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大脑。2009年11月；132（11）：2922–2931。
2009年8月12日在线发布。 数字对象标识：10.1093/brain/awp214
预防性维修识别码：项目经理2768659
PMID：19674978

一种新的额颞叶退行性变亚型的FUS病理

曼纽拉·诺伊曼,1 罗莎雷达制造商,2 西格伦·罗贝尔,三 马特·贝克,2 Hans A.Kretzschmar先生,三和伊恩·R·A·麦肯齐通讯作者4
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

额颞叶痴呆（FTD）是一种具有异质性分子基础的临床综合征。与大多数FTD相关的神经病理学的特征是，交易反应DNA-结合蛋白与先生43 kDa（TDP-43）或tau蛋白。然而，我们最近描述了FTD患者的一个亚组，约占10%，具有不寻常的临床表型和病理学特征，其特征是额颞叶变性，神经内含物由未知的泛素化蛋白组成（非典型FTLD-U；aFTLD-U）。所有病例均为散发性，患有早发性FTD，在没有失语症或显著运动特征的情况下，行为和人格发生严重进展性改变。中的突变肉瘤融合（FUS）基因最近被确定为家族性肌萎缩侧索硬化症的病因，据报道这些病例的细胞内FUS蛋白异常积聚。由于公认的FTD和肌萎缩侧索硬化之间的临床、遗传和病理重叠，我们研究了FUS是否也可能是aFTLD-U的病理蛋白(n个=15），FUS免疫组化标记所有神经元内含物，并显示以前未被识别的胶质病理学。对死后aFTLD-U脑组织中提取的蛋白质进行免疫印迹分析表明，不溶性FUS水平增加。没有突变保险丝在我们的所有患者中都发现了该基因。这些发现表明，FUS是散发性FTD的一个重要亚组的病理蛋白，并强化了FTD与肌萎缩侧索硬化密切相关的概念。

关键词：额颞叶变性、额颞叶痴呆、FUS、融合性肉瘤、TLS、脂肪肉瘤转移

介绍

额颞叶痴呆（FTD）是一种临床综合征，其特征是行为、个性和/或语言的渐进性变化，并具有相对的记忆保存能力（Neary等人。,1998；麦肯等人。,2001). 与临床FTD相关的神经病理学是异质性的，共同特征是额叶和颞叶的相对选择性变性（额颞叶变性，FTLD）（Trojanowski和Dickson，2001；凯恩斯等人。,2007一). 与许多其他神经退行性疾病一样，大多数FTLD的病理也包括异常的细胞内蛋白聚集。该特征是最近发表的FTLD命名一致建议的基础，其中分类基于被认为是致病性或最具特征性的分子缺陷（麦肯齐等人。,2009). 大约一半的病例显示神经元和胶质细胞中存在过度磷酸化tau蛋白的积聚（FTLD-tau）。大多数τ阴性病例都有神经元内含物，最初是通过泛素（FTLD-U）免疫反应确定的（Jackson等人。,1996；约瑟夫斯等人。,2004；约翰逊等人。,2005；麦肯齐等人。,2006). 最近，交易反应（TAR）DNA-结合蛋白与M（M）第页43 kDa（TDP-43）被确定为FTLD-U（现在称为FTLD-TDP）和肌萎缩侧索硬化（ALS）（Arai）的病理蛋白等人。,2006；诺依曼等人。,2006). 这一发现提供了强有力的证据，证明FTD伴FTLD-TDP病理、ALS伴痴呆和经典ALS都是疾病临床病理谱的一部分。

虽然TDP-43最初被认为是所有FTLD-U和ALS（Arai）患者的病理蛋白等人。,2006；诺依曼等人。,2006；戴维森等人。,2007)随后的研究发现了一些重要的例外（凯恩斯等人。,2007b条；霍尔姆等人。,2007；麦肯齐等人。,2007；约瑟夫斯等人。,2008；皮卡赖宁等人。,2008). 在最近的两篇论文中，我们描述了一组散发性FTD和FTLD-U病理学为TDP-43阴性的患者，占我们各自FTLD-U系列的10%-20%（麦肯齐等人。,2008一；勒贝尔等人。,2008). 异常且高度一致的临床和病理表型提示我们，这些病例代表了一种特定的疾病实体，我们称之为“非典型”FTLD-U（aFTLD-U）。对该组的鉴定表明，至少还有一个额外的FTD相关蛋白尚未发现。

