投资眼科视觉科学。作者手稿；PMC 2009年11月1日提供。
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美国国立卫生研究院：尼姆斯110119
眼压升高导致线粒体分裂并触发青光眼视神经OPA1释放
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Won-Kyu Ju村
1加利福尼亚州拉霍亚加利福尼亚大学圣地亚哥分校汉密尔顿青光眼中心和眼科92037
基恩·扬·金
2加州大学圣地亚哥分校医学院国家显微镜和成像研究中心，加利福尼亚州拉霍亚，邮编：92093
詹姆斯·林赛
1加州大学圣地亚哥分校汉密尔顿青光眼中心和眼科
米拉·安格特
1加州大学圣地亚哥分校汉密尔顿青光眼中心和眼科
Karen X.Duong-Polk公司
1加州大学圣地亚哥分校汉密尔顿青光眼中心和眼科
雷·斯科特
2加州大学圣地亚哥分校医学院国家显微镜和成像研究中心，加利福尼亚州拉霍亚，邮编：92093
詹姆斯·杰扬·金
2加州大学圣地亚哥分校医学院国家显微镜和成像研究中心，加利福尼亚州拉霍亚，邮编：92093
伊斯梅尔·库赫马佐夫
2加州大学圣地亚哥分校医学院国家显微镜和成像研究中心，加利福尼亚州拉霍亚，邮编：92093
马克·H·埃利斯曼
2加州大学圣地亚哥分校医学院国家显微镜和成像研究中心，加利福尼亚州拉霍亚，邮编：92093
盖伊·A·珀金斯
2加州大学圣地亚哥分校医学院国家显微镜和成像研究中心，加利福尼亚州拉霍亚，邮编：92093
罗伯特·韦恩勒布
1加州大学圣地亚哥分校汉密尔顿青光眼中心和眼科
1加州大学圣地亚哥分校汉密尔顿青光眼中心和眼科
2加州大学圣地亚哥分校医学院国家显微镜和成像研究中心，加利福尼亚州拉霍亚，邮编：92093
- 补充资料
GUID:F17DD9AB-8DD8-4F07-BC80-34B30F7C1141
摘要
目的
确定眼压（IOP）升高是否会触发线粒体分裂和超微结构变化，并改变青光眼DBA/2J小鼠视神经（ON）中1型视神经萎缩（OPA1）的表达和分布。
方法
测量DBA/2J小鼠眼睛的眼压，并通过常规EM和EM断层扫描评估线粒体结构变化。用Taqman qPCR检测细胞色素c氧化酶IV亚单位1（COX）、OPA1和Dnm1（动力相关蛋白1的大鼠同源物）mRNA。通过免疫细胞化学和Western blot检测COX和OPA1蛋白的分布。
结果
眼压升高>20mmHg的10个月大青光眼ONH患者的视神经头（ONH）开挖、轴突丢失和COX减少明显。EM分析显示，10个月大的青光眼ONH轴突中线粒体分裂、基质肿胀、嵴体积显著减少，嵴异常耗竭。这些轴突中线粒体横截面的平均长度从3个月龄小鼠的916.6±768.4nm下降到10个月龄青光眼小鼠的582.87±303.3 nm(P（P）<0.001). 在10个月大的DBA/2J小鼠视神经头中观察到COX mRNA中度减少。在10个月大的青光眼ONH中，OPA1免疫反应性和基因表达的大幅度降低伴随着Dnm1基因表达的较大增加。亚细胞分馏分析表明，10个月龄青光眼性ONs线粒体OPA1和细胞色素c的释放增加。
结论
IOP升高可通过促进COX的减少、线粒体分裂和嵴耗竭、OPA1和Dnm1表达的改变以及OPA1释放的诱导，直接损伤ONH轴突中的线粒体。因此，保护线粒体的干预措施可能有助于保护青光眼ON变性。
介绍
眼压升高是青光眼视神经损伤的重要危险因素。1然而，眼压升高、青光眼视神经（ON）损伤和视网膜神经节细胞（RGC）死亡之间的确切病理生理关系尚不清楚。在其他中枢神经系统疾病模型中，线粒体变化与神经元死亡相关。2,三此外，有证据表明青光眼患者线粒体呼吸异常。4最近，我们发现适度升高的静水压可导致分化的RGC-5细胞中嵴的异常耗竭、细胞色素c的释放、细胞ATP的减少和动力相关蛋白1（Drp-1）的移位。5此外，我们还发现，静水压升高会触发视神经萎缩1型蛋白（OPA1）和细胞色素c的释放，并诱导分化的RGC-5细胞随后的凋亡细胞死亡。6这些观察结果增加了压力诱导的线粒体功能障碍导致青光眼RGC死亡和ON变性的可能性。
在健康细胞中，线粒体是自主的、形态上动态的细胞器，在结构上反映了细胞内正在进行的分裂和融合的精确平衡。7–9这种平衡由一系列与动力相关的GTP酶调节，这些GTP酶发挥相反的作用。线粒体融合需要OPA1、Mgm1p/Msp1p的人类同源基因和丝裂原融合蛋白。动力蛋白相关蛋白-1（Drp-1）调节线粒体分裂。8,10OPA1是一种动力蛋白相关的GTP酶，参与与线粒体内膜结构动力学相关的各种过程，其突变与人类神经退行性疾病有关，并导致常染色体显性视神经萎缩（ADOA），这是遗传性视神经病变的最常见形式。11,12
