简介
大多数人类癌症都有染色体含量异常，这种情况被称为非整倍体。然而，非整倍体发育背后的分子缺陷及其在肿瘤发生中的作用尚不清楚(Michor等人，2005年). 破译调控有丝分裂中染色体适当分离的分子网络对于理解导致染色体不稳定的机制及其在癌症发展中的作用至关重要。在酿酒酵母已知有100多个基因缺陷时会导致染色体不稳定(Kolodner等人，2002年;纳斯迈思，2002年). 这些基因在多种有丝分裂过程中发挥作用，包括染色体凝集、姐妹染色单体凝集、动粒组装、纺锤形成和纺锤组装检查点控制。预计会有更多的基因有助于人类染色体的稳定性，但迄今为止只发现了有限的基因(Michor等人，2005年).
最近，一些介导大分子通过核孔进出核的蛋白质与有丝分裂有关。其中一种蛋白质是RanBP2（或Nup358），这是一种非常大的多结构域核孔复合物蛋白质，在体外发挥SUMO E3连接酶活性(Matunis和Pickart，2005年;Pichler等人，2002年;Wu等人，1995年). 在间期细胞中，RanBP2定位于NPC的细胞质表面，与Ran GTPase激活蛋白1（RanGAP1）和SUMO E2-结合酶Ubc9形成稳定的亚复合物。只有与小的泛素样修饰物1（SUMO1）偶联的RanGAP1才能与RanBP2相互作用(Mahajan等人，1997年;Matunis等人，1996年). RanBP2的耗竭对蛋白质进入细胞核没有明显影响，但略微减少了mRNA和含NES蛋白质从细胞核的输出，这表明RanBP2起到了促进大分子输出的作用(Bernad等人，2004年;Hutten和Kehlenbach，2006年). 在有丝分裂开始时，当核膜（NE）解体和NPC解体时，RanBP2-RanGAP1-SUMO1-Ubc9亚复合物分散到有丝分裂细胞液中，并在自由纺锤体微管的正末端和纺锤体微管捕获的染色体动粒处积聚(Joseph等人，2002年,2004). RanBP2-RanGAP1-SUMO1-Ubc9的动粒靶向依赖于核输出受体Crm1(Arnaoutov等人，2005年). 在HeLa和RGG细胞中，缺失RanBP2会导致各种有丝分裂异常，包括中期染色体错位、几个动粒相关蛋白定位错误以及多极纺锤体的形成(Joseph等人，2004年;Salina等人，2003年).
哺乳动物RanBP2蛋白的关键生物学功能尚未阐明。此外，尽管RanBP2在体外具有SUMO E3连接酶活性，但RanBP2是否在体内起SUMO连接酶的作用尚不清楚。为了解决这些问题，我们绕过了跑步BP2无鼠标(Aslanukov等人，2006年)通过产生一系列突变小鼠，其中RanBP2的剂量以分级方式降低。我们在这里报告说，含有少量RanBP2的小鼠是活的，与野生型小鼠没有明显区别。我们发现，RanBP2的表达水平与染色体数目不稳定性之间存在负相关。与RanBP2功能不全相关的主要有丝分裂缺陷是后期染色质桥的形成，这是一种与后期Topo IIα介导的姐妹染色单体衰退受损有关的异常(Clarke等人，1993年). 我们发现，RanBP2结合并调节有丝分裂中Topo IIα的sumoylation和定位。我们进一步表明，在阈值水平以下表达RanBP2的小鼠容易自发和致癌诱导肿瘤发生。
结果
低剂量RanBP2突变小鼠的产生
我们创造了一系列小鼠，通过使用各种野生型组合，RanBP2的表达从正常到零逐步减少(跑步BP2+)，低形态(跑步BP2H（H）)和淘汰赛(跑步BP2−)等位基因。这个跑步BP2H（H）等位基因是通过将新霉素抗性盒插入跑步BP2同源重组基因(). 这个跑步BP2−等位基因是通过从跑步BP2H（H）通过Cre介导重组的等位基因(). 如前所述(Aslanukov等人，2006年),跑步BP2−/−小鼠在胚胎发生过程中死亡。死亡发生在发育第13.5天之前（数据未显示）。相反，跑步BP2−/小时和跑步BP2高/高小鼠存活，与跑步BP2+/−,跑步BP2+/H（H）、和跑步BP2+/+老鼠。小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）裂解物的Western blot分析显示跑步BP2+/H（H）,跑步BP2+/−,跑步BP2高/高、和跑步BP2−/小时细胞中分别含有约90%、44%、31%和26%的RanBP2蛋白水平跑步BP2+/+MEF公司(和S1).
