核酸研究。2009年8月；37(15): 4965–4976.
PRMT5是细胞周期进展和p53抑癌功能所必需的
美国加利福尼亚大学戴维斯分校比较肿瘤学中心，加利福尼亚州戴维斯，95616
收到日期：2009年3月12日；2009年5月29日接受。
- 补充资料
【补充资料】
GUID:6C5858BA-9FF2-4A6D-ACD0-F0AB3A7EF367
指南：8D6AE079-6167-4DD0-8878-D23C8F61AE49
GUID:3BEB11C8-1B8A-492E-8713-36256BD0AAF7
摘要
蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）介导信号转导、转录调控和RNA加工蛋白质中甲基基团向精氨酸的转移。肿瘤抑制因子p53协调关键的细胞过程，包括细胞周期阻滞和DNA修复，以响应应激信号。翻译后修饰和与辅因子的相互作用对调节p53转录活性很重要。为了探讨PRMT是否调节p53功能，我们建立了多个细胞系，其中PRMT1、CARM1和PRMT5被诱导敲除。在这里，我们表明，PRMT5，而不是PRMT1或CARM1，对细胞增殖至关重要，而PRMT5缺陷触发G1细胞周期阻滞。此外，PRMT5是p53表达所必需的，并在DNA损伤时诱导p53靶向MDM2和p21。重要的是，我们确定了PRMT5敲除阻止p53蛋白合成。此外，我们发现PRMT5调节翻译起始因子eIF4E的表达，并且PRMT5敲除后介导的生长抑制独立于p53，但依赖于eIF4E。总之，我们发现精氨酸甲基转移酶PRMT5是调节eIF4E表达和p53翻译的主要促生存因子。
简介
抑癌基因p53是人类癌症中最常见的突变基因之一，p53种系突变是Li-Fraumen综合征患者肿瘤发病率高的原因(1). p53蛋白主要作为转录因子发挥作用，调节重要的细胞过程，如细胞增殖、细胞周期阻滞、DNA修复和细胞凋亡，以响应应激信号(2,3). 在非应激条件下，由于E3泛素连接酶MDM2（小鼠2分钟）的结合，p53在细胞中保持在低水平，导致p53泛素化，并被26S蛋白酶体快速降解(4). 为了应对DNA损伤和其他类型的细胞应激，传感器激酶被激活并介导p53的磷酸化，从而释放MDM2并促进p53的稳定(5). p53在不同靶基因启动子处的转录活性通过不同的p53翻译后修饰和与辅因子的相互作用进一步调节(6). P53是少数通过赖氨酸甲基化调节的非组蛋白之一。事实上，组蛋白赖氨酸甲基转移酶KMT5、KMT3C和KMT5A甲基化赖氨酸372、370和382位于p53 C末端(7–9). 赖氨酸甲基化根据甲基化位点增强或抑制p53转录活性(10). 此外，我们早期的研究表明，蛋白质甲基转移酶，特别是精氨酸甲基转移酶，在p53的差异靶基因调节中发挥作用(11).
精氨酸甲基化是一个重要的过程，参与基因表达、RNA代谢和蛋白质功能的调节(12,13). 蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMT）的使用S公司-腺苷-我-蛋氨酸作为甲基供体，催化多种蛋白质中甲基转移到精氨酸残基，包括组蛋白H3和H4、Stat1和hnRNP(12). 所有PRMT都催化单甲基化精氨酸的形成。此外，I型PRMT可以不对称地介导第二甲基转移到单甲基化精氨酸，而II型PRMT则可以对称地介导第一甲基转移(14). 迄今为止发现的11种PRMT中，大多数是I型PRMT，包括PRMT1和辅激活物相关精氨酸甲基转移酶-1（CARM1）。II类PRMT为PRMT5、PRMT7和PRMT9。PRMT2、PRMT10和PRMT11的甲基转移酶活性尚未确定。虽然所有的PRMT都包含一个保守的催化核心，但它们在N和C末端的长度和结构不同。最近的几项研究发现，组蛋白H3和H4通过PRMT甲基化在基因表达调控中起着重要作用。事实上，组蛋白H4R3和H3R17分别通过PRMT1和CARM1的甲基化与核受体介导的转录激活有关(13,15,16). 相反，组蛋白H3R8上的PRMT5甲基化是hSWI/SNF和NURD染色质重塑复合物的组成部分，它介导细胞周期调节器和肿瘤抑制基因的转录抑制，包括细胞周期蛋白E、ST7和NM23(17,18). 此外，PRMT5在雄激素受体驱动的转录中发挥作用，其方式与甲基转移酶活性无关(19). 迄今为止，尚不清楚PRMT是否与细胞对DNA损伤和缺氧等应激信号的反应有关。然而，据报道，p53与PRMT1和CARM1相互作用体内(20). CARM1和PRMT1被认为是p53的共同激活物，参与其靶基因GADD45周围组蛋白的甲基化。此外，最近报道PRMT5对p53寡聚结构域精氨酸的甲基化调节p53功能(21).