OPA1在RGC的胞体和轴突以及水平细胞中表达。13–16然而，OPA1在这些细胞中的具体功能作用尚不清楚。新的证据表明，OPA1的下调导致线粒体分裂，导致HeLa细胞中细胞色素c的释放和凋亡，并诱导纯化RGC中线粒体网络的聚集。17–20尽管其意义尚不清楚，但在线粒体分裂期间观察到OPA1的蛋白水解过程。21–24此外，线粒体分裂过程中OPA1的释放有助于细胞凋亡。19,23然而，眼压升高是否会改变OPA1在青光眼ON变性中的表达和分布尚不清楚。
要在体内在青光眼模型中，我们评估了眼压升高是否会触发线粒体分裂和超微结构变化，并改变DBA/2J小鼠ON中OPA1的表达和分布，这是一种具有广泛特征的菌株，可自发产生高眼压。25–33
材料和方法
化学制品
所有化学品均来自西格玛（密苏里州圣路易斯），另有说明。
动物
所有有关动物的程序均符合视觉和眼科研究协会关于在研究中使用动物的声明。成年3、6、7–8、9–10和12个月龄雌性DBA/2J小鼠（缅因州巴尔港杰克逊实验室）和3、6和10个月龄的雌性C57BL/6小鼠（印第安纳波利斯州哈兰·斯普拉格·道利公司）被关在有盖的笼子里，以标准啮齿动物饮食喂养随意，并保持12小时光照/12小时暗循环。
眼压测量
眼压测量如前所述。25,34本研究中使用的10个月和12个月大的DBA/2J小鼠中的每一只从6个月大开始每月进行一次IOP测量（以证实自发IOP升高超过20mmHg的发展）。确认眼压升高的青光眼DBA/2J小鼠在10个月龄时的眼压升高率为65.3%（64/98）。此外，本研究中使用的3个月龄、6个月龄和10个月龄非青光眼C57BL/6小鼠都进行了一次眼压测量。在使用氯胺酮（100 mg/kg，Ketaset；Fort Dodge Animal Health，Fort Dogge，IA）和木聚嗪（9 mg/kg，TranquiVed，Vedeco，Inc.，St.Joseph，MO）混合物麻醉后，使用外径为50至70μm的无菌充水微针对前房进行插管。然后重新定位微针，以尽量减少角膜变形，并确保眼睛保持在正常位置。微针连接到一个压力传感器（血压传感器；WPI），该传感器将信号中继到桥式放大器（Quad bridge；AD Instruments[ADI]，澳大利亚新南威尔士州Castle Hill）。放大器连接到一个模数转换器（电源实验室；ADI）和一台计算机（G4 Macintosh；Apple computer Inc.，加利福尼亚州库比蒂诺）。
组织制剂
上述光适应小鼠用异氟醚麻醉，并通过静脉注射氯胺酮和木聚嗪杀死。从脉络膜上分离ONs，并用4%多聚甲醛在4°C的0.1M磷酸盐缓冲液（PB，pH 7.4）中固定2小时。在PB中洗涤几次后，ONs通过分级乙醇脱水，然后如前所述嵌入聚酯蜡中。15对于Western blot分析，立即使用整个ONs或将其冷冻在液氮中，并在使用前储存在−70°C。
免疫组织化学分析
如前所述，用免疫荧光法对7μm厚的ON蜡切片进行免疫组织化学染色。15每个年龄组（n=3只小鼠/组）每个蜡块的五个切片用于免疫组化分析。主要抗体为小鼠抗COX单克隆抗体（1:500，Molecular Probes，Eugene，OR）和多克隆兔抗mOPA1抗体（1:1000，Misaka博士和Kubo博士赠送）。35针对小鼠OPA1蛋白的938–960氨基酸制备多克隆兔抗mOPA1抗体，并如前所述纯化肽亲和力。15,35为了防止出现非特异性背景，组织在室温下与1%牛血清白蛋白/PBS孵育1小时，然后与抗COX或OPA1的一级抗体在4°C孵育16小时。经过几个清洗步骤后，将组织与二级抗体、过氧化物酶偶联的山羊抗鼠IgG或山羊抗兔IgG（1:100，分子探针）在4°C下孵育4小时，然后用PBS清洗。在PBS中用核酸染色Hoechst 33342（1μg/ml，分子探针。
使用配备数码相机（SPOT；诊断仪器，密歇根州斯特林高地）的尼康ECLIPSE显微镜（E800；尼康仪器公司，纽约梅尔维尔）在荧光显微镜下拍摄图像。所有组织切片的图像曝光相同，使用Simple PCI 6.0版软件（Compix Inc.，Cranberry Township，PA）获取。
电子显微镜
