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EMBO J。2009年6月3日；28(11): 1589–1600.
2009年4月9日在线发布。 数字对象标识：10.1038/emboj.2009.89
预防性维修识别码：PMC2693158型
PMID：19360003

SLP-2是应激诱导线粒体过度融合所必需的

丹尼尔·通德拉,1,*† 圣埃芬妮·格兰德曼奇,1,*‡ 亚历克西斯·朱丹,1 马吕斯·卡博夫斯基,2 伊夫·马滕伯格,1 塞巴斯蒂安·赫齐格,1 桑德琳·达克鲁斯,1,§ 帕斯卡琳·克莱尔,三 伊内斯·拉什克,4 卡斯滕·默克维思,4 莎拉·埃塞斯,4 弗兰克·克劳斯,5 大卫·C·陈,6 克里斯蒂安·亚历山大,7 克里斯托夫·鲍尔,8 理查德·尤尔,三 兰格尔,4和Jean-Claude马蒂诺1,一
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补充材料

摘要

线粒体是动态的细胞器，其形态是融合和分裂这两个对立过程的平衡结果。线粒体融合依赖于动力相关的GTPases、线粒体外膜中的线粒体融合蛋白（MFN1和2）和线粒体内膜中的OPA1（视神经萎缩1）。除了线粒体DNA的维持作用外，对线粒体融合的生理作用知之甚少。在这里，我们报道了线粒体在暴露于选择性应激的细胞中过度融合并形成高度互联的网络。当受到凋亡刺激（如紫外线照射或放线菌素D）触发时，此过程先于线粒体分裂。应激诱导的线粒体过度融合（SIMH）独立于MFN2、BAX/BAK和抑制剂，但需要L-OPA1、MFN1和线粒体内膜蛋白SLP-2。在没有SLP-2的情况下，L-OPA1丢失，SIMH被阻止。SIMH伴随着线粒体ATP生成的增加，是一种新的适应应激的生存反应。

关键词：ATP、融合、线粒体、应激、存活

介绍

真核细胞线粒体的形态不断地被分裂和融合的相反过程所塑造(Hoppins公司等, 2007). 这种动态行为对正常线粒体功能至关重要，并参与包括发育、凋亡和衰老在内的基本过程(陈，2006). 近年来，线粒体分裂和融合机制的几个关键元件被鉴定出来，其中至少有四种动力相关的GTPase，即线粒体融合蛋白1（MFN1）、线粒体融合蛋白2（MFN2）、视神经萎缩1（OPA1）和动力相关蛋白1（DRP1）起着重要作用(Hoppins公司等, 2007). MFN1和2位于线粒体外膜，通过形成连接相邻线粒体的同源和异源二聚体介导外膜融合(Koshiba公司等, 2004). OPA1负责线粒体内膜的融合，并与MFN1协同作用以协调两个膜的融合(奇波拉特等, 2004). 此外，OPA1通过形成低聚物，在嵴连接的形成中起作用(弗雷扎等, 2006). 最后，DRP1是线粒体外膜分裂所必需的(斯米尔诺娃等, 2001).

线粒体分裂和融合似乎对小鼠的发育和/或小鼠和人类的神经元存活和功能至关重要。缺乏MFN1、MFN2或OPA1的小鼠在胚胎早期死亡(陈等, 2003;戴维斯等, 2007). 此外，在人类中，MFN2和OPA1的点突变分别导致严重的神经退行性疾病，如夏科特-玛丽-牙2A型和显性视神经萎缩(亚力山大等, 2000;德莱特等, 2000;祖克内尔等, 2004). 另一方面，DRP1的缺失对秀丽隐杆线虫(拉布鲁斯等, 1999;布雷肯里奇等, 2008). 这些发现说明了线粒体动力学在细胞内稳态中的重要性。然而，线粒体融合和分裂在细胞功能和生存中的生理作用仍知之甚少。因此，与线粒体动力学缺陷相关的神经退行性疾病的确切机制尚不清楚。

线粒体分裂是选择性消除去极化线粒体所必需的(细枝等, 2008)发生在细胞凋亡过程中(宣等, 2008). 此外，线粒体分裂发生在线粒体功能失调时，可能是OPA1切割的结果(杜维津·考贝特等, 2006;吉列里等, 2008). 线粒体融合受损导致的线粒体分裂通常伴随着线粒体DNA（mtDNA）丢失导致的生物能量学缺陷(Chan，2006年;Hoppins公司等, 2007). 因此，线粒体融合是线粒体DNA维持所必需的，可能是因为它允许线粒体之间的线粒体DNA交换。除了这一作用外，人们对线粒体融合的重要性知之甚少。在这里，我们报道了线粒体过度融合，并在暴露于抑制细胞溶质蛋白合成的压力下的细胞中形成高度互联的网络。应激诱导的线粒体过度融合（SIMH）需要代谢活跃的线粒体，导致线粒体ATP生成，并赋予细胞应激抵抗能力。因此，SIMH代表了对压力的适应性反应。