最近，两项研究发现编码肉瘤融合（FUS）蛋白质（也称为翻译成脂肪肉瘤，TLS），作为家族性ALS（FALS）6型的病因（Kwiatkowski等人。,2009；万斯等人。,2009). 这些研究报告称，在26个不相关的家族中总共发现了14种不同的突变（这些组合序列中约4%的FALS）。大多数是错义突变，影响外显子15中编码C末端的高度保守区域。除了一个由c.1551C>G突变（Kwiatkowski）引起的常染色体隐性遗传病家族外等人。,2009)，所有其他突变均产生常染色体显性ALS，尽管具有不完全外显率。在一项研究（Kwiatkowski）中筛选出的293例散发性ALS（SALS）病例中未发现突变等人。,2009). 临床表型为典型ALS，平均发病年龄46岁，平均病程33个月。没有相关的认知功能障碍。对四名患者的尸检病理进行了描述，包括上下运动神经元的变性。一项研究报告仅在单个受累个体（Kwiatkowski等人。,2009)另一组描述了低运动神经元中的FUS-ir营养不良神经突（DN）和球状神经元胞质内含物（NCI），但没有TDP-43病理学（Vance等人。,2009).体外两组的实验都表明，表达突变的细胞中的细胞质FUS定位增加，一项研究报告了不溶性FUS（Kwiatkowski等人。,2009).

这个保险丝该基因位于16号染色体，由15个外显子组成，编码526个氨基酸的蛋白质（Aman等人。,1996). C末端区域包含多个参与RNA-蛋白质相互作用的结构域，而N末端在转录激活中起作用（Prasad等人。,1994). FUS是一种普遍表达的蛋白质（Aman等人。,1996；安德森等人。,2008)与RNA结合（Crozat等人。,1993；津斯兹纳等人。,1997)和DNA（佩罗蒂等人。,1998)并参与包括细胞增殖在内的多种细胞过程（伯特兰等人。,1999)、DNA修复（Baechtell等人。,1999)、转录调节、RNA剪接（阳等人。,1998)以及RNA在细胞内隔间的运输（Zinszner等人。,1997). 在大多数细胞类型中，FUS存在于细胞核和细胞质中，但在神经元中，细胞核中的FUS比例更高，胶质细胞中的FUSO表达仅为细胞核（Andersson等人。,2008). FUS可能通过将mRNA（包括编码肌动蛋白相关蛋白的mRNA）运输到树突棘以响应突触刺激进行局部翻译而参与神经元可塑性和树突完整性的维持（Fujii等人。,2005一,b条). 相反，FUS缺陷的神经元显示出脊椎树状结构和形态减少（Fujii等人。,2005一). 染色体5′部分易位保险丝结果产生了几个与特定类型人类癌症相关的融合癌基因，包括粘液样脂肪肉瘤、尤因肉瘤和急性髓系白血病（Law等人。,2006). FUS基因敲除小鼠显示围产期死亡率（Hicks等人。,2000). 这个发现保险丝导致FALS的突变是该蛋白与神经退行性疾病之间的第一个关联。

ALS和FTD之间公认的临床、遗传和病理重叠，以及FUS和另一种ALS/FTD相关蛋白（TDP-43）之间的高度功能同源性（Lagier-Tourenne和Cleveland，2009)，导致我们推测FUS可能也是tau/TDP-43阴性FTLD的某些病例中的病理蛋白。在本研究中，我们探讨了FUS在aFTLD-U病例中的可能作用。

材料和方法

案例

我们之前两项研究中的所有15例aFTLD-U病例（麦肯齐等人。,2008年a；勒贝尔等人。,2008)进行了FUS病理学评估。这些病例先前被表征为具有对泛素和泛素-蛋白酶体系统相关的螯合体p62（p62）免疫反应的病理内含物，但对tau、TDP-43、神经元中间丝或α-突触核蛋白不免疫反应。神经控制病例包括FTLD-TDP[n个=12; 其中散发型1、散发型2、散发型3各2个，家族性粒蛋白基因(GRN）家族性含缬氨酸蛋白突变(VCP）与9p染色体相关的突变和家族性（凯恩斯等人。,2007b条); FTLD-tau公司[n个= 8; 包括皮克氏病（PiD）、进行性核上性麻痹（PSP）、皮质基底变性（CBD）和嗜银颗粒病（AGD）各2例]；阿尔茨海默病（AD；n个= 2); 帕金森病合并路易体痴呆(n个= 2); 多系统萎缩（MSA；n个=2），亨廷顿病（HD；n个=2）和ALS(n个= 6; 包括SALS、FALS和超氧化物歧化酶各两种(超氧化物歧化酶）1突变和FALSSOD1标准排除突变）。正常对照组织来自两名无神经疾病史的老年患者。