对于传统EM，每组（n=2只小鼠）的两只眼睛通过心脏灌注固定，溶液在37°C，2%多聚甲醛、2.5%戊二醛（Ted Pella，加利福尼亚州雷丁）和0.15 M二甲氨基甲酸钠（pH 7.4）中，放置在预冷的冰上固定剂中1小时。以下程序用于优化线粒体结构保存和膜对比度。5,36,37将ONH在冰上用0.15M二碳酸钠加3mM氯化钙（pH 7.4）解剖，然后用1%四氧化锇、0.8%亚铁氰化钾、3mM氯化钙在0.1M二碳酸钠（pH 7.4）中后固定1小时，用冰冷的蒸馏水洗涤，在4°C下用2%乙酸铀酰后固定，通过分级乙醇脱水，并嵌入Durcupan树脂中（密苏里州圣路易斯弗卢卡）。超薄（70 nm）切片在使用80 kV操作的JEOL 1200FX透射EM成像之前，用乙酸铀酰和铅盐进行后染色。使用尼康CoolScan系统以1800 dpi的速度对底片进行数字化，图像大小为4033×6010像素阵列，像素分辨率为1.77 nm。38–40如前所述，在无髓ONH中测量线粒体最长横截面的长度。5对于无偏采样，对图像中的所有线粒体进行了测量。
电子显微镜层析成像
每组的层前无髓鞘ONH轴突切片的厚度为400–500 nm。然后将切片在2%醋酸铀酰水溶液中染色30分钟，然后在铅盐中染色15分钟。由15纳米胶体金颗粒组成的基准线索沉积在截面的两侧。对于每次重建，使用400 kV操作的JEOL 4000EX中间电压EM以规则的倾斜增量采集一系列图像。在开始倾斜序列之前，对样本进行辐照，以减少图像采集期间各向异性样本的变薄。使用计算机控制的测角仪，以20000倍的放大率在胶片上记录倾斜系列，围绕垂直于显微镜光轴的轴，角度增量为2°，从−60°到+60°，以精确增加角度步长。照明被保持在接近平行光束的条件下，通过改变曝光时间，光学密度保持恒定。底片用1800 dpi的尼康CoolScan进行数字化，生成4033×6010像素的图像。像素分辨率为0.7 nm。IMOD软件包用于粗略对准。简单地说，我们在使用互相关法大致对齐的倾斜序列的所有图像中跟踪基准金粒子。41使用TxBR包进行精细对准和体积重建。42该软件包通过生成电子轨迹的全局非线性模型来消除图像失真，然后沿这些轨迹反向投影以建立体积。使用Xvoxtrace程序在最高分辨率的平面上通过手动跟踪来执行体积分割。如Perkins等人所述，使用Analyze（明尼苏达州罗切斯特市梅奥基金会）或Synu（加利福尼亚州拉霍亚国家显微镜和成像研究中心）的表面呈现图形对线粒体重建进行可视化。39这些程序允许用户以任何方向逐步完成重建切片，并在三维中跟踪或建模感兴趣的特征。使用Amira（Visage Imaging，Inc.，Carlsbad，CA）制作断层体积的电影。
塔克曼定量PCR
从4只3月龄DBA/2J小鼠、4只10月龄青光眼DBA/2J小鼠和4只10个月龄非青光眼C57BL/6小鼠的巩膜上分离出8个ONH（从视网膜表面向后延伸0.25mm）。组织随后在−20°C下储存在RNA中（Ambion Inc，Austin，TX）。用Trizol（Invitrogen，Carlsbad，CA）提取各组合并ONH的总RNA，在RNeasy微型柱（Qiagen，Valencia，CA）上纯化，并用无RNase DNAse I（Qiangen）处理。通过确认OD260nm/280nm吸收比超过1.9来验证RNA纯度。使用SuperScript II第一链RT-PCR试剂盒（Invitrogen）合成cDNA。通过qPCR（MX3000P，Stratagene，La Jolla，CA），使用来自ONH的25 ng cDNA和2X Taqman通用PCR主混合（Applied Biosystems，Foster City，CA）的一步程序（95°C 10分钟，95°C 30秒，60°C 1分钟，50个循环），测量COX、OPA1和Dnm1基因表达。使用Primer Express 2.0软件（Applied Biosystems）设计COX、OPA1、Dnm1和GAPDH引物以及GAPDH的Taqman探针，该软件来自Biosearch Technologies（加利福尼亚州诺瓦托）(). COX、OPA1和Dnm1探针从罗氏通用探针库（罗氏诊断，德国曼海姆，)用心脏组织测定探针和引物的最佳浓度。使用9倍稀释液（50ng-0.195ng）为靶点（COX、OPA1和Dnm1）和内源性参考物（GAPDH）构建标准曲线。每个靶点和内源性GAPDH对照的样品一式三份。
表1
小鼠COX、OPA1、Dnm1和GAPDH的引物和探针序列塔克曼定量PCR一
Western Blot分析