结果

SIMH需要MFN1和OPA1

在暴露于多种应激刺激（包括紫外线照射（UV-C）、放线菌素D（Act D）、环己酰亚胺（CHX））的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中，发现明显伸长的线粒体堆积(图1A和B)茴香霉素、马普糖醇、血清和氨基酸剥夺（数据未显示）。需要注意的是，线粒体形态变化首次在应激诱导后2–3小时出现，并且随着时间的推移，这一过程增加，在6–9小时达到峰值，形成高度互联的薄线粒体丝网。只要细胞暴露在应激刺激下并且没有发生凋亡，这种形态就可以保持（数据未显示）。在许多哺乳动物细胞系（HeLa、Cos-7、NIH 3T3、DU145、143B）、小鼠原代成纤维细胞、肝细胞和星形胶质细胞中也观察到了这种现象（数据未显示）。为了反映融合活动的极端性质，我们将这个过程命名为“应激诱导的线粒体过度融合（SIMH）”

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应对应激刺激的线粒体微管需要Opa1和Mfn1。(A类,B类)暴露于60 mJ/cm后的野生型MEF2UV-C，3μg/ml Act D或10μM CHX。（A） 用细胞色素抗体染色的MEFc（c）在未经处理的条件下和应激暴露后9h用荧光显微镜进行分析。比例尺，25μm。（B） 在压力暴露后的指定时间点，对大多数连接的、很长（>5μm）的管状线粒体的细胞进行量化，这些线粒体的末端难以观察（定义为过度融合线粒体）。数据表示三个独立实验的平均值±标准差，每个实验在每个条件下计数>300个细胞。(C类,D类)野生型，Mfn1−/−，Mfn2−/−，Mfn1/2−/−，不透明1−/−和Bax/Bak−/−暴露于UV-C照射后的MEF。（C） 暴露于60 mJ/cm后9 h线粒体过度融合细胞的定量2UV-C、3μg/ml Act D或10μM CHX。数据表示三个独立实验的平均值±标准差，每个实验在每个条件下计数>300个细胞。此处显示的野生型MEF是Mfn1的控件−/−细胞和是所有WT MEF的代表，用作突变MEF的对照。（D） 用细胞色素抗体染色的MEFc（c）在未处理的条件下和UV-C照射后9小时通过荧光显微镜进行分析。比例尺，25μm。

为了测试线粒体融合机制的关键分子成分在这些应激期间对线粒体微管化是否必要，我们使用了MFN1（MFN1）缺陷的MEF−/−)，MFN2（MFN2−/−)，MFN1和2（MFN1/2−/−)和OPA1（OPA1−/−) (陈等, 2003;歌曲等, 2007). 作为Bcl-2家族的成员，包括BAX和BAK，最近有报道调节线粒体形态发生(卡博夫斯基等, 2006)，我们还测试了Bax/Bak缺陷MEF（Bax/Back−/−) (图1C和D). 如前所述，所有突变MEF均显示出小的丝状或点状线粒体(陈等, 2003;卡博夫斯基等, 2006;歌曲等, 2007). Mfn2的暴露−/−Bax/Bak缺乏细胞对Act D、CHX和紫外线照射诱导线粒体伸长，这在这些细胞中尤为显著，因为小点状线粒体“变形”成大量细长的细丝(图1C、D和补充电影). 重要的是，在OPA1、MFN1或两者都缺乏的细胞中，线粒体微管没有发生或显著减少，这表明在SIMH期间OPA1和MFN1（而非MFN2）发挥着特殊作用。

用原核CCCP破坏线粒体膜电位或用寡霉素抑制ATP合成酶阻止SIMH。此外，我们发现143Bρ中没有发生SIMH0缺乏线粒体DNA但显示正常膜电位的细胞(Buchet和Godinot，1998年;阿诺德等, 2003) (补充图1A–C). 因此，需要活性氧化磷酸化来促进SIMH。

SIMH是线粒体融合活性激活的结果

为了确定线粒体的伸长是否伴随着线粒体内膜的融合和融合线粒体基质管腔的连续性，我们首先在WT MEF的线粒体中表达了Dendra2，这是一种光活性探针，在紫外线短暂激发下由绿色光转换为红色(古尔斯卡亚等, 2006). 探针在细长线粒体的一个小区域内被激发，并被发现扩散到离激发点很远的地方，从而表明受应激细胞细长线粒体中基质腔的连续性(补充图2). 然后，我们测量了应激Mfn2的线粒体融合活性−/−如前所述，使用mito-PAGFP系统的细胞(卡博夫斯基等, 2004) (图2A和B). 之所以选择这些细胞，是因为它们的线粒体对压力具有高反应性。添加CHX后3 h，Mfn2的线粒体融合活性显著增加−/−与未经处理的细胞相比，MEF。有趣的是，线粒体融合活性的增加似乎是一个短暂的事件，因为在CHX治疗7小时后其降低。