在本研究中，我们探讨了所选PRMT在p53抑癌功能中的作用。我们生成了多个稳定的MCF7细胞系，可诱导表达靶向PRMT1、CARM1或PRMT5的shRNA。我们发现，敲除PRMT5，而不是PRMT1或CARM1，可以诱导G1阻滞并抑制细胞增殖。重要的是，我们还发现，PRMT5敲除降低了p53的表达，阻止了p53在DNA损伤时的稳定，导致p53靶基因MDM2和p21的诱导减少。与此一致，PRMT5缺陷抑制突变型p53的表达。此外，我们发现PRMT5是p53蛋白合成所必需的。我们发现，PRMT5敲除抑制真核生物翻译起始因子4E（eIF4E）的表达，eIF4E是蛋白质翻译的重要介质，eIF4抑制负责抑制PRMT5的生长。因此，我们认为PRMT5是一种II类精氨酸甲基转移酶，通过调节eIF4E表达和p53翻译对细胞生存起着重要作用。
材料和方法
试剂
Nutlin-3购自Cayman Chemical Company。抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、抗p21、抗MDM2（SMP14）、抗p53和抗eIF4E抗体来自Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）。抗血凝素（HA）和抗MDM2（AB-2）分别来自Covance（加州伯克利）和EMB Biosciences（加州圣地亚哥）。抗-PRMT5和抗CARM1抗体来自Upstate（加利福尼亚州圣地亚哥）。抗-PRMT1来自Abcam（马萨诸塞州剑桥）。其他试剂来自Sigma（密苏里州圣路易斯）。
质粒
为了生成PRMT5 shRNA载体，寡核苷酸（5′-GAT CCC C交流CGC TAT TGC ACC TTG GAT TCA AGA GA公司T CCA AGG TGC AAT AGC GGTTTT TTG GAA A-3′和5′-AGC TTT TCC AAA AACCG CTA TTG CAC CTT GGATCT-CTT-GAA公司TCC AAG GTG CAA标签CGG TGG G-3′）旨在靶向PRMT5核苷酸1689-1707（以黑体显示）。为了产生CARM1 shRNA载体，寡核苷酸（5′-GAT CCC C交流GGC GAG ATC CAG CGG CAT TCA AGA GA公司T GCC GCT GGA TCT CGC CGTTTT TTG GAA A-3′和5′-AGC TTT TCC AAA AACGG CGA GAT CCA GCG GCATCT CTT GAA公司TGC CGC TGG ATC TCG CCG TGG G-3′）设计用于靶向CARM1核苷酸257-275（以粗体显示）。为了生成PRMT1 shRNA载体，寡核苷酸（5′-GAT CCC CAG CCC AAC GCT GAG GAC AT公司T TCA AGA GA公司一个TGT CCT CAG CGT TGG GCTTTT TTG GAA A-3′和5′-AGC TTT TCC AAA AA一只GCC-CAA-CGC-TGA-GGA猫TCT CTT GAA公司自动变速箱TCC TCA GCG TTG GGC TGG G-3′）被设计用于靶向PRMT1核苷酸110-128（以粗体显示）。将寡核苷酸退火并克隆到pTER中，pTER是PolIII启动子驱动的shRNA表达载体。结果质粒分别命名为pTER/PRMT5、pTER/CARM1和pTER/PRMT1。为了稳定表达针对p53的siRNA，如前所述使用pBabe-U6-sip53构建物(22). 为了暂时击倒PRMT5，Dharmacon（伊利诺伊州芝加哥）合成了双链RNA寡核苷酸（ACC GCU AUU GCA CCU UGG AdTdT）和干扰siRNA。
细胞培养
MCF7-pTR-7细胞系之前是通过用表达四环素阻遏物的pcDNA6载体转染MCF7细胞生成的(11). 为了产生可诱导表达PRMT5、CARM1和PRMT1 shRNAs的MCF7细胞系，用pTER/PRMT5、pTER/CARM1或pTER/PRMT1转染MCF7-pTR-7细胞，并用pBabe载体进行嘌呤霉素选择。为了建立稳定表达p53 shRNA和诱导表达PRMT5 shRNA的MCF7细胞系，用pBabe-U6-sip53和pTER/PRMT5转染MCF7-pTR-7细胞。通过western blot分析筛选单个克隆以诱导目标基因的敲除，并选择两个具有代表性的克隆进行后续研究。人结肠癌RKO和HCT116细胞、结肠癌SW480细胞和胶质母细胞瘤T98G细胞从ATCC（Manassas，VA）中获得，并在补充有8%胎牛血清（Hyclone，Logan，UT）的DMEM（Invitrogen，Carlsbad，CA）中培养。
蛋白质印迹分析
用PBS清洗细胞两次，用2×SDS样品缓冲液重新悬浮，在95°C下培养5分钟，并用于前面描述的western blot分析(23).
生长率和菌落形成测定
测定细胞生长率，1×104细胞接种在6孔板上。24小时后，对细胞进行治疗或四环素治疗。在指定的时间，使用Coulter细胞计数器（Coulter Corporation）收集细胞并进行计数。对于集落形成分析，细胞接种于1×103将6孔板中每孔的细胞在无四环素或有四环素的情况下培养10天。细胞用固定剂固定10分钟，然后用结晶紫染色20分钟，如前所述(24).
DNA直方图分析
对于DNA直方图分析，2×105细胞接种在直径为90mm的平板上，未经处理或用四环素处理4天。如前所述，收集细胞并用碘化丙啶染色，并用荧光激活细胞分选仪（FACS Calibur）检查(25).
[35S] 蛋氨酸标签
对于35S蛋白标记，0.5×106细胞接种在直径为90mm的平板上，未经处理或用四环素处理3天。经过2次洗涤并用无蛋氨酸DMEM（Invitrogen，Carlsbad，CA）培养3小时后，用[35S] 含蛋氨酸的DMEM（50µCi/ml）30分钟（快速35S蛋白分析标记混合物，Perkin Elmer）。如前所述，在0.5%NP-40裂解缓冲液中制备细胞提取物(24).