FUS抗体

我们测试了一些市售的抗FUS抗体，每种抗体都识别不同的表位。结果汇总于表1使用四种抗体中的三种进行免疫组织化学（IHC），显示了正常的生理染色模式，并标记了病理损伤。其中一个（Santa Cruz sc-47 711）仅适用于冰冻路段。另外两组在福尔马林固定石蜡包埋材料的切片上显示出类似的结果。来自Sigma-Aldrich的多克隆抗体用于所有随后的IHC。

表1

检测抗-FUS抗体

单位产品编号。类型表位（aa 1–526）石蜡切片IHC（稀释）冰冻切片IHC（稀释）免疫印迹
Bethyl实验室A300-302A型RP公司N端（aa 1–50）是的是的是的
    (1:200–500)    (1:5000–10 000)    （1:20 000）
Sigma-Aldrich公司HPA008784型RP公司中部地区（aa 86–213）是的未测试是的
    (1:25–500)    (1:500)
Bethyl实验室A300-292A客机RP公司中部地区（aa 200–250）不不是的
(1:2500)
圣克鲁斯生物技术sc-47711号文件毫米C端不是的是的
    (1:50–200)    (1:1000)

MM=小鼠单克隆抗体；RP=兔多克隆。

免疫组织化学

aFTLD-U病例先前已用抗泛素、p62、TDP-43、过度磷酸化tau、α-突触核蛋白、Aβ、α-内泌素、非磷酸化神经丝（NF）、磷酸化神经丝（pNF）和扩展的聚谷氨酰胺重复区的抗体进行免疫染色，如所述（Mackenzie等人。,2008一；勒贝尔等人。,2008). 在这些病例中，对额叶和颞叶新皮质、海马、基底神经节、中脑以及髓质或脊髓的切片进行了FUS IHC。在选定的切片上重复泛素、p62和TDP-43 IHC。对于对照组，用FUS IHC评估最大病理区域。

所有IHC均使用Ventana BenchMark®XT自动染色系统在5μm厚的福尔马林固定石蜡包埋组织切片上进行，并使用氨乙基卡比唑（AEC）进行开发。主要抗体采用识别的FUS（Sigma-Aldrich anti-FUS；1:25–1:200，在室温下初始过夜培养，微波抗原提取后）、泛素（DAKO anti-ubiquitin；1:500，微波抗原回收后）、p62（BD Transduction Laboratories p62 Lck配体；微波抗原检索后1:500）和TDP-43（ProteinTech Group anti-TARDBP；微波抗原检索之后1:1000）。根据正常生理染色的数量，很明显，抗FUS敏感性受组织固定程度的影响很大，而这仅通过抗原回收部分逆转。因此，在每种情况下调整一级抗体的稀释度（从1:25到1:200），以允许微弱的生理染色，从而确保敏感性（内部阳性对照），但不影响病理的可视化。

免疫荧光

使用小鼠单克隆抗泛素抗体（Chemicon 1510；1:20 000）和兔多克隆（RP）抗FUS抗体（Sigma-Aldrich抗FUS；1:25）对选定的aFTLD-U和FTLD-TDP病例进行双标记免疫荧光。二级抗体为Alexa Fluor 594结合抗兔和Alexa Fluor 488结合抗鼠（分子探针；1:500）。4′-6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）用于核复染。