RanBP2剂量分级减少小鼠的产生（A） RanBP2基因靶向策略示意图。的相关部分跑步BP2指示了位点、具有loxP的靶向载体（三角形）、亚形态和敲除等位基因、EcoRV限制性位点（E）和用于Southern印迹的探针。
（B） （左）Southern blot分析跑步BP2+/H（H）和跑步BP2+/+老鼠。（右）基于PCR-的RanBP2突变小鼠基因型分析。
（C） 小鼠MEF的Western blot分析跑步BP2使用抗RanBP2抗体的等位基因。肌动蛋白被用作加载控制。
跑步BP2−/小时细胞没有明显的运输相关缺陷
接下来，我们研究了核质转运在跑步BP2−/小时细胞。用寡核苷酸（dT）50-mer探针原位杂交显示，聚腺苷酸mRNA的细胞内分布在跑步BP2+/+和跑步BP2−/小时MEFs，表明体mRNA的核输出不受RanBP2表达降低的影响(图S2A). 此外，NLS介导的蛋白导入和NES介导蛋白导出在跑步BP2+/+和跑步BP2−/小时使用已建立的体内转运测定法测量的MEFs(图S2B-S2E). 总的来说，这些结果表明，将RanBP2蛋白水平降低到正常水平的四分之一左右对核质转运没有明显影响。
RanBP2可以在体外合成RanGAP1，但在体内是否如此尚不清楚(Pichler等人，2002年). RanBP2已被进一步提出用于保护SUMO1修饰的RanGAP1免受SUMO异肽酶（如SENP2）的去酰化作用(Zhang等人，2002年). 蛋白质印迹分析跑步BP2+/+和跑步BP2−/小时SUMO1的MEF裂解物表明，在RanBP2减少的细胞中，SUMO1-RanGAP1水平保持不变(图S2F). 其他SUMO1结合蛋白和SUMO2/3结合蛋白水平也是如此(图S2G)这表明SUMO E3连接酶RanBP2的亚态性不会影响MEF中SUMO修饰的全局模式。
低剂量RanBP2的小鼠和MEF发生严重非整倍体
为了确定RanBP2不足是否会导致成年小鼠的染色体不稳定，我们从跑步BP2+/+,跑步BP2+/H（H）,跑步BP2+/−,跑步BP2高/高、和跑步BP2−/小时5个月大的小鼠进行核型分析。染色体计数显示跑步BP2+/+和跑步BP2+/H（H）脾细胞为非整倍体(). 相反，来自跑步BP2+/−,跑步BP2高/高、和跑步BP2−/小时小鼠异倍体发生率分别为1%、5%和15%，表明RanBP2蛋白水平与该细胞类型的异倍体百分比呈负相关。此外，随着RanBP2蛋白表达的减少，异常染色体数目的范围显著扩大。非整倍体的程度也在MEF中测定，RanBP2的表达逐渐减少。如所示在第5代MEF中，非整倍体随着RanBP2表达水平的下降而增加。这些数据证明RanBP2是一种蛋白质，可以防止染色体错位和非整倍体细胞的积聚。
表1
RanBP2逐渐减少导致脾细胞和MEF中的非整倍体逐渐增多
| A类 | 小鼠年龄（n） | 检查有丝分裂图 | 非整倍体百分数（SD） | 具有指示染色体数的核型 |
|---|
| 小鼠基因型 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | 43 |
|---|
| 跑步BP2+/+ | 5个月（4） | 200 | 0（0） | | | | | | 200 | | | |
| 跑步BP2+/H（H） | 5个月（3） | 150 | 0（0） | | | | | | 150 | | | |
| 跑步BP2+/− | 5个月（3） | 150 | 1 (0) | | | | | 2 | 148 | | | |
| 跑步BP2小时/小时 | 5个月（4） | 200 | 5 (1) | | | | 1 | 6 | 190 | 2 | 1 | |
| 跑步BP2−/小时 | 5个月（4） | 200 | 15 (3) | 1 | 1 | 4 | 2 | 12 | 170 | 9 | 0 | 1 |
| B类 | 检查有丝分裂图 | 非整倍体百分数（SD） | 具有指示染色体数的核型 |
| 有丝分裂MEF基因型（n） | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | 43 |
| 跑步BP2+/+（3） | 150 | 9 (2) | | | 4 | 137 | 9 | | |
| 跑步BP2+/H（H）（3） | 150 | 11 (2) | | | 5 | 133 | 8 | 2 | 2 |
| 跑步BP2+/−（3） | 150 | 13 (2) | 4 | 0 | 三 | 131 | 10 | 0 | 2 |
| 跑步BP2高/高（3） | 150 | 26 (2) | 2 | 6 | 11 | 111 | 10 | 5 | 5 |
| 跑步BP2−/小时（3） | 150 | 33（2） | 三 | 7 | 8 | 100 | 18 | 10 | 4 |
RanBP2不足导致后期桥梁
为了确定在低RanBP2水平的细胞中观察到的非整倍体背后的染色体错位缺陷的性质跑步BP2突变MEF后用实时荧光显微镜观察。为了观察DNA，用表达YFP标记组蛋白2B的逆转录病毒转导MEF。我们发现9%的跑步BP2−/小时和跑步BP2高/高细胞不能从中期进展到后期，只有2%的细胞出现缺陷跑步BP2+/−,跑步BP2+/H（H）和野生型MEF（未显示数据）。属于跑步BP2−/小时和跑步BP2高/高能够进入后期的细胞，分别有30%和28%形成染色质桥(). 大多数细胞有一个或两个桥，而一小部分细胞有两个以上的桥（数据未显示）。这些桥在末期或胞质分裂期间溶解(). 染色质桥的百分比在跑步BP2+/−和跑步BP2+/小时后期（分别为16%和12%），但仍显著高于in跑步BP2+/+后期（7%）(). 此外，在跑步BP2−/小时和跑步BP2高/高MEF与跑步BP2+/+MEF公司(). 这些MEF中的滞后染色体略有增加，但没有达到统计显著性(). 综上所述，上述结果表明，在RanBP2-不足细胞中，后期桥形成是主要的染色体分离缺陷。
低水平RanBP2的细胞在后期形成染色体桥（A） 染色体动力学和分离跑步BP2+/+和跑步BP2−/小时通过时间扫描显微镜观察到表达H2B-YFP的MEF。显示了每个有丝分裂阶段的代表性图像。箭头标记染色质桥跑步BP2−/小时MEF公司。棒材=10μm。
（B） 高清晰度图像跑步BP2−/小时显示染色体分离缺陷的MEF。棒材=10μm。
（C） 通过所示基因型MEF的活细胞成像观察到的染色体分离缺陷的量化。n=从至少三个独立MEF系分析的有丝分裂细胞总数。误差条表示SEM，*p<0.05，与野生型细胞相比（卡方检验）。
为了检测染色质桥的形成是否导致结构染色体损伤，对跑步BP2−/小时和跑步BP2+/+MEF公司。尽管该分析证实了跑步BP2−/小时细胞染色体数目不稳定性增加，没有证据表明染色体臂断裂或融合增加(图S3A). 此外，还检测了不同RanBP2水平的脾细胞和MEF的Giemsa染色中期扩散是否存在结构染色体异常。再一次，没有证据表明染色体断裂或端到端融合增加跑步BP2突变细胞，尽管在跑步BP2高/高和跑步BP2−/小时脾细胞和MEF(图S3B–S3D). 这些数据表明，染色体桥的形成导致非整倍体，而没有广泛的结构染色体损伤。然而，不能排除结构损坏的MEF降低了生存能力并因此被忽视的可能性。
先前对HeLa细胞的研究表明，RNA干扰对RanBP2的耗竭会干扰有丝分裂纺锤体的形成，并在早期有丝分裂中将某些有丝分裂检查点蛋白加载到动粒上(Joseph等人，2004年;Salina等人，2003年). 然而，在RanBP2低形态MEF中未检测到此类有丝分裂缺陷(图S4).