p53免疫沉淀和放射自显影
如前所述进行免疫沉淀(24). [35S] 在0.5%NP-40裂解缓冲液中制备蛋氨酸标记的细胞提取物，并用抗p53抗体或对照兔IgG在4℃下免疫沉淀p53过夜。用0.5%NP-40裂解缓冲液洗涤4次后，将免疫沉淀的p53用2×SDS样品缓冲液重悬，在95°C下孵育5分钟，并用于SDS PAGE。凝胶用固定液（10%醋酸和30%甲醇）固定，用Enhancer（Perkin Elmer，Boston，MA）培养30分钟，然后用蒸馏水冲洗三次。使用凝胶干燥器和真空泵（Biorad，Hercules，CA）干燥凝胶，并在−80°C下暴露于X射线胶片。
统计分析
除非另有说明，否则所有实验均为三次，数据表示为平均值±SD。两组比较采用双尾Student’st吨-测试。P（P）-计算值，值≤0.05被认为是显著的。
结果
敲除PRMT5抑制细胞增殖并诱导G1期阻滞
为了确定PRMT5精氨酸甲基转移酶缺陷是否对细胞增殖有影响，我们建立了MCF7细胞系，其中PRMT5被四环素诱导的shRNA表达系统诱导敲除。三个具有代表性的MCF7-PRMT5-KD细胞系，MCF7-MRMT5-KD-41/-62/-72，以及亲本MCF7-pTR-7细胞系，如图所示答：我们发现，在4天的PRMT5 shRNA诱导后，MCF7-PRMT5-KD-41细胞中PRMT5水平下降了55%，MCF7-PRMT5-KD-62/-72细胞中下降了35%。GAPDH水平被确定为负荷控制。接下来，我们进行了克隆形成分析，以确定PRMT5敲除对细胞增殖的长期影响(B） ●●●●。在亲代MCF7-pTR-7细胞系中，未发现四环素对MCF7细胞增殖有任何影响(B、 第一列）。相反，我们发现，敲除PRMT5 10天后，MCF7细胞增殖和形成集落的能力明显降低。为了进一步描述PRMT5敲除对细胞增殖的短期影响，我们对MCF7-pTR-7和MCF7-PRMT5-KD-41/-62/-72进行了8天的生长曲线(C） ●●●●。我们发现，在PRMT5敲除4天后，增殖细胞的数量显著减少。因此，为了表征PRMT5敲除细胞的细胞周期特征，对未经处理或四环素处理5天的MCF7-pTR-7和MCF7-PRMT5-KD-41/-62/-72细胞进行DNA直方图分析(D） ●●●●。我们发现，敲除PRMT5后G1期细胞数量显著增加，同时S期细胞数量减少。综上所述，这些数据表明PRMT5是细胞周期进展所必需的。
G1-S过渡需要PRMT5。(A类)生成可诱导表达PRMT5 shRNA的MCF7细胞系。在无（−）或有（+）四环素培养4天的MCF7-pTR-7和MCF7-PRMT5-KD-41/-62/-72细胞中检测PRMT5和GAPDH水平。(B)菌落形成需要PRMT5。MCF7-pTR-7和MCF7-PRMT5-KD-41/-62/-72细胞在四环素不存在或存在下培养10天。(C类)细胞增殖需要PRMT5。MCF7-pTR-7和MCF7-PRMT5-KD-41/-62/-72细胞在缺乏或存在四环素的情况下培养8天的生长率。绘制了三倍的平均±S.D.，数据代表了三个独立实验。P（P）-值≤0.005（诱导8天时的比较）。(D类)PRMT5缺乏导致G1期阻滞。未诱导或诱导MCF7-PRMT5-KD-41/-62/-72细胞敲低PRMT5达5天。通过FACS分析量化细胞周期各阶段的细胞百分比。显示了三个独立实验的平均±SEM。P（P）-值≤0.01（G1细胞数比较）。
为了确定外源性PRMT5的表达是否对MCF7细胞增殖有影响，我们建立了在四环素调节启动子控制下诱导表达N末端HA-标记的PRMT5细胞系（数据未显示）。接下来，我们进行了克隆形成分析，发现MCF7增殖和形成克隆的能力在10天内不受PRMT5表达的影响。这些结果表明，PRMT5精氨酸甲基转移酶的过度表达单独对细胞增殖没有影响。
敲除CARM1和PRMT1对细胞增殖无影响
为了确定CARM1或PRMT1缺陷是否对细胞增殖产生影响，我们在四环素诱导shRNA表达系统中生成了MCF7细胞系，可诱导表达靶向CARM1和PRMT1的shRNA。诱导性敲低CARM1（MCF7-CARM1-KD-12/-17）和PRMT1（MCF7-PRMT1-KD-6）的代表性细胞系，以及亲本MCF7-pTR-7细胞系如图所示答：我们发现，在诱导各自的shRNA 4天后，CARM1和PRMT1的水平下降了至少50%。接下来，我们进行了集落形成测定，以确定CARM1和PRMT1敲低对细胞增殖的长期影响(B） ●●●●。我们发现，敲除CARM1 10天后，MCF7-CARM1-KD-12/-17细胞的增殖能力仅略有减弱。同样，敲除PRMT1后，MCF7-PRMT1-KD-6细胞的增殖略有下降。我们进一步描述了这种效应，发现菌落总数不受CARM1或PRMT1基因敲除的影响。此外，我们发现CARM1或PRMT1基因敲除对小菌落数量（直径小于1mm）没有显著影响(C） ●●●●。
CARM1和PRMT1对细胞增殖不是必需的。(A类)生成可诱导表达CARM1或PRMT1 shRNA的MCF7细胞系。在无（−）或有（+）四环素培养4天的MCF7-pTR-7、MCF7-CARM1-KD-12/-17和MCF7-PRMT1-KD-6细胞中检测CARM1、PRMT1和Actin的水平。(B)菌落形成不需要CARM1或PRMT1。MCF7-pTR-7、MCF7-CARM1-KD-12/-17和MCF7-PRMT1-KD-6细胞在无四环素或有四环素的情况下培养10天。(C类)（B）中所示菌落数量的量化。在每个细胞系的三个代表性区域中计算直径<1 mm（左面板）或>1 mm（右面板）的菌落百分比。与亲代MCF7细胞相比，四环素增加或减少了菌落百分比，绘制了平均±SEM图。
由于CARM1和PRMT1属于I型PRMT，它们可能对细胞增殖有多余的影响。因此，我们生成了MCF7细胞系MCF7-CARM1-PRMT1-KD-5/-9，其中靶向CARM1和PRMT1的shRNA可诱导表达(图S1A). 为了确定两种PRMT的敲除是否对细胞增殖有影响，我们进行了克隆形成分析(图S1B). 我们发现，敲除CARM1和PRMT1后，细胞增殖仅略有下降。然而，CARM1和PRMT1缺陷对菌落数量没有显著影响(图S1C).