生化分级和免疫印迹分析

来自aFTLD-U的新鲜冷冻死后额叶皮质组织(n个=6），FTLD-TDP(n个=6）和正常控制(n个=7）用于蛋白质的连续提取，缓冲液的浓度越来越严格，使用的是一种常用于tau（Zhukareva）连续提取的方案等人。,2002). 简单地说，通过重复均质和离心步骤（120 000×）以2 ml/g（v/w）提取灰质克高盐（HS）缓冲液（50 mM Tris–HCl，750 mM NaCl，10 mM NaF，5 mM EDTA，pH 7.4），高盐缓冲液中1%Triton-X 100（TX），放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液[50 mM Tris–HCl，150 mM NaCl，5 mM-EDTA，1%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）]和2%SDS缓冲液。为了防止携带，每个提取步骤执行两次。只分析第一个提取步骤的上清液，而丢弃第二个清洗步骤的上清。在70%甲酸（FA）中以0.5 ml/g（v/w）萃取2%-SDS不溶性颗粒。在SpeedVac系统中蒸发甲酸，将干燥的颗粒重新悬浮在样品缓冲液中，并用NaOH将pH调节至中性。在使用之前，将蛋白酶抑制剂添加到所有缓冲液中。对于免疫印迹分析，不同样品（10µl高盐缓冲液和TX，20µl RIPA和SDS，25µl甲酸）的等量组分通过7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore，Billerica，MA）。转移后，用含有5%奶粉的Tris缓冲盐水（TBS）封闭膜，并用抗FUS抗体进行探测（参见表1用于稀释）。用辣根过氧化物酶（HRP）结合的抗兔或抗鼠IgG（Jackson ImmunoResearch Europe，UK）检测一级抗体，并通过基于HRP的化学发光反应（Pierce，Rockford，IL）和化学发光成像仪Stella 3200（Raytest，Switzerland）观察信号。测量可溶性（HS和TX）和不溶性（SDS）组分中FUS带的强度，并计算比率。

分子遗传分析

对6例aFTLD-U患者和6例病理正常对照进行了分子遗传学分析，其中新鲜冷冻的小脑组织可用。

基因组DNA测序

基因组DNA（gDNA）是使用标准自动化协议和AutoGenprep 245T（马萨诸塞州霍利斯顿市Autogen）制备的，它被用作模板来扩增保险丝聚合酶链反应（PCR）。设计用于侧翼内含子区域的引物用于PCR和测序反应（引物序列可根据要求提供）。使用Ampure系统（马萨诸塞州贝弗利Agencourt Bioscience Corporation）纯化每个外显子（加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen）的20微升PCR产物，然后使用Big Dye化学法（加利福尼亚州福斯特市Applied Biosystems）在两个方向上进行测序。使用CleanSeq方法（马萨诸塞州贝弗利Agencourt生物科学公司）纯化测序产物，并在ABI3700上进行分析。

互补DNA分析

使用Trizol和Pure Link系统（加利福尼亚州卡尔斯巴德的Invitrogen）提取总RNA，并在2100生物分析仪（加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦科技公司）上评估其质量和数量。第一链合成是使用Superscript III系统（Invitrogen，Carlsbad，CA）进行的，以200 ng总RNA为模板和基因特异性引物，设计到3′非翻译区（UTR）保险丝（CTTGGGTGATCAGGAATTG）。将得到的互补DNA（cDNA）稀释为1:5，并使用以下引物对作为RT-PCR反应的模板（加利福尼亚州巴伦西亚的齐亚根）：

c.1F:CATGGCCTCAAAACGATTATAC和c.6:ATGGAGGATTGATCTGGC，

c.5F:GCAGAACCAGTACACAGC和c.10R:CTTCAGCTTGCCAGTTTC，

c.9F:CAATTGAGTCTGTGTGTAC和c.14R:CACACGAGATCATCCC

和c.12F:GTCCTAATCCCACCTGGAG和c.utrR:CTTGGGTCAGGAATTG。

RT-PCR反应在94°C下变性3分钟，然后在60-50°C触地（30〃、30〃和45〃）下循环35个循环。RT-PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行可视化，并在两个方向上进行测序。

mRNA表达分析

将总RNA样本归一化为50 ng/μl，并使用200 ng作为模板，使用随机六聚体和寡核苷酸（dT）引物的1:1混合以及SuperScript III系统（Invitrogen，Carlsbad，CA）进行逆转录反应。基因表达检测由Applied Biosystems为保险丝（Hs00192029_m1），对于内源性对照GAPDH公司（Hs00266705_g1），YWHAZ公司（Hs00852925_sH）和HPRT1型（Hs99999909_m1）。使用TaqMan方法对ABI 7900进行实时PCR。反应包含用0.25μl引物/探针混合物和2.5μl TaqMan 2×Universal PCR Master mix扩增的1μl cDNA（加州福斯特市应用生物系统公司）。遵循制造商建议的循环参数；50°C持续2分钟，95°C持续10分钟，然后进行40次95°C循环15秒/60°C持续1分钟。所有样品一式三份，并归一化为GAPDH公司（或其他必要的控制）。使用SDS2.2.2软件分析羧基荧光素（FAM）荧光信号保险丝mRNA用ΔΔct法测定。