从3只3月龄DBA/2J小鼠、8月龄青光眼DBA/2J小鼠和10月龄青光眼DBA/2J小鼠的巩膜上分离出6个完整的ONs（从ONH延伸至视交叉核）。然后，组织立即在裂解缓冲液（20 mM Hepes，pH 7.5/10 mM KCl/1.5 mM MgCl）中的玻璃-聚四氟乙烯-波特均质器中均质2/1mM EDTA/1mM EGTA/1mM DTT/0.5%CHAPS/完全蛋白酶抑制剂；罗氏生物化学公司，印第安纳波利斯）。用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离每组10微克混合样品，并将其电转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脱脂奶粉/0.05%吐温-20/PBS封闭膜，用单克隆小鼠抗OPA1抗体（H-300/1:1000；BD Transduction Laboratories，San Diego，CA）或单克隆鼠抗肌动蛋白抗体（Ab-1/1:3000；Calbiochem，La Jolla，CA）孵育，用0.05%吐温-20/PBS冲洗，与过氧化物偶联山羊抗鼠IgG（1:2000；Bio-Rad，Hercules，CA）或山羊抗兔IgM（1:5000；Calbiochem）孵育，并使用化学发光检测（ECL Plus，GE Healthcare Bio-Sciences，Picataway，NJ）开发。使用数字荧光成像仪（Storm 860；GE Healthcare Bio-Sciences）对图像进行分析，并使用肌动蛋白作为细胞溶质组分校准器，VDAC作为线粒体组分校正器，使用ImageQuant TL（GE Health Bio-Scences）对带密度进行归一化。
为了评估OPA1的亚细胞分布，通过差速离心从新分离的ONs中分离出细胞溶质和线粒体部分（线粒体分离试剂盒，皮尔斯，罗克福德，IL）。简单地说，组织立即在试剂a中的玻璃-聚四氟乙烯-波特均质器中均质，与等量的试剂C混合，然后在4°C下在700×g下离心10分钟。对于细胞溶质部分，将上清液在12000×g的温度下在4°C下离心15分钟，并收集上清液作为细胞溶质组分。对于线粒体部分，用2%CHAPS在Tris缓冲盐水中溶解线粒体颗粒，在12000×g下在4℃离心15分钟，然后收集上清液。如上所述进行Western blot分析。用肌动蛋白（如上所述）复制细胞溶质部分样品，用多克隆兔抗VDAC抗体（Ab-5/1:1000，Calbiochem）复制线粒体部分样品，证实了负载相等。使用肌动蛋白作为细胞溶质部分校准品，VDAC作为线粒体部分校准品并使用ImageQuant TL（GE Healthcare Bio-Sciences）对谱带密度进行标准化。误差条表示标准偏差(P（P）经Student t检验<0.05，3个月龄和10个月龄小鼠的n=3）。当用VDAC抗体重新处理胞质部分印迹和用肌动蛋白抗体重新处理线粒体部分印迹时，通过观察到可忽略的染色，证实了胞质和线粒体部分的良好分离（数据未显示）。
统计分析
用三份样品重复进行至少三次试验。数据以平均值±标准偏差表示。使用未配对的Student t检验评估两种实验条件的比较。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。
结果
眼压升高导致ONH患者线粒体分裂和嵴衰竭
3个月龄DBA/2J小鼠的平均眼压为15±1.8 mmHg（SD）。自发性眼压升高通常开始于6-8个月。10月龄DBA/2J小鼠右眼眼压升高峰值为21.5±4.5 mmHg，左眼为19.9±3.7 mmHg(). 相反，在10个月大的非青光眼C57BL/6小鼠中，右眼的平均眼压为14.7±1.7 mmHg，左眼为14.2±1.8 mmHg（参见补充材料1). 为了评估ON变性和轴突丢失，我们分析了甲苯胺蓝染色的横截面和纵截面。这些小鼠的ON在3个月大时表现正常(). 如前所述，29,43在10个月大的青光眼DBA/2J小鼠中观察到大量的ON损伤，包括轴突丢失()，证实存在后天性视神经病变。
青光眼DBA/2J小鼠眼压升高（A） 3个月、6个月、7-8个月、9-10个月和12个月大鼠眼睛的平均眼压和（B）代表性实际眼压值。10月龄小鼠右眼眼压升高峰值为21.5±4.5 mmHg，左眼为19.9±3.7 mmHg。
青光眼DBA/2J小鼠的ON变性（A、C和E）3个月龄小鼠的ON。（B、D和F）。10个月龄青光眼小鼠的ON。注意眼压升高的10个月大青光眼小鼠ON中退化的ONH（B）和ON轴突丢失（D和F）。为了保存线粒体，优化了标本保存程序。比例尺=50μm（A–D）；20微米（E和F）。