为了研究CARM1和PRMT1基因敲除是否对细胞增殖有短期影响，我们进行了9天的生长曲线分析（数据未显示）。我们发现CARM1和PRMT1的敲除对MCF7细胞的生长速度没有影响。总之，这些数据表明PRMT1和CARM1在细胞周期进展中不起重要作用。
野生型p53和突变型p53表达都需要PRMT5
为了研究PRMT5是否调节p53水平和肿瘤抑制功能，用四环素预处理MCF7-pTR-7和MCF7-PRMT5-KD-41 3天，然后用DNA损伤剂阿霉素治疗6、12或24小时。进行蛋白质印迹分析以测量PRMT5、p53、MDM2、p21和GAPDH的水平(A） 。我们发现，在MCF7-pTR-7细胞中，阿霉素在6小时处理后稳定了内源性p53，导致p53靶基因、MDM2和p21的诱导(A、 比较车道1和3）。阿霉素治疗12或24小时后，检测到对p53、MDM2和p21有更显著的影响(A、 将车道3与车道5和7进行比较）。此外，我们发现四环素对p53的稳定和阿霉素治疗后MDM2或p21的诱导没有影响(A、 将车道1、3、5和7分别与车道2、4、6和8进行比较）。正如预期的那样，PRMT5 shRNA诱导3天后，在PRMT5敲低的MCF7细胞中检测到PRMT5显著降低（≤45%）(A、 将9、11、13和15号车道分别与10、12、14和16号车道进行比较）。有趣的是，我们还发现，在阿霉素治疗后的前6小时，PRMT5敲除降低了（10%）p53的稳定性(A、 比较车道11和12）。此外，在阿霉素治疗12小时（减少30%）或24小时（减少32%）后，检测到对p53稳定的更显著影响(A、 将13号和15号车道分别与14号和16号车道进行比较）。重要的是，我们发现PRMT5敲低后p53稳定性降低，导致阿霉素治疗24小时后MDM2（减少40%）和p21（减少60%）的诱导减少。此外，我们发现，在用喜树碱（另一种DNA损伤剂）和Nutlin-3（MDM2抑制剂）治疗时，敲除PRMT5对p53稳定及其转录活性有类似的影响（数据未显示）。总之，我们的数据表明，精氨酸甲基转移酶PRMT5是p53及其转录活性在细胞应激反应中有效稳定所必需的。
PRMT5是多个细胞系中有效稳定p53和转录活性所必需的。(A类)从未诱导（−）或诱导（+）敲低PRMT5的MCF7-pTR-7和MCF7-PRMT5-KD-41细胞制备细胞提取物3天，然后未经处理或用0.35µM阿霉素处理6、12或24小时(B)用干扰对照siRNA（−）或PRMT5 siRNA（+）瞬时转染RKO和HCT116细胞3天，然后用0.35µM阿霉素处理12或24小时，制备细胞提取物(C类)用干扰对照siRNA（−）或PRMT5 siRNA（+）瞬时转染SW480和T98G细胞制备细胞提取物，为期3天。这些数据代表了两个独立的实验。western blot分析检测PRMT5、p53、MDM2、p21和GAPDH水平。
为了证实p53对PRMT5敲除的调控不是细胞类型特异性的，我们检测了在RKO和HCT116结肠癌细胞系中，PRMT5是否是p53稳定所必需的。用干扰阴性对照siRNA或PRMT5 siRNA瞬时转染这些细胞株3天，然后用阿霉素治疗12和24小时(B） ●●●●。正如预期的那样，在诱导PRMT5 siRNA 3天后，RKO和HCT116细胞中的PRMT5水平降低了40%（25%）(B、 将车道1和7分别与车道2和8进行比较）。有趣的是，我们发现，在阿霉素治疗12和24小时后，PRMT5敲除还降低了RKO（35%）和HCT116（25%）细胞中p53的稳定性(B、 将车道3、5、9和11分别与车道4、6、10和12进行比较）。总之，这些结果表明，在多个细胞系中，PRMT5是有效稳定p53以应对细胞应激所必需的。
突变型p53在人类肿瘤中经常高表达，并有助于肿瘤的发生。为了确定PRMT5缺陷是否对突变型p53表达产生影响，SW480结肠腺癌和T98G胶质母细胞瘤细胞系用打乱的siRNA或PRMT5 siRNA处理3天(C） ●●●●。正如预期的那样，在诱导PRMT5 siRNA后，SW480（34%）和T98G（28%）细胞中检测到PRMT5减少(C、 将车道1和3分别与车道2和4进行比较）。有趣的是，我们发现PRMT5敲除降低了SW480（38%）和T98G（30%）细胞中突变p53的表达。这些数据表明，与野生型p53类似，突变型p53的表达受PRMT5调控。
为了研究CARM1或PRMT1是否调节p53的稳定性和转录活性，用四环素预处理MCF7-CARM1-KD-12和MCF7-PRMT1-KD-6 3天，然后用阿霉素处理3、6或12小时(图S2A). 在这里，我们发现CARM1基因敲除对阿霉素治疗中p53稳定和MDM2诱导几乎没有影响(图S2A，将车道3、5和7与车道4、6和8进行比较）。我们还发现，在阿霉素治疗6小时后，PRMT1基因敲除仅略微降低了p53的稳定性(图S2A，比较车道13和14）。然而，与CARM1敲除类似，在阿霉素治疗12小时后，PRMT1敲除对p53稳定和MDM2诱导没有影响(图S2A，比较车道15和16）。
为了确定CARM1和PRMT1的敲除是否调节p53，用四环素预处理MCF7-CARM1-PRMT1-KD-5/-9 3天，然后用阿霉素治疗3、6或12小时(图S2B). 我们发现，CARM1和PRMT1的敲除对p53的稳定和阿霉素治疗中MDM2的诱导几乎没有影响(图S2B，将车道3、5、7、11、13和15分别与车道4、6、8、12、14和16进行比较）。综上所述，这些结果表明，CARM1和PRMT1在p53稳定性和DNA损伤反应中的转录活性中并不起主要作用。
