达细胞分别是30%和18%）(图3B类). 同样，在miR-122表达细胞中，Hep3B细胞的克隆形成存活率也显著降低（～50%）(补充图S2B类). 接下来，我们使用生物发光成像技术测试miR-122抑制裸鼠Hep3B细胞生长的能力(图3C类). 为此，将共同表达萤火虫荧光素酶和miR-122的稳定细胞系以及空载体分别注射到每周成像的裸鼠的左右两侧。裸鼠肿瘤图像的代表性照片如所示图3C类(面板i). 荧光素酶信号的量化显示，与对照组相比，所有四只小鼠中miR-122表达细胞形成肿瘤的能力都有所降低，尽管水平不同（1-4只小鼠分别为81%、25%、82%和55%）(图3C类,第二组).

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图3。

miR-122的异位表达抑制了Hep3B和HepG2细胞的致瘤特性。 A类，Hep3B细胞的生长通过MTT分析进行测量，如图例所述图2.结果是三个独立实验的平均值±S.D。B类，通过荧光激活细胞分选仪分析表达和控制Hep3B细胞的细胞周期曲线miR-122。单元格（1×10⁶)转染后72小时在−20°C的70%乙醇中固定过夜并清洗，在FACSCaliber中测量用RNase A处理的细胞中碘化丙啶的掺入。C类，裸鼠肿瘤生长。Hep3B细胞（5×10⁶将表达荧光素酶或与miR-122联合表达的100μl磷酸盐缓冲盐水分别注射到裸鼠的左右两侧皮下（详见“实验程序”）。每周（最多3周），向小鼠注射荧光素（4.2 mg，150μl生理盐水），通过IVIS系统成像监测肿瘤生长。刻度表示最小和最大光子强度。面板i，四只小鼠肿瘤的照片。第二组显示了在每只小鼠的每个肿瘤中捕获的荧光素酶信号，即感兴趣区域（ROI）。D类实时RT-PCR分析表达miR-122或载体的稳定HepG2-tet-off细胞中的miR-122。miR-122表达归一化为miR-191。E类miR-122表达的HepG2-tet-off细胞的形态与转染载体的细胞不同。相同的数字（1×10⁶)接种在100毫米培养皿中的细胞可以生长14天，并在第3天和第14天在相差显微镜下拍照。F类间充质细胞标记物波形蛋白的Western blot分析，以及全细胞提取物中的GAPDH。文中给出了归一化为GAPDH的波形蛋白水平。

miR-122在另一个不表达的HCC细胞系HepG2中的表达也导致培养中的生长和通过基底膜的侵袭小而显著的减少(补充图S3). 为了研究miR-122对这些细胞形态的影响，我们建立了表达miR-122的稳定细胞系(图3D类). 值得注意的是，表达miR-122的HepG2细胞的形态与转染载体的细胞不同。在培养3天后，两种细胞类型均显示出上皮形态，但在表达miR-122的细胞中，细胞间的接触非常显著(图3E类). 在培养14天后，对照细胞中的上皮形态消失，可能是因为过度生长和向间充质表型的转化，如间充质细胞标记物Vimentin的表达所示(图3F类). 相反，miR-122表达细胞在培养14天后仍保持上皮形态(图3E类)与这些细胞中波形蛋白表达显著下降（50%）相关(图3F类)，暗示miR-122参与维持HepG2细胞的上皮表型。

接下来，我们研究了表达miR-122的Huh-7细胞中miR-122是否耗竭，尽管其水平低于肝脏(补充图S4A类)，可以增强其致瘤性。抗miR-122转染（50 n米)导致其表达减少约50%(补充图S4A类)与促进增长相关(补充图S4B类)，复制潜力(补充图S4C类)，迁移(补充图S4D类)和克隆生存(补充图S4E类)总之，这些结果证明了miR-122在HCC细胞中的抗肿瘤特性。

miR-122负调控ADAM10的表达(一 D类istintegrin公司一第M（M）etalloprotease家族10)，在人类原发性肝癌中上调

接下来，我们试图确定miR-122的靶mRNA，它们可能在肿瘤发生中起作用。数据库搜索揭示了几个生长调节mRNA，它们在3′-UTR中保存了miR-122识别位点。我们将注意力集中在ADAM10上(图4A类,面板i)因为ADAM家族蛋白参与多种生物过程，如细胞粘附、细胞融合、细胞迁移和侵袭、膜蛋白脱落和蛋白水解(35,36).