比较眼压正常的3个月龄DBA/2J小鼠和眼压升高（>20mmHg）的10个月龄青光眼DBA/2J小鼠ONH的线粒体分布和结构。如所示，COX免疫反应，线粒体活性的标记，44–46集中在3个月龄DBA/2J小鼠的无髓ONH中(). 相反，在10个月大的青光眼DBA/2J小鼠的无髓ONH中观察到的COX免疫反应少得多(; 请参阅中的另外三个示例补充材料2). 采用小鼠COX特异性引物和探针的Taqman qPCR结果表明，10月龄DBA/2J青光眼小鼠ONH中COX mRNA的表达量显著低于3月龄DBA/2J小鼠ONH的0.81±0.06倍（n=8个ONHs/pool，,P（P）<0.05). 此外，10个月龄C57BL/6小鼠的ONH中COX mRNA比3个月龄小鼠的ONH降低0.9±0.04倍（n=8 ONH/池，). 在3个月龄DBA/2J小鼠ONH和10个月龄C57BL/6小鼠ONH之间，COX mRNA相对于GAPDH mRNA的表达或GAPDH与总RNA的比率无显著差异（数据未显示）。
青光眼DBA/2J小鼠无髓ONH的线粒体分裂、基质肿胀和嵴缺失（A和B）无髓ONH中COX免疫组化。COX免疫反应集中在3月龄DBA/2J小鼠的无髓ONH（A，星号）。相反，在10个月龄青光眼DBA/2J小鼠的无髓ONH中观察到的COX免疫反应少得多（B，星号和箭头）。切片用核酸染色Hoechst 33342（蓝色）进行复染。（C） 10月龄青光眼DBA/2J小鼠ONH中COX mRNA表达显著降低(*P（P）通过Student t检验<0.05，3个月大和10个月大的小鼠均为n=3），但3个月大的DBA/2J小鼠和10个月大的非青光眼C57BL/6小鼠之间没有显著变化。（D和E）无髓ONH线粒体的超微结构变化。三个月大的小鼠有不同长度的延长线粒体，显示正常的基质和膜结构（D，箭头）。相反，眼压升高的10个月大青光眼小鼠（E，箭头）的线粒体具有小而圆的细胞器和显著的基质肿胀。（F） 无髓ONH线粒体长度的定量分析。使用常规薄片EM，从2D投影图像测量线粒体最长横截面的长度。误差条表示标准偏差(*P（P）经Student t检验<0.001，3个月龄和10个月龄小鼠的n=216）。比例尺=50μm（A和B）；1μm（C和D）。
透射电镜分析表明，3个月龄DBA/2J小鼠无髓ONH轴突中含有不同长度的经典细长管状线粒体(). 相反，10个月大的青光眼DBA/2J小鼠无髓鞘ONH轴突含有小而圆的线粒体，线粒体基质肿胀(; 请参阅中的另外四个示例补充材料3). 定量分析表明，3月龄DBA/2J小鼠无髓ONH线粒体横截面平均长度从916.6±768.4nm显著降低至10月龄青光眼DBA/2J小鼠无髓ONH线粒体横截面积平均长度582.87±303.3nm(P（P）经t检验<0.001，3个月龄和10个月龄DBA/2J小鼠的n=216）().
为了评估线粒体内部结构的变化，将3个月龄和10个月龄DBA/2J小鼠的无髓ONH固定以保持线粒体形态，并使用EM断层扫描获得显示线粒体详细超微结构的3D重建。一个3个月大的样本的层析重建显示线粒体外膜完整（蓝色），大部分为板层嵴（各种颜色），占据线粒体基质空间(). 相比之下，在10个月大的青光眼DBA/2J小鼠轴突中发现的线粒体的3D断层体积通常显示出更小、更球状的线粒体，偶尔也会很接近(). 10个月龄青光眼DBA/2J小鼠的线粒体表现为基质肿胀，嵴体积显著减小。显示了一个线粒体的例子，它的大部分体积都没有嵴，并且还显示了基质肿胀（较轻的区域）。断层重建中也发现线粒体分裂(; 箭头），因为观察到紧密相连的线粒体片段。
线粒体的EM断层扫描三维重建通过3个月样品（Aa）的中部和10个月样品的两个不同高度（Aa和Bb）显示了每次重建的1.4 nm厚的切片，以强调前者的正常结构特征以及后者的裂变和局部膨胀。在10个月大的样本中，线粒体分裂发生在两个地方，形成三个线粒体小体。通过层析体积的两个切片显示了左、中体（Ba）和中、右体（Bb）最接近的并置，强调裂变已经完成（箭头）。在右侧线粒体体的局部区域（星号）观察到基质肿胀和嵴缺失。膜分割后线粒体表面呈现体积的俯视图（Ab和Gc）和侧视图（Ac、Ad、Bd和Be）显示了嵴的分布以及没有嵴的任何亚体积。外膜以蓝色显示，在Ac、Bc和Bd中透明，以便更好地显示嵴的形状和大小。嵴以各种颜色显示。外膜侧视图显示该膜（Ad和Be）没有破裂。箭头指向Be面板中的裂变位点。具有膨胀基质和缺乏嵴的亚体积也在Ac和Bd（星号）中标记。比例尺=200 nm（A和B）。2部电影的URL为：ftp://电子邮件@ccdb-db1.ucsd.edu/IOC2.mpg,ftp://电子邮件@ccdb-db1.ucsd.edu/daniel2编辑.mpg，密码：arr0wh6ad。