PRMT5敲除以p53依赖性方式抑制细胞增殖
抑癌基因p53是细胞增殖的主要调节因子。因此，我们想确定p53是否在PRMT5敲低诱导的细胞增殖抑制中发挥作用。为此，产生了MCF7细胞系，其中p53被稳定敲除，PRMT5被诱导敲除。三种代表性细胞系，MCF7-PRMT5-KD/p53-KD-3/-11/-25，以及MCF7-PRMT5-KD-41细胞系，如图所示A.我们发现在所有三个MCF7-PRMT5-KD/p53-KD细胞系中，未检测到p53水平(A、 p53面板，比较车道1–2和车道3–8）。正如预期的那样，在四环素治疗3天后，检测到PRMT5显著下降（≤70%）(A、 将车道1、3、5和7分别与车道2、4、6和8进行比较）。此外，我们发现在MCF7-PRMT5-KD-41细胞系中，PRMT5敲除后，基础p53水平降低（20%）(A、 比较车道1和2）。接下来，我们进行了集落形成分析，以确定p53敲低对细胞增殖的长期影响(B） ●●●●。我们发现，在MCF7-PRMT5-KD/p53-KD细胞系中，p53敲除对PRMT5敲除诱导的细胞增殖抑制没有影响。接下来，我们对MCF7-PRMT5-KD-41和MCF7-MRMT5-KD/p53-KD-3/-11/-25进行了8天的生长曲线(C） ●●●●。我们发现，在MCF7-PRMT5-KD-41（减少48%）和MCF7-MRMT5-KD/p53-KD-3/-11/-25细胞系（减少<40%）中，PRMT5敲除后增殖细胞数量的减少相似。综上所述，这些数据表明，PRMT5敲除以p53依赖性的方式抑制细胞增殖。
敲除PRMT5以p53依赖性方式抑制细胞增殖。(A类)生成可诱导表达PRMT5 shRNA和稳定表达p53 shRNA的MCF7细胞系。在无（−）或有（+）四环素培养3天的MCF7-PRMT5-KD-41和MCF7-PMT5-KD/p53-KD-3/-11/-25细胞中检测PRMT5、p53和GAPDH的水平。(B)PRMT5是独立于p53的集落形成所必需的。MCF7-PRMT5-KD-41和MCF7-MRMT5-KD/p53-KD-3/-11/-25细胞在无四环素或有四环素的情况下培养10天。该数据代表了在三口井中进行的两个单独实验。(C类)PRMT5是独立于p53的细胞增殖所必需的。在没有或存在四环素的情况下培养8天的MCF7-PRMT5-KD-41和MCF7-MRMT5-KD/p53-KD-3/-11/-25细胞的生长率。绘制了三倍的平均±S.D.，数据代表了两个独立实验。P（P）-值≤0.01（诱导8天后的比较）。
PRMT5敲除抑制p53蛋白合成
为了确定PRMT5调节p53的机制，我们试图检测PRMT5敲除是否通过26S蛋白酶体促进p53降解。未诱导或诱导MCF7-PRMT5-KD-41细胞敲低PRMT5 3天，然后用蛋白酶体抑制剂MG132处理4或8小时(A） 。正如预期的那样，在诱导PRMT5 shRNA 3天后，PRMT5被有效地敲除(A、 将车道1、3和5分别与车道2、4和6进行比较）。有趣的是，我们发现用MG132治疗4小时（2.5倍）和8小时（3倍）后，p53稳定(A、 将车道1与车道3和5进行比较）。同样，经MG132处理4小时（2.7倍）和8小时（2.9倍）后，PRMT5敲除细胞中的p53水平增加(A、 将车道2与车道4和6进行比较）。然而，我们发现，在MG132缺失或存在的情况下，PRMT5的敲除可将p53降低到类似的程度(A、 将车道1、3和5分别与车道2、4和6进行比较）。为了检查PRMT5敲除是否调节p53降解以应对DNA损伤，未诱导或诱导敲除PRMT5 3天的MCF7-PRMT5-KD-41细胞用MG132治疗4或8小时，然后用阿霉素治疗6小时(B） ●●●●。在这里，我们发现，无论是否存在MG132，在阿霉素治疗后，PRMT5敲除都阻止了p53的稳定(B、 将车道7、9和11分别与车道8、10和12进行比较）。总之，我们的数据表明，PRMT5独立于26S蛋白酶体或通过其降解上游的机制调节p53降解。
PRMT5的敲除抑制p53蛋白的合成。(A类和B)MCF7-PRMT5-KD-41未诱导（−）或诱导（+）敲低PRMT5达3天，（A）未处理或用10µM MG132治疗4或8小时，（B）然后用阿霉素治疗6小时。制备细胞提取物，通过western blot分析测定PRMT5、p53和GAPDH的水平。(C类)MCF7-PRMT5-KD-41细胞在无四环素或有四环素的情况下培养3天，然后用阿霉素处理6小时，然后用环己酰亚胺（CHX）处理指定时间。western blot分析检测PRMT5、p53和GAPDH水平。(D类)PRMT5敲除抑制p53蛋白合成。MCF7-PRMT5-KD-41细胞未被诱导（−）或诱导（+）敲低PRMT5 3天，并且[35S] 蛋氨酸标记30分钟。用兔IgG或抗p53抗体免疫沉淀的全细胞提取物和细胞提取物通过SDS-PAGE和放射自显影术溶解。这些数据代表了三个独立的免疫沉淀实验。