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SIMH是线粒体融合活性增加的结果。(A类)可视化和(B类)使用mito-PAGFP定量二甲基亚砜处理的Mfn2中线粒体融合−/−MEF（UT单元）(n个=27），以及Mfn2−/−MEF 3小时(n个=30）和7小时(n个=30）CHX治疗后。用405-nm的光对有丝分裂-PAGFP表达细胞内的感兴趣区域进行光激活，然后用488-nm的光进行全细胞成像。用较高的探测器增益拍摄激活前图像，激活后调整增益以避免激活线粒体过饱和。采集后处理使用MetaMorph软件进行。数据表示平均值±标准误差。P（P）-值（与未经处理的Mfn2相比−/−),t吨-测试，双尾，未配对。(C类)野生型Mfn1线粒体的形态−/−，Mfn2−/−，Mfn1/2−/−和Opa1−/−MEF瞬时表达显性阴性DRP1突变体HA-DRP1-K38。使用MitoTracker对线粒体进行染色，使用HA标签抗体显示Drp1 K38A。(D类)（C）中描述的线粒体形态细长的细胞定量。作为对照，细胞转染GFP。数据表示三个独立实验的平均值±标准差，每个实验在每个条件下计数>300个细胞。(E类)未经处理的WT MEF和暴露于60 mJ/cm后的亚细胞分馏2UV-C，3μg/ml ActD或10μM CHX。在指定的时间点采集细胞并分离线粒体。分别使用DRP1和FIS1抗体通过SDS-PAGE分析细胞质和线粒体部分。肌动蛋白作为细胞质部分的负荷控制。这些数据代表了三个独立的实验。**P（P）<0.01;***P（P）<0.005; 学生t吨-测试，未配对，双尾。

我们还测试了抑制裂变机制可能是SIMH机制的一部分的可能性。DRP1的显性阴性突变体DRP1-K38A的表达导致Mfn1的线粒体延长−/−以及WT和Mfn2−/−单元格，但不在Mfn1/2中−/−或Opa1−/−细胞，确认融合过程中Mfn 1或2和OPA1的要求(Hoppins公司等, 2007;图2C和D). Opa1公司−/−表达DRP1-K38A的细胞仍然不能表达SIMH（数据未显示）。As抑制线粒体分裂导致Mfn1中线粒体的微管化−/−虽然SIMH不会在这些细胞中发生，但DRP1抑制不太可能是SIMH的主要机制。此外，在应激暴露后的前9小时内，裂变蛋白DRP1和hFIS1的蛋白水平没有显著变化(图2E). 最后，hFIS1的过度表达通过DRP1破坏线粒体(Yoon公司等, 2003)，防止了SIMH的发生（数据未显示），进一步表明DRP1活性在压力下没有受损。总之，这些数据表明，SIMH依赖于线粒体融合活性的增加，而不是裂变活性的抑制，尽管后者的可能性不能完全排除。

SIMH需要口香糖样蛋白2（SLP-2）

最近，SLP-2已被鉴定为包含抑制物、船队蛋白和机械受体的假定支架蛋白超家族的线粒体成员(塔维纳拉基斯等, 1999;达克鲁兹等, 2003;莫罗和帕顿，2005年;哈耶克等, 2007). 尽管其功能尚未得到很好的表征，但最近发现它与MFN2相互作用(哈耶克等, 2007)以及禁令1和2(达克鲁兹等, 2008). 我们测试了SLP-2是否也能参与SIMH。我们产生了MEF，其中SLP-2的表达被RNA干扰下调。表达SLP-2或荧光素酶shRNA的MEF中线粒体的形态和膜电位相似(补充图3和数据未显示）。然而，对照MEF的线粒体在紫外线照射或CHX处理后经历SIMH，而SLP-2缺失MEF的那些线粒体碎片(图3A和补充图3). 线粒体碎片发生在应激后的前6小时内，不是线粒体膜电位下降或凋亡的结果（数据未显示）。