眼压升高改变ONH中OPA1基因和蛋白或Dnm1基因的表达
小鼠模型中OPA1突变或缺失会导致RGC和神经纤维层变性、线粒体功能障碍、ON异常和视觉缺陷。47,48为检测青光眼小鼠ONH中OPA1蛋白表达是否发生改变，采用OPA1免疫组织化学方法。如所示，3个月龄DBA/2J小鼠的ONH中存在大量OPA1免疫反应(). 在10个月大的青光眼DBA/2J小鼠的ONH中观察到的OPA1免疫反应性比在3个月大的DBA/2J小鼠中观察到的要少得多(; 请参阅中的另外四个示例补充材料4). 为了确定OPA1和Dnm1（Drp-1的小鼠同源物）的mRNA表达是否与进展性青光眼损伤相关，对3个月龄DBA/2J小鼠、10个月龄青光眼DBA/2J小鼠以及10个月生非青光眼C57BL/6小鼠的ONH mRNA进行Taqman qPCR。结果归一化为GAPDH mRNA。我们观察到，10月龄青光眼DBA/2J小鼠ONH中OPA1 mRNA显著降低0.65±0.11倍，而10月龄非青光眼C57BL/6小鼠ONH显著增加1.46±0.21倍（n=8 ONHs/pool，,P（P）<0.05). 这一结果与上述10个月大的青光眼DBA/2J小鼠线粒体分裂增加相一致。相反，在10个月龄青光眼DBA/2J小鼠的ONH中，Dnm1 mRNA显著增加1.56±0.06倍，在10月龄非青光眼C57BL/6小鼠中显著增加1.33±0.06倍增（n=8 ONHs/pool，,P（P）<0.05). 3月龄DBA/2J小鼠ONH、10月龄青光眼DBA/2J小鼠ONH和10月龄C57BL/6小鼠ONH的GAPDH mRNA与总RNA的比值没有差异（数据未显示）。
青光眼DBA/2J小鼠ONH中OPA1蛋白和基因表达或Dnm1基因表达的变化（A和B）OPA1免疫组织化学在无髓ONH中的表达。OPA1免疫反应性集中在3个月大小鼠的ONH中（A，星号）。相反，在10个月龄青光眼小鼠的ONH中观察到的OPA1免疫反应少得多（B，星号和箭头）。切片用核酸染色Hoechst 33342（蓝色）进行复染。（C） 10月龄青光眼DBA/2J小鼠ONH中OPA1 mRNA表达减少。10个月大的青光眼DBA/2J小鼠ONH中OPA1 mRNA表达显著降低。相反，10个月龄非青光眼C57BL/6小鼠ONH中OPA1 mRNA表达显著增加。（D） ONHs 10个月龄青光眼DBA/2J小鼠中Dnm1 mRNA表达增加。10月龄青光眼DBA/2J和10月龄非青光眼C57BL/6小鼠ONHds中Dnm1 mRNA表达显著增加。误差条表示标准偏差(*对<经Student t检验为0.05，3个月龄和10个月龄小鼠的n=3）。比例尺=50μm（A和B）。
眼压升高触发ONs线粒体OPA1释放
为了研究8个月龄和10个月龄青光眼小鼠整个ONs中OPA1从线粒体到胞浆的可能易位，采用Western blotting检测胞浆和线粒体部分OPA1浓度的相对变化。用肌动蛋白和VDAC抗体重制印迹，以分别评估含有细胞溶质或线粒体蛋白质的通道中的蛋白质负载。结果被归一化为肌动蛋白作为细胞溶质分数校准品，VDAC作为线粒体分数校准品。如所示OPA1抗体识别三种主要的OPA1亚型；3个月大的DBA/2J小鼠ON的细胞溶质部分中有一个90kDa（称为大或L型）、一个80kDa亚型（S1）和一个75kDa亚型（S2）。3个月龄小鼠ON的线粒体部分中鉴定出两个主要亚型（L和S1）。相比之下，8个月和10个月大的青光眼小鼠ON在细胞溶质组分中含有至少四种OPA1亚型，包括一种小亚型（~65 kDa:S3）。此外，所有四种亚型的OPA1相对含量在8个月大的ONs中显著增加了3.05±0.35倍（L）、4.15±0.39倍（S1）、1.52±0.16倍（S2）和11.4±1.25倍（S3），并增加了5.06±0.62倍（L分别在10个月大的青光眼小鼠的ONs中(P（P）<0.05,). 同时，线粒体亚型（L和S1）的相对OPA1含量在8只ONs中分别显著降低0.60±0.04倍（L）和0.53±0.04倍数（S1），在10月龄青光眼小鼠的ONs中则分别显著降低0.79±0.06倍（L(P（P）<0.05,).