有丝分裂中靶向内着丝粒的Topo IIα依赖于RanBP2
后期染色质桥的形成是细胞的一个显著特征，其中DNA解链受到Topo IIα突变或化学抑制的损害(Clarke等人，1993年). Topo IIα在S期和中期-后期转换中活跃，在那里它解开姐妹着丝粒，使其在后期分离(Bhat等人，1996年). 为了研究RanBP2亚纯MEF中非相桥的形成是否可能是由于Topo IIα不足所致，我们检测了各种非同步MEF培养物的裂解物跑步BP2Topo IIα表达的基因型。如所示Topo IIα表达水平与RanBP2状态无关。跑步BP2+/+和跑步BP2−/小时在有丝分裂过程中被诺卡唑阻断的MEF也含有类似数量的Topo IIα().
RanBP2在有丝分裂中与Topo IIα结合并在内着丝粒积累（A） 用Topo IIα抗体探测异步MEF裂解物的蛋白质印迹。Actin充当加载控件。
（B） 同步的蛋白质斑点跑步BP2+/+和跑步BP2−/小时MEF裂解物。通过血清饥饿在G0中同步MEF，然后在含血清培养基中释放指定时间。在细胞释放23小时后添加诺卡唑。在斑点中检测Topo IIα。肌动蛋白被用作负荷控制。
（C） Topo IIα在MEF中的免疫定位，在前中期具有不同水平的RanBP2。用ACA抗体观察着丝粒。DNA用Hoechst染色。着丝粒和内着丝粒区域的放大图像显示在插图中。棒材=10μm。
（D） Topo IIα内着丝粒与扩散定位的前中期定量。每个基因型共分析了75个前中期（每个基因型分析了三个独立的MEF系）。误差条表示SEM，*p<0.05，与野生型细胞相比（卡方检验）。
（E） 用RanBP2抗体进行免疫沉淀并分析Topo IIα共沉淀的有丝分裂（M）、G1或G2 HeLa提取物的免疫印迹。
（F） 有丝分裂提取物的免疫印迹跑步BP2+/+和跑步BP2−/小时用RanBP2抗体免疫沉淀MEF，并分析Topo IIα的共免疫沉淀。磷甾体H3（P-H3）信号表明用于免疫沉淀的裂解液中存在类似数量的有丝分裂细胞。
接下来，我们假设RanBP2缺乏可能通过干扰Topo IIα在有丝分裂染色体内着丝粒上的正确定位而导致后期桥的形成。为了测试这种可能性，跑步BP2+/+和跑步BP2−/小时MEF在前中期用有丝分裂驱动蛋白Eg5抑制剂monastrol阻止，并用抗Topo IIα和抗着丝粒抗体（ACA）进行免疫染色。我们发现Topo IIα大多数集中在内着丝粒跑步BP2+/+,跑步BP2+/H（H）、和跑步BP2+/−单元格(、和第5章). 相比之下，大多数跑步BP2高/高和跑步BP2−/小时MEF未能在内部着丝粒积累Topo IIα。这些结果表明，Topo IIα对有丝分裂染色体内着丝粒的正确靶向依赖于RanBP2，并表明RanBP2亚型细胞中后期桥的形成是由TopoⅡα定位错误引起的。
有丝分裂中RanBP2与Topo IIα结合
由于Topo IIα在有丝分裂中的定位依赖于RanBP2，我们怀疑这两种蛋白可能会形成复合物。为了研究这一点，从间期和有丝分裂HeLa细胞提取物中免疫沉淀RanBP2，并检测Topo IIα共沉淀。如所示约4%–5%的Topo IIα细胞池与来自有丝分裂提取物的RanBP2共免疫沉淀，而不是来自G1或G2提取物。在反向实验中，RanBP2与来自有丝分裂提取物的Topo IIα免疫沉淀，但同样不是来自间期提取物（数据未显示）。为了确定有丝分裂中RanBP2-Topo IIα复合物的丰度是否受到RanBP2不足的影响跑步BP2−/小时和跑步BP2+/+MEF与抗RanBP2抗体共同免疫沉淀。虽然Topo IIα与RanBP2共沉淀跑步BP2−/小时细胞提取物，共沉淀的蛋白质量跑步BP2+/+细胞提取物要大得多(). 这些数据表明，RanBP2和Topo IIα在有丝分裂中形成复合物，而RanBP2不足的细胞减少了这种复合物的数量。RanBP2在内着丝粒处与Topo IIα没有共定位（数据未显示）。然而，RanBP2和Topo IIα都存在于有丝分裂细胞液中，表明它们之间的相互作用发生在这个亚细胞室中。
RanBP2 SUMO E3连接酶结构域调节Topo IIα对内着丝粒的正确染色体分离和靶向
在酿酒酵母由E3连接酶Siz1p和Siz2p催化的拓扑异构酶II（Top2p）的SUMO修饰将蛋白质靶向有丝分裂染色体的着丝粒周围区域(Takahashi等人，2006年). 中的研究爪蟾鸡蛋提取物和人类细胞表明，Topo IIα在高等真核生物中也会发生酰化反应(Azuma等人，2003年,2005;Mao等人，2000年). 因为RanBP2是一种具有SUMO E3连接酶活性的核孔蛋白(Pichler等人，2002年)我们推测，这种活性可能是Topo IIα在内着丝粒积累和姐妹染色单体适当分离所必需的。为了验证这一假设，我们表达了流感血凝素（HA）表位标记的RanBP2（2553–2838），这是一个跨越RanBP2 SUMO E3连接酶结构域的33kDa片段(Pichler等人，2004年) ()，英寸跑步BP2−/小时MEF并测量了其校正同相桥形成和Topo IIα定位的能力。