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应激诱导的线粒体过度融合需要SLP-2。(A类)暴露于60 mJ/cm后8 h，稳定表达抗荧光素酶对照shRNA（shLuc）或抗SLP-2（shSLP-2）对照shRNA的野生型MEF线粒体形态定量2UV-C或10μM CHX。管状线粒体是指游离端可见的孤立线粒体；过度融合的线粒体形成了一个由相互连接的细胞器组成的网状结构，其末端难以观察。(B类)CHX治疗后指定时间点对（A）中所述细胞进行免疫印迹分析。使用OPA1和SLP-2抗体通过SDS-PAGE分析全细胞裂解产物。(C类)瞬时转染FLAG标记的大鼠OPA1变体1（rOPA1-V1）及其不可切割的缺失突变体（rOPA1-V1-ΔS1）后，稳定表达shSLP-2的野生型MEFs中线粒体形态的定量。细胞暴露于10μM CHX 8h后，用MitoTracker和FLAG抗体进行染色，并用荧光显微镜分析转染细胞的线粒体形态。(D类)（C）中所述细胞的免疫印迹分析。使用OPA1和SLP-2抗体通过SDS-PAGE分析全细胞裂解产物。HSP70用作负载控制（B、D）。数据（A，C）表示三个独立实验的平均值±标准差，每个实验在每个条件下计数>300个细胞。印迹（B，D）是三个独立实验的代表。

在压力下维护OPA1L需要SLP-2

当SLP-2缺乏应激细胞中线粒体断裂时，我们分析了OPA1的表达模式，其修饰与线粒体形态的调节有关(杜维津·考贝特等, 2006;石原等, 2006;格里帕里克等, 2007;歌曲等, 2007). 在对照MEF中可以检测到五个OPA1带（a–e）(图3B). 带a和带b对应于长亚型，而带c–e被认为是蛋白质水解过程的结果。在野生型MEF中，OPA1的表达模式在SIMH期间没有显著改变。在未表达SLP-2缺陷的MEFs中，所有OPA1条带都表达，但与野生型细胞相比，条带c和e的强度略有增加，而条带d的强度较低。加入CHX后，a和b条带的强度显著降低，而c和e条带的密度增加(图3B). 同样，Opa1中的SLP-2消耗−/−瞬时转染大鼠OPA1变异体1（rOPA1-V1）的细胞(石原等, 2006)诱导OPA1蛋白水解裂解(图4A). 因此，我们的数据表明，在应激期间，SLP-2是维持长OPA1亚型所必需的。

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SLP-2可防止SIMH期间OPA1蛋白水解。(A类)Opa1的免疫印迹分析−/−在CHX治疗后的指定时间点，短暂转染FLAG标记的大鼠OPA1变异体1（rOPA1-V1）及其非切割缺失突变体（rOPA1-V1-ΔS1）后，MEF稳定表达shSLP-2或shLuc。使用OPA1抗体通过SDS-PAGE分析全细胞裂解产物。(B类)Opa1线粒体形态的量化−/−线粒体靶向YFP单独（未显示）或与rOPA1-V1和rOPA1-V1-ΔS1一起瞬时转染后，MEF稳定表达shLuc或shSLP-2。细胞暴露于10μM CHX中8 h，并通过荧光显微镜分析YFP阳性细胞(C类). (D类)稳定表达抗荧光素酶shRNA（shLuc）或SLP-2（shSLP-2）的野生型MEF用指示浓度（1,10）处理-o个-菲咯啉或1 mM PMSF单独或与10μM CHX联合使用。3小时后，收集细胞并使用全细胞裂解物进行SDS-PAGE。(E类)Pbh2的线粒体形态飞行/飞行MEF（WT），Prohibitin 2淘汰赛（Phb2−/−)和Phb2−/−再次表达禁止蛋白2（PHB2｜PHB2−/−)暴露于10μM CHX后6小时。(F类)（E）中所示的细胞数量。HSP70用作负载控制（a、D）。数据（B）表示三个独立实验的平均值±标准差，每个实验在每个条件下计数>300个细胞。

为了检测长OPA1亚型的切割是否阻止了SLP-2缺失细胞中SIMH的发生，我们在这些细胞中表达了缺乏S1切割位点的大鼠OPA1变体1的不可切割缺失突变体（rOPA1-V1-ΔS1）(石原等, 2006)以及可切割OPA1变体1 rOPA1-V1作为对照。rOPA1-V1或rOPA1-V1-ΔS1的适度表达并没有显著改变SLP-2缺失细胞中线粒体的形态(图3C). 此外，在应力作用下，只有rOPA1-V1-ΔS1而不是rOPA1-V1促进了SIMH(图3C). 因此，在CHX治疗后持续存在的不可切除OPA1长亚型的表达(图3D)使线粒体在SLP-2缺陷细胞中经历SIMH。从Opa1的实验中得出了类似的结论−/−细胞，其中我们表达rOPA1-V1或rOPA1-V1-ΔS1(图4A). 两种结构都能促进控制Opa1中的SIMH−/−细胞。然而，在SLP-2缺陷型Opa1中−/−细胞，只有不可切割的OPA1突变体是有效的(图4B). 综上所述，这些数据使我们得出结论，OPA1裂解可防止SLP-2缺陷细胞中SIMH的发生。此外，这些数据表明长OPA1亚型对于SIMH是必要的和充分的(图4C).