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图4。

作为miR-122靶点的ADAM10在原发性人类肝癌中显著上调。 A类,面板i，ADAM10的3′-UTR中保守的miR-122同源位点。面板ii，ADAM10的3′-UTR驱动的荧光素酶活性被miR-122的异位表达所抑制。用缺失miR-122互补位点的萤火虫荧光素酶-3′-UTR-（ADAM10）或ADAM10的3′-UTR与miR-122模拟物或对照RNA（50 n）共转染Hep3B细胞米)与pRL-TK（作为内部控制）一起使用Lipofectamine 2000。48小时后，萤火虫（RLU-1）和雷尼利亚使用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素素酶（RLU-2）活性。结果表示为萤火虫荧光素酶归一化为雷尼利亚荧光素酶是四次重复实验的平均值±标准偏差。B类，细胞提取物进行免疫印迹分析，数据归一化为Ku-70。miR-122的相应表达如下部面板。在两个独立的实验中获得了可重复的结果。C类通过实时RT-PCR分析检测肝癌和匹配肝组织中ADAM10 mRNA和miR-122的表达。数据显示为盒子状图。这个水平线在每个箱代表分别归一化为GAPDH或RNU6B的ADAM10 mRNA或miR-122的中值。方框表示分数的第50和75百分位范围（如图所示），而络腮胡子表示最高和最低值。D类、肝癌及匹配肝提取物中ADAM10的Western blot分析。使用柯达成像软件对每条车道上的信号进行量化。规范化数据显示在下部面板.

为了证明miR-122通过与其3′-UTR相互作用直接调控ADAM10的表达，我们与miR-122或对照RNA共同转染了携带萤火虫荧光素酶报告子下游ADAM10 3′-UCR的pIS0，第页=0.04）在miR-122表达后的pIS0-ADAM10中特异性地观察到荧光素酶活性，当miR-122位点从ADAM10–3′-UTR中缺失时，这种活性被消除(图4A类,第二组). 这些结果表明，miR-122通过与其3′-UTR相互作用负调控ADAM10的表达。

为了证实miR-122调节HCC细胞中内源性ADAM10蛋白的表达，我们在表达异位miR-122的SK-Hep-1和Hep3B细胞或缺乏内源性miR-122的Huh-7细胞中测量了其水平。结果表明，异位表达miR-122后，SK-Hep-1和Hep3B细胞中ADAM10水平分别降低了50%和80%(图4B类). 相反，在转染50和100 n的Huh-7细胞中，其表达分别增加了40%和100%米抗miR-122(图4B类). 每种细胞类型中的相对miR-122水平分别显示在下部面板属于图4B类这些数据还表明，miR-122对ADAM10蛋白的影响比对异源荧光素酶蛋白的影响更为显著。值得注意的是，ADAM10和ADAM17的RNA水平，这是miR-122的另一个有效靶点(20)，也被miR-122抑制(补充图S5).