SUMO E3连接酶结构域的三个催化突变体，HA-RanBP2（2553-2838）L2651A、L2653A，HA-RanBP2（2553-2838）F2657A、F2658A和HA-RanBP2（2553-2838）L2651A、L2653A、F2657A、F2658ASUMO E3连接酶结构域两侧的两个区域HA-RanBP2（1950–2553）和HA-RanBP 2（2839–3224）也在跑步BP2−/小时单元格作为控件(). HA的Western blotting显示所有RanBP2片段的表达水平相似(图S6). 与我们之前的结果一致，28%的跑步BP2−/小时表达空载体的MEFs形成后期桥(). 同样高比例的后期桥梁出现在跑步BP2−/小时MEF表达RanBP2 SUMO E3连接酶结构域的催化突变体或侧翼区域。相比之下，只有11%跑步BP2−/小时表达全功能RanBP2 SUMO E3连接酶域（2553–2838）的MEF形成后期桥，这一百分比与跑步BP2+/+表达空载体的细胞。HA-RanBP2（2553-2838）的异位表达对通过western blotting测定的全球sumoylation模式没有明显影响（数据未显示）。重要的是，PIASy过度表达，这是Topo IIαsumoylation所需的SUMO E3连接酶爪蟾鸡蛋提取物(Azuma等人，2003年,2005)，未更正后接语桥的形成(和S6系列).
RanBP2 SUMO E3连接酶结构域在RanBP2不足细胞中的表达防止后期桥的形成和Topo IIα的定位错误（A） 用于校正实验的HA标记突变体RanBP2蛋白概述。
（B） 染色质桥的发生率跑步BP2−/小时MEF表达（A）或HA标记的PIASy中所示的蛋白质。每个基因型评估三个独立的MEF系（每个系约25-40个后期）。误差条表示SEM，*p<0.05与跑步BP2−/小时携带空表达载体的MEF（卡方检验）。
（C） monastrol处理后Topo IIα（绿色）的免疫定位跑步BP2−/小时MEF表达所示蛋白。用人ACA抗体（红色）观察着丝粒。棒材=10μm。
（D） 内着丝粒与弥漫Topo IIα定位的前中期定量。每个基因型共分析了75个前中期（每个基因型分析了三个独立的MEF系）。误差条表示SEM。图表图例如（B）所示*p<0.05与跑步BP2−/小时携带空表达载体的细胞（卡方检验）。
（E） 表达所示HA-RanBP2片段的MEF细胞有丝分裂提取物中HA免疫沉淀物的Western blot分析。在斑点中检测Topo IIα。
Topo IIα和着丝粒抗体的互补免疫染色实验表明，RanBP2 SUMO E3连接酶结构域在跑步BP2−/小时细胞大大提高了Topo IIα对有丝分裂染色体内着丝粒的靶向性(). 弥漫Topo IIα定位的细胞百分比在跑步BP2−/小时表达RanBP2（2553–2838）的细胞，而在跑步BP2−/小时表达空载体的细胞。当RanBP2 SUMO E3连接酶结构域或PIASy两侧的催化突变体或区域过度表达时，未观察到此类改善(). 这些数据共同确立了RanBP2 SUMO E3连接酶活性的特定要求，即在有丝分裂早期将Topo IIα蛋白靶向内着丝粒，以允许在后期发病之前对姐妹着丝粒进行去螺旋化。
为了研究SUMO E3连接酶结构域是否可以通过靶向Topo IIα蛋白发挥其纠正作用，我们确定了它是否在有丝分裂中与TopoⅡα形成复合物。为此，我们在跑步BP2+/+MEF并用有丝分裂提取物中的HA抗体沉淀。如所示，Topo IIα确实与这些提取物中的HA-RanBP2（2553-2838）共免疫沉淀。相反，Topo IIα未能与HA-RanBP2（1950-2553）和HA-RanBP 2（2839-3224）联合免疫沉淀。因此，RanBP2的SUMO E3连接酶结构域足以在体内与Topo IIα形成复合物。
RanBP2在体内外促进Topo IIα的Sumoylation
接下来，我们使用体外sumoylation分析来确定Topo IIα是否是RanBP2修饰SUMO的底物。我们将全长纯化的人Topo IIα与重组SUMO E1、Ubc9、His-HA-RanBP2（2553-2838）、SUMO1和ATP孵育1小时。然后通过免疫印迹分析TopoⅡα的sumoylation。如所示，Topo IIα被His-HA-RanBP2（2553-2838）有效地酰化。在缺乏His-HA-RanBP2（2553–2838）或ATP的情况下，或在催化突变体His-HA-RanBP2（2553–2838）的情况下，没有发生这种修饰L2651A、L2653A使用的是His-HA-RanBP2（2553-2838）。我们发现，当SUMO1被SUMO2或SUMO3取代时，His-HA-RanBP2（2553-2838）也能有效地对Topo IIα进行sumoylated(图S7A). 总的来说，这些数据表明Topo IIα是用于体外SUMO修饰的RanBP2底物。
有丝分裂中的RanBP2 Sumoylates Topo IIα（A） 通过RanBP2 E3连接酶结构域对Topo IIα进行体外酰化。在存在或不存在100 ng野生型（His-HA-RanBP2[2553-2838]）或突变型（His-HA-RanBP 2[2553–2838]）的情况下，对20纳克重组人Topo IIα进行SUMO1修饰测试L2651A、L2653A)RanBP2 SUMO E3连接酶结构域、110 ng E1、50 ng Ubc9、5μg SUMO1和1 mM ATP。样品在37°C下培养1小时，然后用Topo IIα抗体进行免疫印迹分析。
