成年哺乳动物中枢神经系统（CNS）损伤后轴突不再生，这一现象归因于成年中枢神经系统的两个特性，即抑制性外部环境和成熟中枢神经细胞固有再生能力的减弱(1–4). 中和被确定为轴突再生抑制剂的细胞外分子只允许在体内有限程度的轴突再生(5–7). 因此，内在机制在控制轴突再生过程中可能很重要。神经元再生能力的可能机制来自控制细胞生长和大小的进化上保守的分子途径。对于大多数细胞类型，在发育完成后，需要特定的机制来防止细胞过度生长(8). 由于这些分子中的许多经常在有丝分裂后的成熟神经元中表达，我们推测它们可能导致成年中枢神经系统神经元再生能力下降。
为了避免单个细胞生长控制基因的生殖系敲除通常会导致小鼠生存能力受损的问题，我们设计了一种基于成年小鼠玻璃体内注射表达Cre（AAV-Cre）的腺相关病毒的策略。这一过程导致90%以上的视网膜神经节细胞（RGC）和少数其他非RGC细胞中Cre的表达，如两条报告线所示（图S1、A和B）。因此，我们将AAV-Cre注射到不同成年漂浮小鼠的玻璃体内，包括Rb飞行/飞行(9)，第53页飞行/飞行(9)、Smad4飞行/飞行(10)、Dicer飞行/飞行(11)、LKB1飞行/飞行(12)和PTEN飞行/飞行(13). 在注射AAV后2周（图S1C），这些动物接受了视神经挤压程序(14). 通过检测病变部位视神经切片中标记有霍乱毒素β（CTB）顺行示踪剂的轴突纤维，检测轴突再生。还通过用β-III微管蛋白抗体（TUJ1）进行免疫染色的视网膜整体染色或通过注射到上丘的FluoroGold进行预标记来估计神经元存活率。
在所检查的不同小鼠系中，PTEN（磷酸酶和紧张素同源物）缺失的小鼠系对神经元存活和轴突再生的影响最大。在所有PTEN中飞行/飞行TUJ1染色显示，注射AAV-Cre但不注射对照AAV-GFP（绿色荧光蛋白）的条件突变株，RGC的存活率显著增加(和图S1D）。用FluoroGold预先标记RGC，观察到神经元存活的程度相似（图S2）。此外，强大的长距离轴突再生(，以及图S3、A和B）。我们在另一组PTEN中重复了AAV-Cre实验飞行/飞行小鼠以及AAV-GFP注射液作为对照，观察到类似的结果。量化显示，约45%PTEN缺失的RGC在损伤后2周存活，而对照组存活率约为20%。在幸存的RGC中，约8至10%的RGC显示其受损轴突再生到距离病灶中心0.5 mm远的位置；一些延伸超过3mm(，以及图S3、A和B）。随着时间的推移，这些纤维继续沿着视神经再生。损伤后4周，一些再生纤维延伸至视交叉区(以及图S3、C和D）。在其他测试的小鼠系中，只有p53缺失的RGC显示神经元存活率增加，但没有轴突再生（图S1、D和E），这与诱导神经元存活不足以使轴突再生的概念一致(15). 因此，PTEN缺失可能作用于生存以外的内在机制，以促进损伤后轴突再生。
PTEN缺失促进RGC轴突再生(A类到D类)PTEN损伤后14天[（A）和（C）]或28天[（B）和（D）]，视神经共焦图像显示病变部位周围有CTB标记的纤维飞行/飞行注射AAV-Cre[（A）和（B）]或AAV-GFP[（C）和（D）]的小鼠。比例尺，100µm。(E类)量化病变部位远端不同距离处的再生纤维。对每只动物的至少五个不同部分（每四个部分）进行量化。在这两个时间点，通过Bonferroni的后验方差分析，在每一个距离处，对照组和PTEN缺失小鼠组之间都存在显著差异[P（P）14 dpc均<0.05(n个=7）和28 dpc(n个= 3)]. (F类)显示存活TUJ1的视网膜整体荧光显微照片+伤后14天的RGC。箭头，带扩大躯体的RGC；*，破碎场地；标尺，20µm。