原发性人类肝癌中ADAM10 RNA水平分析显示显著升高(第页=0.02）与匹配的肝组织相比(图4C类). 相反，miR-122在大多数HCC样本中表达下调(图4C类). ADAM10和miR-122 RNA水平的相对表达见补充表S2和S3分别是。标准化为Ku-70的ADAM10蛋白水平也显著(第页=0.01）与匹配的肝组织相比，HCC升高（～67%）(图4D类). 这些结果提示miR-122的抑制可能是原发性肝癌ADAM10上调的机制之一。

miR-122靶点SRF在原发性肝癌中上调

SRF是一种广泛表达的多效性转录因子，通过与血清反应元件结合，激活即刻早期基因以响应生长因子和有丝分裂刺激(37). 它调节细胞增殖、分化和细胞骨架重组。接下来，我们将注意力集中在SRF上，因为它有助于上皮-间充质转化(38)内皮细胞的血管生成(39). 因为SRF的3′-UTR包含一个保守的miR-122同源位点(补充图S6A类)，我们试图确认SRF是否是miR-122的真正靶点。为此，用pIS0-3′-UTR-SRF（野生型）或pIS0-3'-UTR（Δ-miR-122）-SRF以及miR-122模拟或控制RNA转染的细胞检测荧光素酶活性(补充图S6B类). 因此，miR-122通过直接与SRF的3′-UTR相互作用调节荧光素酶活性。实时RT-PCR分析显示，表达miR-122的HepG2（65%）、Hep3B（63%）和SK-Hep-1（33%）细胞中SRF mRNA水平显著降低(图5A类). 异位表达miR-122后，HepG2和SK-Hep-1细胞中的SRF蛋白水平也分别降低了70%和45%(图5B类).

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图5。

SRF和Igf1R是miR-122的靶点。 A类转染（50 n）的肝癌细胞SRF mRNA水平米)通过实时RT-PCR测量对照RNA或模拟物（HepG2、Hep3B和SK-Hep-1），并将数据归一化为GAPDH。B类表达miR-122的肝癌细胞中SRF蛋白水平。用对照或miR-122模拟物转染的细胞提取物中SRF和GAPDH的蛋白质印迹分析（50米).C类,面板i、肝癌和匹配肝组织SRF的Western blot分析。用SRF和Ku-70抗体对全组织提取物进行免疫印迹分析。这个星号表示SRF上调的样本。第二组，SRF级别归一化为Ku-70级别。D类miR-122和SRF在原发性人肝癌FFP切片中的联合标记。将组织切片与生物素化和LNA修饰的反义miR-122探针杂交，该探针由碱性磷酸酶结合的抗坏血酸蛋白酶捕获，信号(蓝色)用硝基蓝四氮唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸进行开发。接下来，用抗SRF抗体对切片进行免疫组化，以快速红色染料作为染色原。E类，Igf1R RNA的表达(上部面板)和蛋白质(下部面板)在转染miR-122的细胞中（在HepG2中，面板i)或抗miR-122（在Huh-7中，面板ii)分别通过实时RT-PCR和Western blot分析。

然后我们评估了原发性人类肝癌样本中的SRF水平。Western blot分析显示，与匹配的肝组织相比，7例HCC组织中有6例的SRF水平增加(图5C类). 肝癌患者的SRF水平平均增加了～3倍。通过联合LNA-ISH（检测miR-122）和免疫组织化学（检测SRF）分析组织中SRF和miR-122的水平(图5D类). 正如所料，miR-122在良性肝脏中大量表达，但在HCC中未检测到(图5D类,左侧面板). 相反，SRF在HCC中的表达较高，但在肝脏中可以忽略不计(图5D类,右侧面板). 这些结果证明了原发性肝癌中miR-122及其靶SRF的相互调节。

miR-122及其靶点Igf1R在原发性肝癌中相互调节

Igf1R是一种对IGF-1和IGF-2具有高亲和力的受体酪氨酸激酶，可刺激细胞生长、存活、分化和增殖。通过IGF1R的信号调节癌细胞的启动、进展和转移以及对治疗的抵抗(40,41). 因为Igf1R含有一个保守的miR-122结合位点(补充图S7A类)，我们首先验证它是miR-122的靶点。Igf1R 3′-UTR控制的荧光素酶活性确实因miR-122的异位表达而降低(补充图S7B类). 实时RT-PCR分析表明，miR-122表达下调HepG2细胞中Igf1R表达45%(图5E类). 相反，Huh-7细胞中miR-122的缺失导致其水平增加4.25倍。Western blot分析证实，miR-122对HepG2和Huh-7细胞中的Igf1R蛋白水平进行了负调控(图5E类).