结果

临床总结

这些病例的详细临床描述已经发表（麦肯齐等人。,2008一；勒贝尔等人。,2008). 简而言之，这15名受试者包括9名女性和6名男性。发病的平均年龄为38岁（范围28-55年），平均病程为7年（范围4-15年）。所有患者均符合FTD的临床标准，个性和行为出现严重的渐进性变化。共同特征包括缺乏洞察力、判断力差、个人卫生状况下降、性欲亢进、注意力不集中、情绪迟钝、不恰当的人际行为和反社会行为，这些行为有时具有攻击性甚至犯罪性。语言仍然流畅，但最终表现出额叶功能障碍的特征，包括输出减少、抑制、刻板印象、坚持和最终的缄默。记忆只在病程后期受到影响。部分患者出现轻度帕金森综合征，但无临床证据表明锥体系统功能障碍。所有受试者都没有类似疾病的家族史。

神经病理学

一般调查结果

所有病例均表现为额叶、颞叶和尾状核对称性萎缩。额叶和颞叶新皮质、海马CA1区和亚室（海马硬化）、纹状体、苍白球和黑质存在慢性变性的组织学证据。如前所述，用银浸渍法（Bielschowsky或Gallyas染色）或IHC检测Aβ、tau、α-突触核蛋白、神经丝蛋白、α-internexin、TDP-43或扩展的聚谷氨酰胺重复序列（Mackenzie等人。,2008一，罗贝尔等人。,2008).

泛素/p62 IHC

所有病例的病理形态和解剖分布相似。在新皮质的中层和深层存在不同数量的定义明确的圆形、椭圆形或新月形神经元胞质内含物（NCI），偶尔也有短的营养不良性神经突起。类似的NCI在齿状颗粒细胞中为中度至大量，在海马锥体神经元和皮层下区域（包括纹状体、基底核、下丘脑、黑质和导水管周围灰质）中含量较少。尽管没有明显的神经元丢失或退行性改变，但在12例可供评估的病例中，有7例（58%）舌下核和/或脊髓的下运动神经元（LMN）存在ub-ir内含物。

除细胞质内含物外，泛素IHC在所有病例中都显示出一种独特类型的神经元核内内含物（NII）。这些纤维呈单根直的、弯曲的或扭曲的（蠕虫状）粗纤维。神经核内包涵体在齿状颗粒细胞中数量最多，但在新皮质和海马的锥体神经元以及一些皮层下区域也有发现。与神经元胞质内含物和营养不良性神经突不同，神经元核内内含物仅对泛素呈免疫反应性，而对p62无免疫反应性。

FUS IHC/免疫荧光

FUS的正常生理染色模式在正常对照组、神经对照组和aFTLD-U病例中同样显示良好。这包括神经元细胞核的强烈免疫反应，神经元细胞质的染色较弱但一致，胶质细胞核的反应更为多变(图1A） （安德森等人。,2008). 在细胞核和细胞质中，正常染色模式通常是弥漫的，但偶尔有小颗粒。

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对正常对照的死后脑组织切片进行FUS IHC(A类)和aFTLD-U受试者(B类–我). 所有病例（包括正常对照组）均显示出正常的生理染色模式，包括神经元细胞核的强烈免疫反应、神经元细胞质的较弱但一致的染色以及胶质细胞核的更多可变反应性(A类)神经控制和aFTLD-U受试者(B类). 在aFTLD-U患者中，内含物神经元（箭头所示）至少保留了一些正常的细胞核和细胞质染色(B类). 神经元细胞质内含物（NCI）在新皮层的中层和深层数量最多(C–E类)海马齿状颗粒细胞(F类)形态有圆形或椭圆形(D类和F类)到新月形(E类). 带有蠕形神经元核内包涵体（箭头）的齿状颗粒细胞也常有NCI(G公司). 下运动神经元中存在球状NCI(H（H）). 白质中存在火焰状胶质细胞质内含物(我). 调整一级抗体浓度以显示正常生理染色的FUS IHC(A类和B类)或优化病理性包涵体的可视化(C–我). 比例尺：A类和H（H），20微米；B类,E类,G公司和我，10微米；C，50微米；D类，15微米；F类，30微米。