为了检查蛋白水解是否只发生在S1切割位点，我们使用了大鼠OPA1变体7，它同时包含S1和S2位点(石原等, 2006). 该变异体在应激正常和SLP-2缺陷Opa1中表现出与rOPA1-V1相同的活性−/−单元格(补充图4B). 无应力SLP-2缺陷细胞在S2位点的OPA1处理减少，在S1位点的分裂增加(补充图4A). 同样，亚型7（AIF-rOPA1-V7）的S1裂解产物230–997) (石原等, 2006)未能在Opa1中促进融合−/−单元格（未显示数据）。

OPA1可以被各种蛋白酶切割(奇波拉特等, 2006;石原等, 2006;杜维津·考贝特等, 2007;格里帕里克等, 2007;歌曲等, 2007;默克维思等, 2008). 为了确定蛋白酶是否负责在应激期间SLP-2缺陷细胞中OPA1的裂解，我们用丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF或金属蛋白酶抑制剂1,10处理这些细胞-o个-菲咯啉。如所示图4D, 1,10-o个-菲咯啉显著降低SLP-2缺陷MEF中OPA1的应力诱导裂解。这些数据表明，SLP-2可能通过金属蛋白酶在应激条件下阻止OPA1断裂，从而使线粒体融合。总之，这些实验表明，SLP-2在SIMH期间控制OPA1的稳定性。

我们最近报告说，SLP-2与禁令1和2相互作用(达克鲁兹等, 2008)，已知控制OPA1处理的两种蛋白质(默克维思等, 2008). 因此，SLP-2的作用可能由禁令介导。为了验证这个假设，我们使用了禁止2基因敲除MEF（Phb2−/−)也缺少禁止1的表达(默克维思等, 2008). 在用CHX治疗时，我们发现Phb2的线粒体−/−细胞与对照细胞线粒体融合程度相同(图4E和F). 因此，与相关SLP-2相比，SIMH不需要禁止。

SIMH促进线粒体最佳ATP生成

接下来我们研究了SIMH的生理相关性。线粒体的主要作用是通过氧化磷酸化（OXPHOS）产生ATP。我们首先测量了对照组和应激组WT MEF的细胞总ATP水平，发现暴露于CHX、UV或D法案的WT MEFs中的ATP显著增加，但用staurosporine（STS）处理的细胞中的ATP没有显著增加，STS是一种不会触发SIMH的刺激物(图5A和数据未显示）。同样，CHX治疗的Mfn2的总ATP水平增加−/−和表达shLuc的MEFs。相反，CHX治疗的Mfn1没有或几乎没有增加−/−、Opa1−/−和shSLP-2 MEF(图5B). 因此，总ATP水平仅在应激的SIMH感受态细胞中增加。虽然显示了ATP的相对含量，但在无应力WT Mfn1中，ATP的绝对值是可比较的−/−和Mfn2−/−MEF，尽管Mfn1的ATP略有增加−/−MEF公司(补充图5). 为了测试线粒体是否对ATP生成的增加负责，我们测试了线粒体的OXPHOS容量。我们为粘附细胞提供了氧化性呼吸底物甲基丙酮酸，并在15分钟内测量了ATP的生成。这种问题无法用纯化的线粒体解决，线粒体在分离过程中不可避免地会断裂。图5C表明，在未受应激的WT细胞中，丙酮酸甲酯在15分钟内导致ATP水平轻微增加。相反，当添加到用CHX预处理6小时的WT细胞中时，甲基丙酮酸刺激ATP生成。这种增加被ATP合成酶抑制剂寡霉素所消除，证实其来源于线粒体(图5C). 将所有非应激细胞中的ATP水平设置为100%，我们还测量了应激Mfn2在15分钟内的ATP水平增加了20–40%−/−单元格(图5D). 相反，CHX治疗的Mfn1−/−单元格(图5D)和SLP-2缺陷细胞(图5E)添加甲基丙酮酸后，ATP水平保持稳定。SLP-2缺陷MEF中SLP-2的再导入使这些细胞具有SIMH活性，并允许应激后OXPHOS增加(图5E). 因此，在接受SIMH的细胞中测得的总ATP水平的增加，至少部分是由于OXPHOS增加。部分ATP水平也可能是由于ATP水解减少。

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SIMH促进线粒体ATP生成。(A类,B类)测量用Act D（3μM）、CHX（10μM）和UV（60 mJ/cm）处理的WT MEF中的总ATP水平2)和STS（0.25μM）（A），符合SIMH标准（WT，Mfn2−/−，shLuc）和不称职（Mfn1−/−，OPA1−/−，shSLP-2）细胞（B）暴露于10μM CHX处理6 h(C类–E类)线粒体ATP生成的测量。用10μM CHX预处理细胞6 h，然后用10 mM甲基丙酮酸（MeP）。在5、10或15分钟后收获细胞，并测定总ATP水平。在联合添加甲基丙酮酸+寡霉素（10μM）15分钟后，也测量了In（C）ATP水平。数据表示至少三个独立实验的平均值±s.e.m。*P（P）<0.05;**P（P）<0.01;***P（P）<0.005; 学生t吨-测试，未配对，双尾。