青光眼DBA/2J小鼠ONs中OPA1分布的改变（A） OPA1蛋白质印迹分析细胞溶质和线粒体部分整个ON。OPA1蛋白带显示了OPA1的3种主要亚型的位置（90 kDa:L；80 kDa:S1；75 kDa:S2）。在8个月龄和10个月龄青光眼小鼠的ONs细胞溶质部分存在第四种OPA1蛋白带亚型（~65 kDa:S3）。细胞色素c蛋白带显示17 kDa形式的细胞色素c在细胞溶质和线粒体部分的位置。（B） 使用肌动蛋白（~42 kDa）作为细胞溶质部分校准物，使用电压依赖性阴离子通道（VDAC，~31 kDa。OPA1的L、S1和S2亚型在细胞溶质部分显著增加。相反，8月龄和10月龄青光眼小鼠的线粒体部分OPA1的L和S1亚型显著降低。细胞溶质部分的细胞色素c蛋白带显著增加。然而，8月龄和10月龄青光眼小鼠线粒体部分的细胞色素c蛋白带减少。误差条表示标准偏差(*P（P）通过Student t检验<0.05，3、8和10个月大的小鼠n=3）。
8个月龄和10个月龄青光眼小鼠的细胞色素c蛋白浓度分别显著增加1.79±0.18倍和2.89±0.3倍(P（P）<0.05,). 相比之下，8月龄和10月龄青光眼小鼠ONs线粒体部分的细胞色素c蛋白浓度分别显著降低至0.78±0.06倍和0.80±0.07倍(P（P）<0.05,).
讨论
这些结果表明，眼压升高的青光眼DBA/2J小鼠发生的ON变性会导致COX减少、线粒体分裂和异常嵴耗竭、OPA1和Dnm1表达的改变以及OPA1释放的诱导。这些发现表明线粒体功能障碍是导致青光眼患者压力相关RGC轴突丢失和ON变性的生化级联反应的原因之一。
越来越多的证据表明，线粒体的结构和功能动力学在细胞和动物生理学中发挥着重要作用。线粒体融合和分裂的控制失衡会显著改变线粒体的整体形态。10此外，最近的证据表明，线粒体过度分裂可导致线粒体网络破裂、线粒体DNA丢失和哺乳动物细胞的呼吸缺陷。49–51此前，我们报道了静水压升高导致线粒体分裂破坏线粒体网络，并在分化的RGC-5细胞中诱导异常嵴耗竭和细胞ATP减少在体外.5这表明这些细胞可能存在生物能量损伤。5,38,40,52目前的结果将这些发现扩展到体内模型。10月龄青光眼小鼠无髓ONH线粒体横截面平均长度显著降低，提示线粒体分裂。此外，EM断层扫描分析显示基质肿胀，嵴体积显著减少，包括没有嵴的区域，并且通过允许比传统EM显示更多体积，为线粒体裂变提供了更有力的证据。嵴膜的耗竭与我们发现的10个月大青光眼小鼠ONH中COX表达降低一致。此外，Dnm1表达增加的发现反映在观察到的线粒体分裂增加中。在10个月大的青光眼小鼠线粒体中观察到的3D结构的这些变化表明ATP生成减少和线粒体功能紊乱。最近的研究表明，ONH中的线粒体分布反映了无髓轴突与有髓层后轴突相比的不同能量需求，即ON的无髓部分可能比有髓后神经对线粒体衍生ATP的需求更大。53–55此外，线粒体衍生ATP的缺乏触发了Leber遗传性视神经病变中RGC的死亡。56结合这些发现，我们的观察结果表明ONH中的线粒体功能障碍在青光眼性视神经病变发病期间很重要。
在本研究中，眼压升高显著降低了10月龄青光眼小鼠ONH中OPA1 mRNA和蛋白的表达。最近的研究表明，OPA1蛋白存在于大鼠和人类的ONH以及小鼠、大鼠和人视网膜的RGC中，13–16OPA1的下调导致纯化的RGCs中线粒体网络的聚集，20这些变化与线粒体分裂、线粒体嵴耗竭和生物能量损伤有关。17,18,23因为在ADOA小鼠模型中OPA1缺乏会损害线粒体形态、ON结构和视觉功能，47,48观察到10个月龄青光眼小鼠眼压升高时ONH中OPA1基因和蛋白表达减少，这似乎反映在线粒体的结构和功能变化中，并可能促进ONH轴突的丢失。进一步支持这一观点的研究表明，OPA1表达增加通过阻止细胞色素c释放和稳定线粒体嵴形状来保护细胞免受凋亡。22,57
与OPA1相比，IOP升高显著增加了10月龄青光眼小鼠ONH中Dnm1 mRNA的表达。最近的证据表明，线粒体分裂与Drp-1从细胞质到线粒体膜上特定点的易位有关。10,50,58–60与这些先前的研究一致，我们报告称，在压力处理的细胞中，Drp-1蛋白在细胞溶质部分减少，但在线粒体部分增加，这表明在我们的模型中，Drp-1易位到线粒体有助于分化的RGC-5细胞中线粒体分裂的机制在体外静水压力升高后。5进一步的证据表明，抑制Drp-1介导的线粒体分裂选择性地阻止细胞色素c在凋亡过程中的释放。61连同这些发现，目前的结果表明，眼压升高导致ONH-Dnm1表达增加也可能导致线粒体的结构和功能改变，从而促进ON轴突的丢失。因此，增强OPA1在线粒体中的保留或抑制Drp-1介导的线粒体分裂的治疗可能提供一种新的策略，以防止青光眼的ON变性和RGC丢失。