在aFTLD-U、FUS IHC标记的神经元胞质内含物、神经元核内内含物和营养不良神经突的病例中，其形态、数量和解剖分布与泛素和p62抗体显示的相似(图1B–H）。某些类型的夹杂物在FUS IHC中更为明显。例如，在所有有髓质或脊髓组织的病例中，LMN中至少有一些大的球状FUS-ir神经元胞质内含物(图1H、，表2)相比之下，在该地区只有58%的ub-ir NCI病例（见上文）。FUS IHC还显示白质中有中等数量的卵圆形或火焰状胶质细胞质内含物，而泛素IHC不明显(图1一） ●●●●。平均而言，海马齿状筋膜的FUS病理负担最大，额叶和颞叶新皮质及纹状体中度，而其他皮质下区域的受累较少且程度较轻(表2). 双标记免疫荧光证实FUS和泛素在NCI和NII中的共定位(图2). 病理改变是用不同的FUS抗体免疫反应的，这些抗体分别识别蛋白质的N末端、中间区域和C末端(表1). 尽管染色强度的变化阻止了定量，但很明显，含有内含物（NCI或NII）的神经元仍然保留了至少一些正常的核质染色分布(图1B和​和22).

表2

aFTLD-U患者FUS免疫病理的解剖分布和严重程度

案例1案例2案例3案例4案例5案例6案例7案例8案例9案例10案例11案例12案例13案例14案例15
额颞叶新皮质++++++++++++++++++++++++++
海马+++不适用++++++++++++++++++++++++++++++
纹状体++++++++++++++++++不适用+不适用++
下部运动神经元+++++不适用++++不适用不适用++不适用+++不适用

分级：−=无；+=轻度；++=中等；++=严重；NA=不可用。

分数是所有FUS阳性病理学的总和，包括神经元胞质内含物、神经元核内内含物、胶质内含物和营养不良神经突。

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aFTLD-U和FTLD-TDP内含物的双标记免疫荧光。神经元细胞质内含物(A类)和神经元核内包涵体(B类和C)在aFTLD-U病例中，泛素（绿色）和FUS（红色）共定位。注意单个细胞中存在细胞质和核内包涵体（箭头所示）(C). 在有内含物和无内含物的神经元之间，FUS核染色强度无明显差异(A类). 与此形成鲜明对比的是，FTLD-TDP中的泛素阳性内含物未被抗FUS抗体染色(D类). 比例尺：A类和D类，50微米；B类，20µm；C，16.5µm。

除了一个例外，正常对照组或神经对照组均未显示任何FUS-ir病理学改变。具体地说，FUS IHC没有将老年斑、神经原纤维缠结、营养不良神经突、路易体、路易神经突、皮克体、膨胀神经元、ALS或FTLD中的神经元内含物标记为TDP病理(图2)或tau病或MSA中的胶质内含物。例外是亨廷顿氏病，其特征性NII为强FUS-ir，这是以前报道过的一项发现（Doi等人。,2008).

FUS免疫印迹分析

为了对FUS进行生化表征，从aFTLD-U、FTLD-TDP和对照组新鲜冷冻的死后脑组织中，使用含有越来越强的洗涤剂或酸的缓冲液依次提取蛋白质。然后用SDS-PAGE分离组分，并用抗FUS免疫印迹法进行分析。在aFTLD-U以及正常或神经控制组的可溶性高盐部分中，FUS始终被检测为主要的～73-kDa带(图3). 一些独立于诊断的病例，在可溶性TX部分也显示出弱条带。尽管SDS组分中FUS的含量在各组患者中有所不同，SDS组份富含更多不溶性蛋白质，但与正常和FTLD-TDP对照组相比，aFTLD-U病例倾向于显示更强的条带。在aFTLD-U组中，这种不溶性FUS的数量与IHC检测到的FUS病理学严重程度大致相关(表2). 通过对可溶性（HS和TX）和不溶性（SDS）组分中FUS谱带强度的定量分析以及不溶性与可溶性比率的计算，证实了FUS向aFTLD-U中不溶性组分的转移(图4). 尽管aFTLD-U组和对照组之间有一些重叠，但统计分析显示，与FTLD-TDP组（平均值=0.17±0.19）或对照组（平均数=0.21±0.22）相比，aFTLD-U组的比率明显更高（平均值=0.62±0.25）(对< 0.05; 学生的t吨-测试）。尽管FUS转变为aFTLD-U中的不溶性部分，但我们没有发现其他生化异常的证据；具体来说，使用四种抗体进行免疫印迹分析，每种抗体识别整个FUS蛋白的不同表位(表1)没有发现任何其他分子量较高或较低的蛋白质带。