（B） RanBP2对Topo IIα的体内酰化。有丝分裂筛析物跑步BP2+/+和跑步BP2−/小时制备含有所示表达载体的MEF，并通过Topo IIα和HA的western blotting进行分析。使用P-H3和肌动蛋白抗体来验证所使用的裂解物中存在类似量的有丝分裂细胞和蛋白质。
（C） 生理条件下Topo IIα的RanBP2 sumoylation。有丝分裂筛析物由跑步BP2+/+和跑步BP2−/小时MEF和Topo IIα的western印迹分析。使用P-H3和肌动蛋白抗体来确保裂解液中含有类似数量的有丝分裂细胞和蛋白质。
（D） SUMO1-Topo IIα-EGFP在跑步BP2−/小时中期MEF。（左）表达SUMO1-Topo IIα-EGFP的前中期共聚焦图像。用ACA抗体免疫染色观察着丝粒。棒材=5μm。（右）前中期内着丝粒细胞定量与SUMO1-Topo IIα-EGFP扩散定位。两个独立的跑步BP2−/小时分析MEF线（每条线50个前中期）。误差条表示SEM，*p<0.05与未转染跑步BP2−/小时MEF（配对t检验）。未转染Topo IIα的定位跑步BP2−/小时MEF通过Topo IIα和着丝粒的免疫染色测定，如.
（E） 染色质桥在跑步BP2−/小时无或存在SUMO1-Topo IIα-EGFP的MEF。两个独立的跑步BP2−/小时分析MEF线（每条线50个前中期）。误差条表示SEM，*p<0.05与跑步BP2−/小时未转染MEF（配对t检验）。
（F） Topo IIα的免疫定位PIASy公司−/−中期MEF。（左）共焦图像PIASy公司−/−MEF免疫染色Topo IIα和着丝粒。棒材=5μm。（右）量化PIASy公司+/+和PIASy公司−/−Topo IIα内着丝粒与弥漫定位的前中期。分析了三条独立的MEF线（每条线约25-50个前中期）。误差条表示SEM。
（G） 染色质桥的发生率PIASy公司−/−通过活细胞成像检查MEF。三个独立的PIASy公司+/+和PIASy公司−/−对MEF品系进行分析（每品系约25–40个后期）。误差条表示SEM。
（H） 内源性Topo IIα的SumoylationPIASy公司−/−MEF公司。实验细节如（C）所示。
（一） 提出了RanBP2在姐妹染色体分离中的作用模型。在有丝分裂中，RanBP2（与Ubc9结合）与有丝分裂胞浆中的Topo IIα结合并酰化。这种修饰作为Topo IIα靶向内着丝粒的信号，其作用是将姐妹着丝粒十年化，从而允许后期姐妹染色体的适当分离。由于SUMO修饰的Topo IIα仅代表TopoⅡα总库的一小部分（图5C），因此可能只需要SUMO结合物将Topo二α初始靶向着丝粒，而不需要维持着丝粒定位。
如果RanBP2真的在有丝分裂中起到合成Topo IIα的作用，人们会认为有丝分裂跑步BP2−/小时MEFs具有降低的SUMO缀合的Topo IIα水平。为了测试这种情况是否属实，我们在跑步BP2+/+和跑步BP2−/小时MEF公司()，通过有丝分裂振荡收集有丝分裂细胞，并通过Topo IIα的western blotting分析从这些细胞制备的裂解液中是否存在SUMO结合的TopoⅡα。除了未经修改的Topo IIα外，跑步BP2+/+MEF具有较高分子量的SUMO1-共轭Topo IIα带(). 抗-HA免疫印迹法证实了上部带中存在HA-SUMO1。SUMO1-共轭Topo IIα在跑步BP2−/小时MEF公司。重要的是，HA-RanBP2（2553-2838）的表达，但HA-RanBP 2（2552-2838）没有表达L2651A、L2653A，能够在这些MEF中恢复Topo IIα的sumoylation。为了确定Topo IIαsumoylation在生理条件下是否受损跑步BP2+/+和跑步BP2−/小时用抗Topo IIα抗体分析MEF中是否存在SUMO-Topo IIα。如所示，SUMO修饰的Topo IIα在跑步BP2+/+裂解物，但不在跑步BP2−/小时裂解物。如预期，当跑步BP2+/+在不存在异肽酶抑制剂N-乙基马来酰亚胺（NEM；参见图S7B). RanBP2亚型导致有丝分裂过程中Topo IIα的sumoylation降低的观察结果表明，TopoⅡα是该细胞周期阶段RanBP2的体内底物。
为了进一步测试Topo IIα是否是有丝分裂中RanBP2 SUMO E3连接酶活性的相关靶点，我们表达了一个TopoⅡα结构，该结构编码一个非水解SUMO1，与TopoⅢα-EGFP线性N末端融合跑步BP2−/小时MEF并确定其恢复Topo IIα定位和有效分离这些细胞中姐妹染色单体的能力。SUMO1-Topo IIα-EGFP融合蛋白在有丝分裂中确实高效靶向RanBP2低形态MEF的内着丝粒()并导致这些细胞中ana-phase-bridge的形成显著减少(). 这些数据支持这样的观点，即RanBP2低形态细胞中的有丝分裂缺陷是由于Topo IIα的SUMO修饰受损所致。