对接受SIMH的WT MEF线粒体的超微结构分析显示，细胞器具有浓缩的基质和肿胀的嵴，这种结构与氧化磷酸化增加相一致(哈肯布鲁克，1966年) (图6). 令人惊讶的是，应激Mfn1中的线粒体−/−和Opa1−/−MEFs也采用了“浓缩态”形态，嵴增大(图6)尽管OXPHOS没有明显增加(图5D). 这些发现表明线粒体过度融合是最佳OXPHOS的必要条件。相反，在SLP-2缺乏细胞中，线粒体在无应激状态下表现为正统形态，而嵴在应激状态下重塑，并形成大而无组织的小泡(图6). 总之，这些数据表明SIMH为细胞提供了增加的OXPHOS和ATP水平，并表明这一过程可以帮助细胞克服短暂的、可逆的代谢损伤。

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SIMH与超微结构改变有关。WT、Mfn1的超微结构分析−/−，hMFN1-HA：Mfn1−/−，OPA1−/−，mOPA1-V1:OPA1−/−、shLuc和shSLP-2 MEF。细胞未经处理（左侧）或暴露于10μM CHX（右侧），并在6小时后固定，以进行电子显微镜分析。比例尺，1μm。

SIMH是一种针对压力的生存反应

我们研究了SIMH是否可以作为对紫外线照射或act D治疗的保护性反应，这两种刺激可以诱导SIMH。这些研究是用Mfn1进行的−/−SLP-2缺陷细胞和对照细胞。仅在晚期时间点（>14小时）出现细胞凋亡。图7A和B表明SIMH-无功能细胞Mfn1−/−与SIMH活性细胞（hMFN1-HA：Mfn1−/−和shLuc细胞）。重要的是，Mfn1−/−和hMfn1-HA:Mfn1−/−细胞对staurosporine同样敏感，这种刺激不会触发SIMH(图7C和数据未显示）。这表明SIMH功能不全的细胞不易受所有凋亡刺激的影响，但其敏感性是与细胞环境相关的。SIMH活性细胞的耐药性可以用BAX活化和细胞色素的延迟来解释c（c）释放，均通过免疫细胞化学评估(补充图6). 此外，当细胞在4小时内受到足以诱导SIMH的低剂量Act D的应激时，它们获得了对继发性凋亡应激的持久抵抗力(补充图7). 因此，这些数据表明，SIMH代表了对特定应激刺激的促生存反应，并表明该过程可以作为对抗特定凋亡应激的预调节机制。

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应激诱导的线粒体过度融合可防止细胞凋亡。(A类)Mfn1死亡−/−和hMFN1-HA:Mfn1−/−暴露于3μg/ml Act D或60 mJ/cm的细胞2紫外线-C(B类)瞬时转染shSLP-2或shLuc的HeLa和MEF细胞暴露于60 mJ/cm后死亡2紫外线(C类)Mfn1死亡−/−和hMFN1-HA:Mfn1−/−MEF细胞暴露于1μM staurosporine。在所有情况下，在指定的时间点收获细胞，并用膜联蛋白V FITC染色用于流式细胞术分析。数据表示至少三个独立实验的平均值±s.e.m(*P（P）<0.05;**P（P）<0.01).

讨论

线粒体动力学的核心问题之一是这个过程在细胞内稳态中起什么生理作用。我们发现，在导致蛋白质合成抑制的各种应激反应期间，线粒体过度融合，这一过程我们称为应激诱导的线粒体过度融合（SIMH）。SIMH被发现与线粒体ATP生成增加相关，并赋予细胞抗应激能力。