作为年龄匹配的正常对照品系，我们对COX、OPA1和Dnm1 mRNA表达的评估中包括了10个月大的非月桂目C57BL/6小鼠。眼压未随年龄升高而升高（如图所示补充材料1). 虽然随着年龄的增长、衰老或细胞凋亡会发生一些线粒体变化，但4个月大的年轻成年大鼠和13个月大的中年大鼠的神经元线粒体似乎差异很小。62因此，年轻成熟正常小鼠（3月龄）和中年正常小鼠（10月龄）的神经元线粒体不太可能存在显著差异。将10月龄C57BL/6小鼠与3月龄和10月龄DBA/2J小鼠的结果进行比较。结果发现，COX mRNA在3月龄DBA/2J小鼠ONH中最大，在10月龄的C57BL/6小鼠ONH中低0.90倍，在10个月龄的DBA/2 J小鼠ONHs中低0.81倍。这一结果可能仅仅反映了后两组ONH中轴突的减少，因为这与之前关于正常C57BL/6小鼠中与年龄相关的轴突轻度丢失的报道一致63以及眼压升高小鼠的轴突加速丢失。28,43,64–66与3个月龄DBA/2J小鼠ONH中的OPA1 mRNA相比，10个月龄青光眼DBA/2J小鼠的OPA1 m RNA减少了0.65倍，而非10月龄C57BL/6小鼠的OPA1m RNA增加了1.46倍。由于这些差异的大小大于COX mRNA的相应差异，它们表明眼压升高与OPA1基因表达减少之间存在正相关。此外，他们增加了OPA1 mRNA表达变化先于IOP相关轴突丢失的可能性。与OPA1相比，Dnm1 mRNA（编码促进线粒体分裂的蛋白质）的表达在3个月龄的DBA/2J小鼠ONH中最少，在10个月龄DBA/2J小鼠ONH的表达最大。这与IOP的重要作用一致。在10个月大的C57BL/6小鼠ONH中Dnm1mRNA的中间表达可能反映了一种平衡，即在该菌株中OPA1mRNA的表达比在3个月大的DBA/2J小鼠中更为强烈。总之，这些结果支持了正常衰老和眼压升高对线粒体裂变/融合平衡向有利于裂变转变的重要影响。
线粒体分裂期间OPA1的释放参与了凋亡细胞的死亡。19,23与之前的研究一致，我们还发现静水压升高会触发OPA1和细胞色素c的释放，并诱导分化的RGC-5细胞随后的凋亡细胞死亡在体外.6在本研究中，眼压升高逐渐导致8个月龄和10个月龄青光眼小鼠ONs中OPA1从线粒体释放到胞浆。8个月龄ONs细胞液中的4种OPA1亚型的肌动蛋白正常浓度介于3个月龄和10个月龄的结果之间。这表明了细胞溶质OPA1增加的渐进性，这种增加在青光眼损害的进展过程中表现出来，并且进一步得到了3、8和10个月龄DBA/2J小鼠细胞溶质细胞色素c的渐进性增加的支持。线粒体部分中2种OPA1亚型的VDAC正常浓度的大幅降低可能反映出线粒体OPA1的变化更为剧烈，并先于细胞溶质OPA1和轴突存活的变化。相比之下，线粒体细胞色素c在8个月龄和10个月龄时同样减少。因此，眼压升高的青光眼ON中OPA1的释放可能通过介导异常线粒体结构损伤直接导致ON轴突丢失。除了OPA1释放到细胞质的证据外，眼压升高的眼ONs的胞浆部分也出现了一条小的免疫反应带（~65kDa）。菱形膜内蛋白酶PARL裂解OPA1蛋白，OPA1的裂解产生一个可溶解于膜间空间的截断OPA1池。67此外，可溶性OPA1可能对PARL的抗凋亡作用至关重要，因为它维持了嵴的瓶颈结构和细胞色素c的分区。22,67因此，目前观察到的出乎意料的较小分子量的OPA1片段可能包括定位于膜间空间的截短形式的OPA1，或者可能是降解产物之一。眼压升高后从ON线粒体释放的各种可溶性OPA1亚型的功能作用需要进一步研究。
总之，眼压升高导致COX活性降低、线粒体分裂、线粒体基质肿胀和嵴耗竭、OPA1和Dnm1表达改变，以及诱导青光眼ON线粒体释放OPA1。因此，这些发现支持了这样一种观点，即干预以防止线粒体裂变相关功能障碍可能有助于减少青光眼ON变性和RGC丢失。
致谢
NIH授予EY01466（JDL）、NCRR P41 RR004050（MHE）和EY105990（RNW）。
我们感谢日本东京大学的T.Misaka和日本国家生理学研究所的Y.Kubo提供了针对mOPA1的抗体，并感谢Jackson实验室的S.W.M.John对手稿的有益评论。
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