年PIASy耗竭爪蟾鸡蛋提取物或HeLa细胞已被证明能抑制Topo IIα靶向内着丝粒并阻断染色体分离(Azuma等人，2003年,2005;Diaz-Martinez等人，2006年)，表明RanBP2和PIASy E3连接酶在有丝分裂中可能具有重叠的功能。为了研究这一点，我们分析了Topo IIα在来源于PIASy公司−/−小鼠(Roth等人，2004年). 如所示，PIASy缺失对有丝分裂中Topo IIα靶向内着丝粒没有影响。独立生成的MEFPIASy公司−/−小鼠菌株产生了相同的结果(Wong等人，2004年)（未显示数据）。此外，在PIASy公司−/−MEF公司(和第8节). 有丝分裂裂解物的Western blot分析PIASy公司+/+和PIASy公司−/−Topo IIα的MEF显示，TopoⅡα的SUMO修饰未受到PIASy公司(). 这些数据表明，至少在MEF中，RanBP2而不是PIASy调节了Topo IIα在内部着丝粒的积累和适当的染色体分离。
RanBP2不足的小鼠易患致癌和自发性肿瘤
由于RanBP2不足会导致染色体数目不稳定，这是一种与癌症发展相关的疾病，我们试图确定RanBP2表达降低的小鼠是否容易发生肿瘤。为此，我们对7,12-二甲基苯并[a]蒽（DMBA）进行了肿瘤生物检测，DMBA是一种致癌物，当应用于皮肤时，野生型小鼠容易患上肺癌、皮肤肿瘤和胸腺淋巴瘤(Serrano等人，1996年). 来自的瞳孔跑步BP2高/高×跑步BP2−/小时和跑步BP2+/−×跑步BP2+/H（H）在出生后第5天，将50μl 0.5%DMBA单次涂抹于交叉组的背部表面。然后在5个月的时间内监测治疗动物的显性肿瘤发展。年，皮肤肿瘤的发病率显著增加跑步BP2高/高和跑步BP2−/小时小鼠与跑步BP2+/+,跑步BP2+/H（H）、和跑步BP2+/−小鼠(). 百分之七十七跑步BP2−/小时和60%跑步BP2高/高相比之下，31%的小鼠出现了皮肤肿瘤跑步BP2+/−，24%跑步BP2+/H（H）和13%的野生型小鼠。此外，皮肤肿瘤形成的潜伏期在跑步BP2小时/小时和跑步BP2−/小时老鼠比在跑步BP2+/+,跑步BP2+/H（H）、和跑步BP2+/−小鼠(). 与相比跑步BP2+/+小鼠的皮肤肿瘤负担增加了16倍和23倍跑步BP2高/高和跑步BP2−/小时分别是小鼠(). 在跑步BP2+/−和跑步BP2+/H（H）小鼠的这种增长只有3倍。在5个月大时，将动物处死，并对其内脏进行肿瘤筛查。58%的患者发现肺部肿瘤跑步BP2+/+小鼠(). 观察到肺肿瘤发生率略有增加跑步BP2+/−和跑步BP2+/H（H）小鼠，但没有统计学意义。相比之下，肺癌发病率的增加在跑步BP2高/高和跑步BP2−/小时动物，95%跑步BP2高/高和100%跑步BP2−/小时这种肿瘤类型的动物。同样，肺肿瘤负担跑步BP2高/高和跑步BP2−/小时小鼠比跑步BP2+/−,跑步BP2+/H（H）、和跑步BP2+/+老鼠，带跑步BP2高/高和跑步BP2−/小时与其他基因型的3个或更少的肿瘤相比，每只小鼠平均发育17个和14个肿瘤().
RanBP2抑制自发和DMBA诱导的肿瘤发生（A） DMBA治疗的皮肤肿瘤的外观（顶部）和组织学（底部）跑步BP2−/小时鼠标。
（B） DMBA处理的指定基因型小鼠的皮肤肿瘤发生率*与野生型小鼠相比，p<0.05（对数秩检验）。
（C） 指定基因型DMBA处理小鼠的皮肤肿瘤负担。误差条显示SEM，*p<0.05，与野生型小鼠相比（Mann-Whitney试验）。
（D） DMBA治疗的肺肿瘤的大体外观（顶部）和组织学（底部）跑步BP2−/小时鼠标。
（E） 指定基因型DMBA处理小鼠的肺癌发病率。误差条显示SEM，*p<0.05，与野生型小鼠相比（齐方检验）。
（F） 指定基因型的DMBA处理小鼠的肺部肿瘤负担。误差条显示SEM，*p<0.05，与野生型小鼠相比（Mann-Whitney试验）。
（G） 无瘤生存期跑步BP2+/+,跑步BP2高/高、和跑步BP2−/小时老鼠*与野生型小鼠相比，p<0.01（对数秩检验）。
（H） 不同RanBP2基因型小鼠的肿瘤谱。
（I） 代表性自发性肿瘤的大体图像和组织学分析跑步BP2−/小时老鼠。
（J） 原发性肿瘤的染色体计数跑步BP2高/高和跑步BP2−/小时老鼠。
此外，为了确定RanBP2不足是否促进自发肿瘤发生跑步BP2+/+,跑步BP2高/高、和跑步BP2−/小时建立小鼠模型，每两周监测一次，观察其是否有明显的肿瘤或健康不良症状，持续时间长达2年。处死死亡动物并进行肿瘤筛查。收集肿瘤并用石蜡包埋进行组织病理学检查。跑步BP2−/小时和跑步BP2高/高小鼠肿瘤的发生率增加，潜伏期短于跑步BP2+/+小鼠(). 肺腺癌是跑步BP2−/小时和跑步BP2高/高小鼠(). 在这些小鼠中，其他常见的肿瘤类型是肝细胞癌和肉瘤。染色体计数和使用第4、7、9和12号染色体探针的间期荧光原位杂交（FISH）表明，所有三种类型的肿瘤始终表现出严重的非整倍体(和第9部分). 因此，当RanBP2表达降至临界阈值水平以下时，小鼠容易发生自发和致癌诱导的肿瘤发生。此外，这些研究确定RanBP2是一种具有肿瘤抑制活性的蛋白质，并揭示了非整倍体与肿瘤发生之间的相关性。