线粒体可以在许多应激条件下迅速改变其形态。改变线粒体功能的刺激常常导致细胞器分裂(巴里考特等, 2007;杜维津·考贝特等, 2007;吉列里等, 2008). 如本文所述，线粒体融合很少被描述为应激反应。几十年前，德伊奇和戈德曼（1967）据报道，低Act D浓度会触发HeLa细胞中的线粒体“网状网络”。此外，烟草细胞中的线粒体因缺氧而异常伸长(Van Gestel和Verbelen，2002年)在暴露于烷基化化学物质以撒吖啶酸的哺乳动物细胞中，即使在这种情况下，该化学物质可能通过非特异性抑制裂变蛋白发挥作用(Soltys和Gupta，1994年;Bowes和Gupta，2008年). 也有报道称，培养细胞中的线粒体伸长通过OXPHOS强制产生ATP长达数天(罗西尼奥等, 2004). 在我们的研究中，我们报告了几种刺激，包括mRNA翻译抑制剂、紫外线照射和Act D，它们具有下调蛋白质合成的特性(西格尔和西斯勒，1963年;格罗尔曼，1967年;Craig和Kostura，1983年;帕克等, 2006)，可触发线粒体融合（SIMH）。我们的遗传数据表明OPA1和MFN1在SIMH中起着重要作用。OPA1负责线粒体内膜融合和嵴组织(濑崎等, 2003;Wong（王）等, 2003;奇波拉特等, 2006;弗雷扎等, 2006). 由于选择性剪接和蛋白水解，哺乳动物中存在各种OPA1短亚型和长亚型。在正常条件下，短亚型和长亚型是线粒体最佳融合所必需的(歌曲等, 2007)，尽管石原等(2006)据报道，只有L-OPA1亚型才能发生线粒体融合。长OPA1亚型对于促进SIMH是必要的和足够的。这一发现得到了缺乏S-OPA1的Yme1L1缺陷细胞线粒体融合的观察结果的支持(格里帕里克等, 2007).

L-OPA1在应激期间的维持由SLP-2确保，SLP-2是一种线粒体内膜蛋白，最近被鉴定为假定支架蛋白的SPFH-家族成员（禁止蛋白/气孔蛋白/flotillin/Hflk）。我们早些时候已经展示了SLP-2与禁止物1和2之间的物理相互作用(达克鲁兹等, 2008)，控制OPA1处理(默克维思等, 2008). 然而，淘汰禁令并没有阻止SIMH，这表明SLP-2在压力条件下独立于禁令调节OPA1处理。因此，我们的研究结果表明，在正常生长条件和压力下，不同的机制控制线粒体融合。在正常生长条件下，MFN2、BAX和BAK以及禁令是维持管状线粒体网络和融合所必需的，但对于SIMH则不是必需的。另一方面，SLP-2是应激条件下线粒体融合所必需的。

我们发现，与SIMH不适能细胞相比，SIMH适能细胞对SIMH诱导的应激、紫外线照射和Act D处理表现出更好的抵抗力。线粒体过度融合与BAX激活和MOMP的延迟相关，这一结果与早期报道的丝裂原过度表达的有益作用一致(杉冈等, 2004)尽管在这项研究中，线粒体强制融合产生的阻力并不局限于诱导SIMH的刺激。我们的结果表明SIMH在维持应激下线粒体ATP生成方面发挥着重要作用。我们发现，在SIMH期间，线粒体采用所谓的浓缩形态，首先描述为哈肯布鲁克（1966），尽管线粒体呼吸减少（未显示），但仍产生增加的ATP水平。有趣的是，在SIMH功能不全的细胞中，Mfn1−/−和Opa1−/−尽管细胞基质凝结，线粒体在应激时并没有产生较高的ATP水平。这些发现表明，细胞器的融合是提供最佳线粒体功能所必需的。早先有理论认为，线粒体融合将产生具有连续膜和基质腔的细长线粒体网络，允许ADP、NADH、FADH等分子自由扩散2，并产生最佳OXPHOS(斯科拉切夫，2001年). 然而，到目前为止，通过诸如降低裂变蛋白的调节来强制线粒体融合的所有方法都会导致相反的结果，即膜电位和ATP生成的降低，这可能是因为不平衡的裂变和融合过程会损坏线粒体(罗西尼奥等, 2004;帕罗内等, 2008;细枝等, 2008). 据我们所知，我们的发现首次表明线粒体的生理伸长和融合与线粒体功能的改善相关。

材料和方法

试剂和抗体

请参阅补充数据以获取详细说明。

细胞系

Mfn1公司−/−，Mfn2−/−，Mfn1/2−/−和Opa1−/−按说明生成(陈等, 2005;歌曲等, 2007). 巴克斯/巴克斯−/−和143Bρ0这些细胞分别由S Korsmeyer教授和R Wiesner教授提供。细胞在添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素和2 mM谷氨酰胺的高糖Dulbecco改良Eagle's培养基中培养，并保存在5%的CO中237°C时。对于瞬时转染，在转染前45分钟将细胞接种在培养皿中，并使用磷酸钙共沉淀法进行转染。

稳定细胞系的产生

如前所述，生成稳定表达shRNAs的MEF(帕罗内等, 2006;达克鲁兹等, 2008). 该方法在补充数据.