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FUS的生化分析。依次从aFTLD-U、FTLD-TDP和对照（CO）大脑中提取蛋白质。通过7.5%SDS-PAGE分离高盐（泳道1）、Triton X-100（泳道2）、RIPA（泳道3）、2%SDS（泳道4）和甲酸（泳道5）级分，并用抗FUS抗体（RP A300-302A）进行免疫印迹。所有病例在可溶高盐组分（第1道）中均显示出较强的～73-kDa条带。尽管各组SDS-可溶性FUS（第4道）的数量各不相同，但aFTLD-U病例始终显示出一个强条带，该条带大于大多数对照组的条带。

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不溶性FUS与可溶性FUS的比率。分析了FUS在不溶物（SDS部分）和可溶性（高盐和Triton-X100部分）中的谱带强度，并计算了比值。比率被描述为一个方框和胡须斑点，显示值的范围，方框被中值细分为25%和75%的四分位数；圈子表示异常值，填充菱形代表平均值。尽管有一些重叠，但与FTLD-TDP和对照组相比，aFTLD-U组显示出明显更高的比率(对< 0.05).

FUS的分子遗传学分析

所有外显子和侧翼内含子区域的序列测定保险丝gDNA在所分析的6例aFTLD-U病例中未发现任何突变。此外，完成保险丝使用四个重叠片段进行cDNA分析，琼脂糖凝胶电泳没有显示异常转录。cDNA测序进一步排除了突变，但证实了第4外显子开始时已知的选择性剪接，导致两个转录本存在3 bp差异（莫罗霍西等人。,1998). 最后，保险丝与正常对照组相比，aFTLD-U病例中的mRNA表达没有显示出任何显著的表达增加或减少。

讨论

我们的研究结果为FUS作为一种重要的FTD新亚型的病理蛋白提供了有力支持。我们发现，在我们的aFTLD-U病例中，FUS与所有的ub-ir病理包涵体共同定位，包括营养不良的神经突起、神经元细胞质包涵体，也许最重要的是，这些病例最独特的特征是不寻常的蠕形NII。此外，FUS免疫组化显示胶质细胞中有其他包涵体，泛素染色未见。病理学用多种抗体证明，这些抗体识别FUS蛋白的不同表位，但没有针对通常与神经退行性疾病相关的其他蛋白（tau、α-突触核蛋白、TDP-43和中间丝蛋白）的抗体。FUS免疫反应对这组病例是特异性的，没有标记FTLD-tau、FTLD-TDP、ALS或我们检查的大多数其他神经退行性疾病的特征性病理损害。尽管我们发现的关于aFTLD-U中FUS的疾病相关生化修饰的唯一证据是溶解度的相对变化（与对照组相比，aFTLD-U中不溶性FUS与可溶性FUS的平均比率更高），这种非缺失现象表明，在这种情况下，FUS的积累是一种主要现象，而不是次要现象（即正常FUS并不是简单地被一些其他蛋白质组成的预先存在的内含物包裹）。最近对FUS在ALS亚群中起致病作用的认识支持了其引起FTD的可能性，FTD被认为是一种密切相关的神经退行性综合征。最后，我们的aFTLD-U受试者的高度不寻常和定型临床表型与这些代表不同实体的病例相一致，这些病例应该具有新颖和一致的病理学。根据最近提出的FTLD命名系统（麦肯齐等人。,2009)，这一新发现的病理学应被指定为FTLD-FUS。

鉴于FUS与另一种ALS/FTLD相关蛋白TDP-43具有高度的功能同源性，因此发现FUS也是FTD亚群中的病理蛋白可能并不奇怪（最近在拉盖尔-图伦和克利夫兰进行了综述，2009). TDP-43和FUS都是广泛表达的DNA/RNA-结合蛋白，参与基因表达、转录调节、RNA剪接、转运和翻译（Crozat等人。,1993；普拉萨德等人。,1994；阿曼等人。,1996；津斯兹纳等人。,1997；佩罗蒂等人。,1998；杨等人。,1998；安德森等人。,2008；布拉蒂等人。,2008). 在正常情况下，这两种蛋白质主要定位于细胞核，但在细胞核和细胞质之间穿梭（安德森等人。,2008；布拉蒂等人。,2008). 事实上，正是这种与TDP-43的功能同源性导致研究人员在筛选16号染色体上连接区域的候选基因的早期过程中以FUS为靶点（Kwiatkowski等人。,2009；万斯等人。,2009).