讨论
RanBP2与核质转运和有丝分裂有关，在核穿孔蛋白中是唯一的，因为它是SUMO E3连接酶。然而，RanBP2的关键生物学功能及其连接酶活性的体内靶点尚不清楚。由于大多数功能丧失突变严重破坏早期胚胎发育，导致胚胎死亡，这一事实阻碍了对哺乳动物核孔蛋白生理功能的理解。解决这个问题的一个方法是研究低形态突变小鼠。使用这种方法，我们确定了RanBP2在维持染色体数目稳定性和抑制肿瘤发生方面的要求。观察到由RanBP2亚型引起的有丝分裂表型使人联想到Topo IIα抑制，发现RanBP2对染色体分离保真度的调节至少部分是通过TopoⅡα在有丝分裂中的sumoylation介导的。
RanBP2 Sumoylates Topo IIα介导姐妹染色体分离
Siz1p和Siz2p是在芽殖酵母中提供主要SUMO（Smt3p）E3连接酶活性的两种蛋白质，在有丝分裂中对Top2p进行SUMO修饰(Takahashi等人，2006年). 这种修饰似乎是Top2p靶向有丝分裂染色体着丝粒周围区域的信号。本文报道的七个观察结果表明，在哺乳动物中，RanBP2催化有丝分裂中Topo IIα的SUMO修饰，将该蛋白引导至内着丝粒，以便在后期开始之前进行准确的染色体分离(). 首先，Topo IIα的催化抑制导致DNA不完全十合导致后期染色质桥的形成(Clarke等人，1993年). Ana期桥的形成是RanBP2低形态细胞的主要表型。第二，RanBP2亚型细胞在有丝分裂染色体的内着丝粒处不能大量积累Topo IIα。第三，RanBP2亚型细胞中RanBP2 SUMO E3连接酶结构域的异位表达本身足以恢复Topo IIα在内部着丝粒的正确定位，并防止后期桥的形成。这些纠正效果需要SUMO偶联，因为在表达RanBP2 E3连接酶结构域催化突变体的RanBP2亚型细胞中没有观察到它们。与Topo IIα不同，RanBP2 SUMO E3连接酶结构域和全长RanBP2不集中于有丝分裂染色体的内着丝粒，这表明TopoⅡα在有丝分裂细胞溶质中被RanBP2聚合，并从那里转位到复制染色体的内着丝粒，而没有RanBP2(). 第四，在有丝分裂中，RanBP2与Topo IIα形成复合物。重要的是，在RanBP2亚型细胞中，RanBP2-Topo IIα复合物的丰度显著降低。第五，RanBP2 SUMO E3连接酶结构域足以与Topo IIα结合，在使用重组蛋白的体外检测中有效催化TopoⅡα的SUMO偶联。我们表明，在本试验中，Topo IIα可以被所有三种SUMO物种修饰。第六，RanBP2亚型细胞的SUMO修饰Topo IIα水平明显低于表达完整RanBP2补体的细胞。此外，RanBP2亚型细胞中RanBP2 SUMO E3连接酶结构域的异位表达足以在有丝分裂中恢复Topo IIα的SUMO结合。第七，外源性表达的SUMO1-Topo IIα融合蛋白纠正了RanBP2低形态MEF中TopoⅡα定位错误和后期桥形成。由于催化活性SUMO E3连接酶结构域在这些细胞中的表达具有类似的纠正作用，因此可以合理地得出结论，Topo IIα是有丝分裂中RanBP2的相关底物。
以前的研究爪蟾鸡蛋提取物已表明PIASy参与Topo IIα的酰化反应(Azuma等人，2003年,2005). 结合这些提取物中PIASy缺失导致中期停滞的观察结果，推测Topo IIα的sumoylation对有丝分裂中姐妹染色单体的分离至关重要。观察到siRNA-介导的HeLa细胞PIASy缺失干扰了Topo IIα的靶向性并阻断了重复染色体的分离，进一步支持了这一观点(Diaz-Martinez等人，2006年). 然而，在这里我们证明，Topo IIαsumoylation、TopoⅡα在内着丝粒的积累以及姐妹染色体的适当分离在PIASy公司−/−MEF公司。与此一致，PIASy公司−/−小鼠是活的、可繁殖的，并且没有任何显性表型(Roth等人，2004年;Wong等人，2004年). 此外，在RanBP2亚型MEF中发现PIASy过度表达无法纠正Topo IIα定位错误和染色体分离错误。一种解释是，RanBP2和PIASy在Topo IIαsumoylation中的作用取决于物种、细胞类型和/或转化状态。siRNA寡核苷酸的非靶向效应也可能导致PIASy缺失的HeLa细胞中Topo IIα异常定位和染色体分离。此外，尚不清楚HeLa细胞中PIASy的缺失是否与Topo IIα的SUMO修饰受损有关。
RanBP2在染色体不稳定性和肿瘤发生中的作用
我们的发现是，RanBP2亚型小鼠对致癌诱导的肿瘤高度敏感，并且容易发生各种自发肿瘤，这揭示了RanBP2在抑制肿瘤发生中的新的重要作用。RanBP2的抑瘤功能可能是什么？鉴于RanBP2低多态性诱导非整倍体，并且非整倍性在人类癌症中的发病率很高，人们很容易推测RanBP2通过确保有丝分裂中重复染色体的准确分离而发挥其抑瘤作用。RanBP2亚型小鼠肿瘤中非整倍体高的发现支持这一观点。然而，非整倍体是否与癌症的发展有因果关系一直是一个激烈的调查和辩论的主题。最近对有丝分裂检查点基因缺陷的突变小鼠菌株的研究表明，非整倍体确实有促进肿瘤发生的能力，这种缺陷会增加整条染色体错位的发生率(韦弗和克利夫兰，2006年). 结构染色体缺陷也与肿瘤的发展有关。尽管染色质桥形成率很高，但RanBP2亚型MEFs没有显示出明显染色体畸变增加的证据。然而，这并不排除由于不适当的解链而导致的结构染色体损伤可能导致肿瘤的发生跑步BP2突变小鼠。例如，转化细胞可能比未转化细胞更能抵抗结构损伤引起的细胞死亡。