线粒体形态的免疫细胞化学和定量

为了用MitoTracker Red染色观察线粒体网络，将盖玻片上生长的细胞在补充有100 nM MitoTracher Red的生长培养基中培养10分钟，在新鲜温暖的培养基中清洗，并如上所述固定。将盖玻片在−20°C的冷丙酮中培养10分钟，然后用PBS清洗、安装并按如下所述进行可视化。为了对线粒体形态进行定量，使用MitoTracker或抗细胞色素对线粒体进行免疫荧光染色c（c）抗体，如前所述(帕罗内等, 2006). 对显示高度互联的管状线粒体网络的细胞进行计数。使用Axiophot或LSM510亚共聚焦显微镜（德国蔡司）分析线粒体形态。

早些时候已经描述了使用线粒体靶向光活化GFP（mtPA-GFP）定量线粒体融合活性(卡博夫斯基等, 2004).

荧光延时显微镜

Mfn2公司−/−如上所述，用pDsRed-mito（Clontech，Invitrogen）编码质粒转染MEF。转染后24小时，将细胞置于35mm玻璃底皿中（WillCo-dish，3522型，WillCo-Wells BV）。在观察前2小时，将培养基更换为成像培养基（不含酚红的DMEM 10%FCS）。记录前60分钟，对细胞进行紫外线照射。将培养物置于37°C的室中，与含有5%CO的湿空气平衡2整个视频显微镜。使用Leica Microsystems AS MDW显微镜，使用×63甘油物镜（NA 1.3）进行延时显微镜检查。细胞每20分钟照射一次，持续52 ms（545 nm激发），用TRITC滤波器组在15 h内捕获30个步长为0.2μm的z堆栈的延时序列。使用Leica AS MDW、AutoDeblur（AutoQuant）和Image J软件根据延时序列制作电影。简单地说，使用AutoDeblur（AutoQuant）软件对单个z切片进行反褶积，并使用Image J软件在处理图像的单个平面上创建最大强度投影。

免疫印迹

细胞重新悬浮在裂解缓冲液中：10 mM HEPES、300 mM KCl、5 mM MgCl2，1 mM EGTA，1%Triton X-100（vol/vol），0.1%（wt/vol）十二烷基硫酸钠（SDS），pH 7.4，补充1×蛋白酶抑制剂混合物（罗氏）。裂解液于2000年开始纺制克，并通过Bradford分析（Bio-Rad）测定蛋白质浓度。对等量的蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到硝化纤维素膜（Schleicher&Schuell），用一级抗体进行免疫印迹，然后用辣根过氧化物酶偶联二级抗体，并通过增强化学发光进行开发。

ATP水平的测量

根据制造商的方案，使用ATP测定试剂盒（Invitrogen）测量ATP水平。

电子显微镜

在RT条件下，细胞在补充有2.5%戊二醛的培养基中固定20分钟。在100 mM磷酸盐缓冲液（KH）中清洗后2/纳2高性能操作4; pH 7.4），细胞在RT下在2%四氧化锇（OSO）中固定20分钟4)，并在2%的乙酸铀酰中在室温下预染色10分钟。在磷酸盐缓冲液中洗涤后，将细胞在50、70、90和100%乙醇中脱水（每次操作10分钟）。然后将样品依次浸入1:1（vol/vol）乙醇：丁苯树脂（Polyscience），1:3乙醇：丁烯树脂，每个程序30分钟，100%丁苯树脂3小时，最后100%丁烯树脂在60°C下48小时进行聚合。

在镍网格上分离超薄切片，在2%醋酸铀酰中染色10分钟，在雷诺柠檬酸铅中染色5分钟，并在60 kV下使用飞利浦M400透射电子显微镜进行检查。

细胞凋亡

如前所述，使用Annexin V FITC（BD Bioscience）检测细胞凋亡(帕罗内等, 2006). 表达shLuc或shSLP-2的细胞的凋亡过程如下：用pRETROshLuc或pRETROshSLP-2质粒和编码红色荧光蛋白（ptdTomato-C1）的质粒瞬时转染MEFs或HeLa细胞，作为细胞转染的标记。在转染后72小时，细胞暴露于UV-C，在指定的不同时间点收集，并用Annexin V-FITC染色。流式细胞术检测番茄红细胞凋亡。

补充材料

补充图1–7

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补充电影

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补充数据

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致谢

我们感谢Mihara博士和Ishihara博士提供的大鼠OPA1-V1、OPA1-VlΔS1、OPA1-V7和AIF-OPA1-V7230–997cDNA、OPA1 cDNA的Scorrano博士、人类Mfn1 cDNA的Rojo博士、143B rho0细胞的Wiesner教授、pdtTomato-C1的Picard教授、Dencher博士和Madrenas博士的支持、Rossignol博士的建议以及实验室所有成员的富有成果的讨论。这项工作由德国联邦科学院（DFG）（TO540/1-1）、NIH内部计划、瑞士国家科学基金会（补贴3100A0-109419/1）、Oncosusse信托基金会、罗氏研究基金会和日内瓦教育部资助。FK的部分资金来自欧盟（MiMage，EC FP6合同号：LSHM-CT-2004-512020）。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团