通过实时RT-PCR对Igf1R表达的评估显示，与配对对照相比，HCC显著增加(补充图S7C类). 相关分析显示显著(第页=0.01）原发组织中Igf1R和miR-122的负相关(第页= −0.584) (补充图S7D类). 这些数据证实了Igf1R在原发性人类肝癌中的上调，并暗示miR-122是参与其调控的因素之一。

SRF和Igf1R cDNA异位表达可逆转miR-122的生长抑制特性

为了证明miR-122功能，至少部分是通过这些靶点介导的，我们用缺乏各自3′-UTR的SRF或Igf1R表达载体转染表达miR-122的肝癌细胞。Western blot分析表明，与转染载体的细胞相比，SK-Hep-1细胞中这些蛋白的表达增加(图6A类). MTT分析显示Igf1R的过度表达(图6B类)和SRF(图6C类)逆转miR-122对生长和克隆存活的抑制作用(图6D类). 在HepG2细胞中也得到了类似的结果(补充图S8).

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图6。

缺少3′-UTR的SRF或Igf1R的联合表达可部分逆转miR-122的生长抑制特性。将表达miR-122或载体的SK-Hep-1细胞与SRF、Igf1R表达载体或相应的空载体共转染。A类48h后分离细胞提取物进行Western blot分析。B类和C类MTT分析（转染后72小时）。D类细胞克隆存活率（转染后2周）。

miR-122体外抑制内皮细胞的血管生成潜能

肿瘤微环境中的内皮细胞需要形成新血管或新生血管来维持肿瘤生长(42). 血管生成是一个涉及内皮细胞增殖、迁移和毛细血管形成的多步骤过程。由于miR-122抑制裸鼠肿瘤生长，我们研究它是否直接影响内皮细胞（HDMEC）的血管生成功能在体外在HDMEC细胞中转染miR-122或对照RNA导致miR-122水平显著升高，但其水平远低于肝脏(图7A类). 由于miR-122的表达，这些细胞的生长被抑制了60%(图7B类). 通过细胞向抓痕的横向迁移来测量miR-122表达细胞的运动受到了显著阻碍(补充图S9). 值得注意的是，即使在72小时后，表达miR-122的细胞的划痕仍保持开放状态。同样，由于miR-122表达，这些细胞在Matrigel中形成互连管的能力受到损害（减少57%）(图7C类). miR-122的所有三个靶点，即内皮细胞中的ADAM10、SRF和Igf1R均减少(图7D类)在异位表达miR-122时，其在miR-122介导的抑制这些细胞血管生成特性中的作用。

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图7。

miR-122抑制内皮细胞的生长和管形成在体外.转染50 n的HDMEC细胞米对miR-122或使用Lipofectamine 2000的对照RNA进行胰蛋白酶消化、计数，并在24小时后用于不同的分析。A类，转染后96小时细胞中miR-122水平。B类MTT法检测转染后48 h HDMEC细胞的增殖情况。C类, 1.6 × 10^三将添加有2%血清的内皮细胞基础培养基-2中的细胞添加到Matrigel涂层孔中，并在37°C下孵育16–18 h。孵育结束时，将培养基从Matrigel表面抽吸出来，用甲醇固定细胞，并用Diff-Quick溶液II染色。每个腔室在显微镜下拍照，使用NIS-Elements-BS（尼康）计算每个腔室中内皮细胞衍生管所占的总面积，并表示为血管生成评分。D类，用特异性抗体对细胞裂解物进行蛋白质印迹分析（转染后72小时）。ADAM10、SRF和Igf1R水平归一化为微管蛋白。