尽管RanBP2是哺乳动物鼻咽癌的一个成熟成分，但该蛋白的低形态细胞在NLS依赖性蛋白输入、NES依赖性蛋白质输出或mRNA输出方面没有明显缺陷。这些发现表明，由于一些主要运输途径的损伤，在RanBP2亚型小鼠中不太可能发生肿瘤。然而，不能排除的是，在RanBP2亚型小鼠中，对控制细胞增殖或诱导凋亡非常重要的特定NLS或NES蛋白表达水平不适当或无法达到其细胞内作用位点。此外，我们的分析中只包括那些因HeLa细胞中RanBP2缺失而功能受损的转运途径(Bernad等人，2004年;Hutten和Kehlenbach，2006年). 因此，可能某些运输途径在RanBP2亚型细胞中没有最佳功能。
为了探讨RanBP2是否在人类癌症中起作用，我们使用Oncomine数据库中的人类基因表达数据比较了正常组织和肿瘤中RanBP2的相对表达(http://www.oncomine.com网站). RanBP2低形态小鼠对自发性和致癌诱导的肺部肿瘤特别敏感。与这些数据一致，两项独立研究表明，人类非小细胞肺癌中RanBP2转录水平显著降低(Beer等人，2002年;Garber等人，2001年). 这些发现，再加上数据显示RanBP2在人类肺癌细胞系和原发性肺癌样本中的表达经常下调（D.Baker和J.M.v.D.，未发表的数据），表明RanBP2下调是人类肺癌发生中的常见事件。
实验程序
低形态和敲除小鼠的产生及肿瘤敏感性研究
用于生成亚形态的基因靶向程序跑步BP2等位基因（H）如前所述(Dawlaty和van Deursen，2006年). 将靶向正确的ES细胞克隆注射到囊胚中跑步BP2+/H（H）通过标准程序从产生的嵌合体中获得后代。跑步BP2+/−通过Cre介导的切除跑步BP2通过使用MMTV-Core转基因小鼠在雌性生殖系中的外显子3（这种切除导致外显子2和4的帧外融合）。所有小鼠均维持在129Sv/E×C57BL/6遗传背景下。每天监测肿瘤敏感性研究中的小鼠。杀死死亡小鼠，并对其主要器官进行明显肿瘤筛查。按照标准程序对肿瘤进行组织病理学检查。Prism软件用于生成无瘤生存曲线和进行统计分析。DMBA处理如所述(Serrano等人，1996年).
Western印迹和免疫共沉淀
Western blot分析和联合免疫沉淀基本上如所述进行(Kasper等人，1999年). 用于通过western blotting检测SUMO修饰Topo IIα的裂解缓冲液由50 mM Tris HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.1%NP40、0.5%SDS、蛋白酶抑制剂混合物（Roche，Cat.#11-836-170-001）和20 mM NEM组成。样品在冰上保存15分钟，每隔约2分钟涡旋一次，然后在莱姆利缓冲液中煮沸。抗体为兔抗hRanBP2（2500–3224）和兔抗hRanBP2（2550–2837）(Joseph等人，2004年); 兔抗Topo IIα（Topogen）；小鼠抗β-肌动蛋白（AC-151，Sigma）；大鼠抗HA（3F10；罗氏）；和小鼠抗磷酸组蛋白H3（Ser10）（Upstate）。
间接免疫荧光和活细胞成像
MEF在10孔玻璃载玻片上培养24小时，用100μM monastrol在前中期滞留3小时，用3%多聚甲醛在PBS中固定12分钟。抗体培养如所述(Kasper等人，1999年). 抗体为兔抗Topo IIα（Topogen）；人抗着丝粒抗体（抗体公司）；兔抗Mad1（T.Yen博士）；和兔抗Cenp-E（D.Cleveland博士）。按所述进行肝细胞成像(Jeganathan等人，2005年).
体外氨甲酰化试验
酰化反应在20 ml的总体积中进行。反应包含50 mM HEPES（pH 8）、100 mM NaCl、1 mM DTT、1 mM Mg ATP、50 nM E1（110 ng）、25μM SUMO1、2或3（5μg）、125 nM Ubc9（50 ng）、100 ng重组His-HA-RanBP2（2553–2838）或His-HA-RanBP2（2553–2838）L2651A、L2653A和20 ng纯化全长Topo IIα（Topogen）。反应在37°C下进行1小时，用等体积的2×Laemmli缓冲液停止，用SDS-PAGE在5%Tris-HCl凝胶上进行拆分，并通过Topo IIα的免疫印迹分析。重组E1、Ubc9和SUMO1-3来自Boston Biochem（SUMO1接合试剂盒；类别#K-710）。生产重组RanBP2 His-HA-RanBP2（2553–2838）和His-HA-RanBP2（2553–2838）L2651A、L2653A，将其相应的cDNA构建克隆到pET28a（+）（Novagen）的BamH1和Xho1位点。带有His标记的蛋白质在15°C的BL21（DE3）细菌中表达，并从带有Ni的细菌裂解物中纯化2+琼脂糖。