FUS和TDP-43之间的相似之处扩展到它们在疾病中的作用。到目前为止，这两个基因的突变主要与常染色体显性遗传型的经典ALS有关（Mackenzie等人。,2008b条；亚特科夫斯基等人。,2009；万斯等人。,2009). 这两个基因中的大多数致病性突变都是错义变化，影响C末端的高度保守位点。如ALS伴TDP-43病理（Arai等人。,2006；诺依曼等人。,2006；戴维森等人。,2007),保险丝突变导致蛋白质从细胞核异常重新分布到细胞质，在细胞质中形成不溶性聚集体（Kwiatkowski等人。,2009；万斯等人。,2009). 我们的发现进一步扩展了这些相似性，证明在FTLD中，这两种蛋白形成一系列常见的病理包涵体，包括NCI、NII、DN和胶质细胞质包涵体。然而，我们的结果也表明FUS和TDP-43的病理形态之间可能存在一些重要差异。含有FUS阳性包涵体的细胞至少保留了FUS染色的一些正常核质分布，这与含有TDP-43阳性包涵体内TDP-43的细胞核染色显著减少形成对比（Neumann等人。,2006). 我们的aFTLD-U病例的免疫印迹分析没有显示FUS和IHC异常处理的令人信服的证据，提示内含物含有全长蛋白。这些发现对FUS相关神经变性的发病机制具有重要意义，需要进行更详细的研究。

ALS和FTD与FTLD-U病理学密切相关的概念得到了TDP-43作为两组病理蛋白的鉴定（Arai等人。,2006；诺依曼等人。,2006；戴维森等人。,2007)现在发现FUS在同一系列疾病中起致病作用，这一发现进一步加强了这一点。尽管缺乏ALS的临床特征，但我们的aFTLD-U病例中LMN的持续参与进一步支持了这种重叠。提供的初步报告表明，ALS患者保险丝突变只有FUS病理，没有异常的TDP-43（Kwiatkowski等人。,2009；万斯等人。,2009); 我们的SALS神经控制病例有病理性TDP-43而非FUS，这一发现似乎ALS可能是由这两个高度相似但不同的分子途径的异常引起的。比较我们的FTLD-TDP和aFTLD-U病例的IHC结果表明，FTD具有相同的二分法致病性。

总之，我们提供证据表明FUS是一种新的FTD亚型的病理蛋白，具有独特的临床表型和神经病理学（FTLD-FUS）。FTLD-FUS的全谱尚待确定，需要进一步研究以检查FUS在其他类型的tau/TDP-43阴性FTLD中的可能作用，包括嗜碱性包涵体病、神经元中间丝包涵体疾病、遗传性痴呆伴脑白质营养不良和球体以及由以下因素引起的FTD-3CHMP2B公司突变。没有任何可识别的保险丝我们的aFTLD-U病例中的基因异常可能并不奇怪，因为所有病例似乎都是散发的。最近的一份报告称TARDBP公司可能导致FTD和ALS（Benajiba等人。,2009)表示保险丝也应被视为家族性FTD的候选基因，尤其是那些确诊为FUS病理的患者。

基金

加拿大卫生研究院（给I.M.的拨款编号74580）；太平洋阿尔茨海默病研究基金会（致I.M.和R.R.）；国家卫生研究所（拨款编号P50 AG16574至右.); Deutsche Forschungsgemeinschaft（SFB 596 to M.N.）；斯塔夫罗斯·尼亚乔斯基金会（致M.N.）；Synapsis基金会（致M.N.）；以及德国智囊团BrainNet（对英国）。

致谢

作者感谢Margaret Luk、Mareike Schroff、Mirjam Lutz、Richard Crook、Mariely deJesus和NiCole Finch提供的出色技术援助。

词汇表

缩写

aFTLD-U型由未知泛素化蛋白组成的神经元内含物引起的不典型额颞叶变性
肌萎缩性脊髓侧索硬化症肌萎缩侧索硬化
FALS公司家族性肌萎缩侧索硬化
英尺-天额颞叶痴呆
FTLD公司额颞叶变性
保险丝肉瘤融合
国际控股公司免疫组织化学
第62页泛素-蛋白酶体系统相关隔离体p62
SALS公司散发性肌萎缩侧索硬化
SDS公司十二烷基硫酸钠
TDP-43型反式反应DNA-结合蛋白先生43千Da。

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文章来自大脑由以下人员提供牛津大学出版社