接下来，为了评估PRMT5是否调节p53蛋白半衰期，用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺处理MCF7-PRMT5-KD-41细胞。如所示C、 用四环素预处理MCF7-PRMT5-KD-41细胞3天，然后用阿霉素处理6小时，然后用环己酰亚胺处理30分钟至210分钟。进行蛋白质印迹分析以测量PRMT5、p53和GAPDH的水平(C） ●●●●。正如预期的那样，我们显示，在对照细胞和PRMT5敲除细胞中，经放线菌酮治疗后，p53水平在所检测的时间过程中同样降低。例如，我们发现，在对照细胞和PRMT5敲除细胞中，用放线菌酮处理90分钟后，p53水平降低了35%(C、 p53面板，分别将车道1和9与车道4和12进行比较）。因此，p53的半衰期在PRMT5存在或不存在的情况下是相似的。然后，我们想确定PRMT5敲除后p53蛋白水平的变化是否与第53页转录水平。为了解决这个问题，对用四环素预处理3天的MCF7-PRMT5-KD-41细胞进行实时PCR实验，然后用阿霉素处理12或24小时（数据未显示）。我们发现，敲除PRMT5对第53页未经处理的细胞中的转录水平仅略有下降第53页用阿霉素处理12小时的细胞中的转录水平。因此，我们的数据表明，PRMT5调节其转录下游的p53。
为了确定PRMT5缺乏是否调节p53蛋白合成，我们进行了[35S] 对未经处理或四环素处理3天的MCF7-PRMT5-KD-41细胞进行蛋氨酸标记，并用免疫沉淀法测定p53水平。在这里，我们发现敲除PRMT5对整体没有影响[35S] 蛋氨酸标记蛋白质水平(D、 比较车道1和2）。然而，我们发现PRMT5敲除明显降低了新合成的p53蛋白的水平(D、 比较车道5和6）。总之，我们的数据表明，PRMT5调节p53翻译。
翻译起始因子4E表达需要PRMT5
为了进一步阐明PRMT5调节p53的机制，我们研究了PRMT5是否调节真核翻译起始因子4E（eIF4E）的表达。eIF4E是蛋白质合成的关键成分，因此在细胞增殖中发挥重要作用(26). eIF4E也是促进肿瘤发生的Akt-mTOR信号通路的介导者(27). 如所示A、 用四环素预处理MCF7-pTR-7和MCF7-PRMT5-KD-41细胞株3天，然后用阿霉素处理12或24小时。用Western blot分析测定PRMT5、eIF4E和GAPDH的水平(A） 。我们发现在MCF7-pTR-7细胞中，四环素对eIF4E的表达没有影响(A、 将车道1、3和5分别与车道2、4和6进行比较）。此外，阿霉素治疗对eIF4E的表达没有影响(A、 将车道1与车道3和5进行比较）。相反，我们发现在MCF7-PRMT5-KD-41中，PRMT5敲低诱导eIF4E显著降低（≥40%），无论阿霉素的存在如何(A、 将车道7、9和11分别与车道8、10和12进行比较）。综上所述，这些数据表明，PRMT5通过调节eIF4E表达在蛋白质翻译中发挥作用。
PRMT5敲除抑制翻译起始因子4E的表达。(A类)敲除PRMT5抑制eIF4E表达。从未诱导（−）或诱导（+）敲低PRMT5的MCF7-pTR-7和MCF7-PRMT5-KD-41细胞制备细胞提取物3天，然后未经处理或用0.35处理µM阿霉素治疗12或24小时后，通过western blot分析检测PRMT5、eIF4E和GAPDH水平。(B)用表达Myc-tagged eIF4E的pcDNA3或pcDNA3-载体转染MCF7-PRMT5-KD-41细胞24小时，然后用四环素治疗3天。通过western blot分析检测PRMT5、Myc-tagged eIF4E和GAPDH水平。(C类)eIF4E表达通过PRMT5敲除减弱对细胞增殖的抑制。收集细胞并用Coulter计数器计数。将三倍的平均±SEM绘制为与未处理细胞相比的细胞百分比。
为了进一步确定PRMT5调节eIF4E的重要性，我们评估了eIF4E是否在PRMT5短期调节细胞增殖中发挥作用。为此，用表达Myc-tagged eIF4E的pcDNA3载体或pcDNA3-载体转染MCF7-PRMT5-KD-41细胞24小时，然后用四环素治疗3天。Western blot分析用于测量PRMT5、Myc-tagged eIF4E和GAPDH的水平(B） ●●●●。正如预期的那样，PRMT5 shRNA诱导3天后，在PRMT5敲低的MCF7细胞中检测到PRMT5明显减少（减少≤45%）(B、 将车道1和3分别与车道2和4进行比较）。此外，在含有Myc-tagged eIF4E的pcDNA3载体转染的细胞中检测到外源性eIF4E表达(B、 将车道1和2分别与车道3和4进行比较）。接下来，测量增殖细胞的数量，我们发现在3天后，PRMT5的敲除使MCF7细胞的增殖降低了20%(C） ●●●●。此外，我们发现eIF4E的表达足以阻止PRMT5敲低对细胞增殖的短期抑制(C） ●●●●。综上所述，这些结果表明，PRMT5对细胞增殖的调节依赖于eIF4E。
讨论
PRMT参与了从基因表达到细胞信号传递的许多基本细胞过程。然而，需要进行研究来探索过去几年发现的许多新型PRMT的生理意义。此外，关于I类和II类PRMT之间潜在相互作用的信息很少。在这里，我们发现I类和Ⅱ类PRMT在细胞增殖中具有不同的作用。事实上，我们发现I类PRMT的两个成员CARM1和PRMT1是正常细胞增殖的最低要求。与此相一致，最近的一份报告显示，CARM1是雌激素受体α诱导细胞周期进展的特异性必需因子(28). 因此，很可能与CARM1类似，PRMT1在刺激细胞增殖以响应激素或其他信号分子方面发挥作用。
与CARM1和PRMT1相比，我们在这里显示了PRMT5，一种II类PRMT，是正常细胞增殖所必需的。事实上，我们发现PRMT5调节细胞周期从G1期到S期的转变。PRMT5是染色质重塑阻遏物复合体中的一种众所周知的辅阻遏因子(17,18). 事实上，发现PRMT5反义载体在NIH 3T3细胞中的组成性表达上调了许多基因，包括肿瘤抑制因子ST7和细胞周期调节因子cyclin E2(17). 然而，参与PRMT5介导的细胞增殖的特定靶基因仍有待确定。有趣的是，研究表明PRMT5水平升高与胃癌和淋巴癌相关，支持了PRMT5的致癌作用(29,30).
除了作为转录共抑制因子的作用外，PRMT5还参与许多其他细胞过程。事实上，PRMT5通过介导组蛋白H3R8的二甲基化和Brg1依赖性染色质重塑酶的募集来促进肌肉D诱导的肌肉分化(31). PRMT5以独立于其甲基转移酶活性的方式参与雄激素受体介导的转录激活(19). PRMT5也是20S甲基体的一种成分，并使Sm蛋白甲基化，Sm蛋白是snRNPs生物发生和RNA剪接的必需蛋白(32,33). 最近，Jansson等. (21)据报道，p53活性受PRMT5调节。作者表明，PRMT5在p53寡聚结构域中的选定精氨酸残基处甲基化p53。此外，发现PRMT5缺陷对p53有多重影响，如降低p53水平、核定位和寡聚活性。与此相一致，我们发现PRMT5缺陷降低了基础p53水平和p53转录活性，以应对DNA损伤。此外，我们发现PRMT5调节p53蛋白的合成。研究报道了核糖体蛋白如L26和核仁蛋白对p53 mRNA翻译的调节，尽管其机制尚不清楚(34–36). 在这里，我们发现PRMT5调节eIF4E的表达，eIF4E是蛋白质合成的mRNA-核糖体结合步骤中翻译机制的主要组成部分。事实上，eIF4E是一个强大的致癌基因，它以前被证明可以促进恶性转化在体外和人类癌症的形成(37,38). 事实上，PRMT5介导的细胞增殖依赖于eIF4E，但不依赖于p53。我们推测eIF4E在翻译水平上参与调节关键的促生长因子。然而，为了响应应激信号，PRMT5可能通过eIF4E调节，在提供足够的p53激活以诱导促生存机制（如细胞周期阻滞和DNA修复）以最终限制DNA损伤程度方面发挥重要作用。综上所述，我们的研究表明精氨酸甲基转移酶PRMT5是一种促生存因子，在非应激条件下调节细胞增殖，并介导有效的p53反应以保护细胞免受应激。
基金
美国国立卫生研究院(CA076069号;,CA081237号; 和CA102188号). 开放存取费资金：CA102188。
利益冲突声明。未声明。
参考文献
1Malkin D，Li FP，Strong LC，Fraumeni JF，Jr，Nelson CE，Kim DH，Kassel J，Gryka MA，Bischoff FZ，Tainsky MA等。乳腺癌、肉瘤和其他肿瘤家族综合征中的生殖系p53突变[见评论]科学。1990;250:1233–1238.[公共医学][谷歌学者] 2Harms K，Nozell S，Chen X.p53家族转录因子的共同和不同靶基因。细胞分子生命科学。2004;61:822–842. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 三。Helton ES，Chen X.DNA损伤反应的p53调节。细胞生物化学杂志。2007;100:883–896.[公共医学][谷歌学者] 4Honda R、Tanaka H、Yasuda H。癌蛋白MDM2是一种用于肿瘤抑制剂p53的泛素连接酶E3。FEBS信函。1997;420:25–27.[公共医学][谷歌学者] 5Chen J、Lin J、Levine AJ。mdm-2癌基因对p53抑癌基因转录功能的调节。分子医学。1995;1:142–152. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Bode AM，Dong Z.肿瘤发生中p53的翻译后修饰。Nat.Rev.癌症。2004;4:793–805.[公共医学][谷歌学者] 7Chuikov S、Kurash JK、Wilson JR、Xiao B、Justin N、Ivanov GS、McKinney K、Tempst P、Prives C、Gamblin SJ等。通过赖氨酸甲基化调节p53活性。自然。2004;432:353–360.[公共医学][谷歌学者] 8Huang J，Perez Burgos L，Placek BJ，Sengupta R，Richter M，Dorsey JA，Kubicek S，Opravil S，Jenuwein T，Berger SL。Smyd2介导的甲基化对p53活性的抑制。自然。2006;444:629–632.[公共医学][谷歌学者] 9Shi X，Kachirskaia I，Yamaguchi H，West LE，Wen H，Wang EW，Dutta S，Appella E，Gozani O。通过SET8-介导的赖氨酸382甲基化对p53功能的调节。分子细胞。2007;27：636–646。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Scoumanne A，Chen X.蛋白质甲基化：p53抑癌调节的新机制。历史。组织病理学。2008;23:1143–1149. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Scoumanne A，Chen X.上皮细胞转化序列2是Rho GTPases的鸟嘌呤核苷酸交换因子，通过蛋白甲基转移酶被p53抑制，是G1-S转换所必需的。癌症研究。2006;66:6271–6279.[公共医学][谷歌学者] 12Shen EC、Henry MF、Weiss VH、Valentini SR、Silver PA、Lee MS。精氨酸甲基化促进hnRNP蛋白的核输出。基因发育。1998;12:679–691. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13Chen D，Ma H，Hong H，Koh SS，Huang SM，Schurter BT，Aswad DW，Stallcup MR.通过蛋白甲基转移酶调节转录。科学。1999;284:2174–2177.[公共医学][谷歌学者] 14Bedford MT，Richard S.精氨酸甲基化是蛋白质功能的新兴调节器。分子细胞。2005;18:263–272.[公共医学][谷歌学者] 15Strahl BD、Briggs SD、Brame CJ、Caldwell JA、Koh SS、Ma H、Cook RG、Shabanowitz J、Hunt DF、Stallcup MR等。组蛋白H4在精氨酸3处的甲基化在体内发生，并由核受体辅活化子PRMT1介导。货币。生物。2001;11:996–1000.[公共医学][谷歌学者] 16Bauer UM、Daujat S、Nielsen SJ、Nightingale K、Kouzarides T。组蛋白H3精氨酸17的甲基化与基因激活有关。EMBO代表。2002;3:39–44. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Pal S、Vishwanath SN、Erdjument-Bromage H、Tempst P、Sif S。人类SWI/SNF-相关PRMT5甲基化组蛋白H3精氨酸8，并负调控ST7和NM23抑癌基因的表达。分子细胞生物学。2004;24:9630–9645. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Pal S、Yun R、Datta A、Lacomis L、Erdjument-Bromage H、Kumar J、Tempst P、Sif S.mSin3A/组蛋白脱乙酰酶2-和含有PRMT5-的Brg1复合物参与Myc靶基因cad的转录抑制。分子细胞生物学。2003;23:7475–7487. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Hosohata K，Li P，Hosohaat Y，Qin J，Roeder RG，Wang Z。一种参与雄激素受体依赖性转录的新型复合物的纯化和鉴定。分子细胞生物学。2003;23:7019–7029. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20An W、Kim J、Roeder RG。PRMT1、p300和CARM1在p53转录激活中的有序合作功能。单元格。2004;117:735–748.[公共医学][谷歌学者] 21Jansson M、Durant ST、Cho EC、Sheahan S、Edelmann M、Kessler B、La Thangue NB。精氨酸甲基化调节p53反应。自然细胞生物学。2008;10:1431–1439.[公共医学][谷歌学者] 22Liu G，Xia T，Chen X.p53中的激活域、富含脯氨酸的域和C末端基本域对于近端p21启动子上组蛋白的乙酰化以及与p300/CREB结合蛋白的相互作用是必要的。生物学杂志。化学。2003;278:17557–17565.[公共医学][谷歌学者] 23朱杰，周伟，姜杰，陈欣。介导细胞凋亡所必需的新型p53功能域的鉴定。生物学杂志。化学。1998;273:13030–13036.[公共医学][谷歌学者] 24Scoumanne A，Chen X.赖氨酸特异性去甲基酶1在p53依赖性和非依赖性的细胞增殖中都是必需的。生物学杂志。化学。2007;282:15471–15475.[公共医学][谷歌学者] 25Chen X、Ko LJ、Jayaraman L、Prives C.p53水平、功能域和DNA损伤决定了肿瘤细胞凋亡反应的程度。基因发育。1996;10:2438–2451.[公共医学][谷歌学者] 26Gingras AC、Raught B、Sonenberg N.eIF4启动因子：核糖体mRNA募集效应器和翻译调节器。每年。生物化学评论。1999;68:913–963.[公共医学][谷歌学者] 27Wendel HG、De Stanchina E、Fridman JS、Malina A、Ray S、Kogan S、Cordon-Cardo C、Pelletier J、Lowe SW。Akt和eIF4E在肿瘤发生和癌症治疗中的生存信号。自然。2004;428：332–337。[公共医学][谷歌学者] 28Frietze S、Lupien M、Silver PA、Brown M.CARM1通过上调E2F1调节雌激素刺激的乳腺癌生长。癌症研究。2008;68：301–306。[公共医学][谷歌学者] 29Kim JM、Sohn HY、Yoon SY、Oh JH、Yang JO、Kim JH、Song KS、Rho SM、Yoo HS、Kim YS等。使用包含胃癌细胞表达的新表达序列标签的cDNA微阵列鉴定胃癌相关基因。临床。癌症研究。2005;11:473–482.[公共医学][谷歌学者] 30Pal S、Baiocchi RA、Byrd JC、Grever MR、Jacob ST、Sif S。低水平的miR-92b/96诱导套细胞淋巴瘤中PRMT5翻译和H3R8/H4R3甲基化。EMBO J。2007;26:3558–3569. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Dacwag CS、Ohkawa Y、Pal S、Sif S、Imbalzano AN。精氨酸甲基转移酶Prmt5蛋白是肌发生所必需的，因为它促进ATP依赖的染色质重塑。分子细胞生物学。2007;27:384–394. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Friesen WJ、Paushkin S、Wyce A、Massenet S、Pesiridis GS、Van Duyne G、Rappsilber J、Mann M、Dreyfuss G。甲基体是一种含有JBP1和pICln的20S复合物，产生二甲基精氨酸修饰的Sm蛋白。分子细胞生物学。2001;21:8289–8300. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33Gonsalvez GB、Tian L、Ospina JK、Boisvert FM、Lamond AI、Matera AG。Sm类核糖核蛋白的生物生成需要两种不同的精氨酸甲基转移酶。《细胞生物学杂志》。2007;178:733–740. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 34Ofir-Rosenfeld Y、Boggs K、Michael D、Kastan MB、Oren M.Mdm2通过与核糖体蛋白L26的抑制性相互作用调节p53 mRNA的翻译。分子细胞。2008;32:180–189. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35Yang DQ，Halaby MJ，Zhang Y.鉴定p53 mRNA 5′非翻译区的内部核糖体进入位点为DNA损伤后其翻译的调控提供了一种新的机制。致癌物。2006;25:4613–4619.[公共医学][谷歌学者] 36Takagi M、Absalon MJ、McLure KG、Kastan MB。核糖体蛋白L26和核仁蛋白对DNA损伤后p53翻译和诱导的调节。单元格。2005;123:49–63.[公共医学][谷歌学者] 37Lazaris-Karatzas A，Montine KS，Sonenberg N.通过结合mRNA 5′cap的真核启动因子亚单位进行恶性转化。自然。1990;345:544–547.[公共医学][谷歌学者] 38Rhoads RE，Joshi-Barve S，Rinker-Schaeffer C.蛋白质合成起始因子4E的作用和调节机制：对mRNA辨别、细胞生长速率和肿瘤发生的影响。掠夺。核酸研究分子生物学。1993;46:183–219.[公共医学][谷歌学者] 