接下来，我们检测了PTEN缺失RGC损伤后轴突伸长的时间进程。在病变部位，挤压后1至3天出现神经胶质反应，如硫酸软骨素蛋白多糖（CSPG）表达上调所示（图S4、a和B）和巨噬细胞浸润（图S5）。然而，神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）阳性星形胶质细胞在很大程度上被排除在病变部位之外，并且CSPG信号在损伤后7天恢复到低水平（图S4C）。挤压后1天，受损的视神经纤维终止于PTEN挤压部位的近端飞行/飞行注射AAV-GFP或AAV-Cre的小鼠（图S4A）。然而，在3 dpc时，PTEN缺乏的RGC的轴突萌芽开始穿透富含CSPG的病变部位（图S4、B和D以及图S5A），在病变部位7 dpc以外可以看到一些纤维（图S4、C和E以及图S5B）。相反，在这些阶段，对照动物的轴突萌芽最少（图S4、A至E、图S5、A和B）。电子显微镜分析证实，在野生型小鼠中，退化的RGC轴突、髓鞘碎片和巨噬细胞占据了损伤部位，几乎看不到再生纤维（图S5、C和E）。然而，当RGC中PTEN被删除时，损伤后不久，在损伤部位内部和远端均发现再生轴突芽，通常以束的形式出现（图S5、D和F）。这些结果表明PTEN缺失确实使轴突能够克服损伤部位的抑制作用，并在损伤后很快再生。
PTEN缺失激活PI3K/mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶点）通路，该通路通过调节cap依赖性蛋白翻译起始来控制细胞生长和大小(16，17)（图S6）。mTOR激酶的两个研究良好的靶点是核糖体S6激酶1（S6K1）（它反过来磷酸化核糖体蛋白S6）和真核生物起始因子4E（eIF4E）结合蛋白4E-BP1。我们使用磷酸化S6（p-S6）抗体来监测RGC中mTOR通路的活性。p-S6染色显示p-S6阳性RGC的百分比呈发育依赖性下降(). 在大多数胚胎神经元中可以看到强烈的p-S6信号，但在90%的成年RGC中减弱()这表明mTOR信号在大多数成年RGC中下调，只有一小部分保留相当多的mTOR活性。
RGC中p-S6信号的发育依赖性下降代表性图像(A类)和量化(B类)对不同年龄段小鼠视网膜神经节细胞层（GCL）的p-S6或TUJ1免疫反应进行免疫组化分析。比例尺，20µm。数据以p-S6的平均百分比表示+TUJ1公司+总TUJ1中的单元格+每个视网膜GCL中的细胞。与P7.*相比，P21和P60的百分比存在显著差异，P（P）<0.01，学生的吨测试。对每个年龄组三只小鼠的至少四个非连续切片进行细胞计数。
接下来，我们研究了轴突损伤是否会改变成年RGC中mTOR通路的活性和随后的蛋白质合成。在经历诸如缺氧等应激时，细胞会抑制mTOR信号(18–20)这是一种进化保守的应激反应，旨在维持能量平衡以维持生存。因此，我们假设轴索肌动蛋白触发的应激反应可能会减少受损神经元中的整体蛋白翻译。为了验证这一点，我们估计了来自对照组和受伤大鼠的纯化RGC中新蛋白质合成的速率（图S7和S8）。对照组和受伤的RGC与35S-甲胺/半胱氨酸，结果显示轴切RGC中新蛋白质合成显著减少（图S8）。
然后，我们用抗p-S6抗体的视网膜切片的免疫组织化学方法研究轴突损伤是否抑制了mTOR活性。轴突切断术几乎完全消除了对照小鼠在损伤后（1、3和7天）检测的所有时间点成年RGC中剩余的p-S6信号()表明轴切断触发所有神经元中mTOR活性的快速持续下调。在缺氧应激的细胞中，Redd1/2的上调（在发育和DNA损伤反应中调节1/2）参与mTOR的抑制(18–20). 然而，在轴切开术后的RGCs中，Redd1/2 mRNA水平没有改变（图S9），这表明除Redd1/2以外的机制介导了轴切开术后mTOR途径的抑制。
轴突切断降低对照组RGC中的p-S6水平，但不降低PTEN缺失的RGC中p-S6的水平(A类)野生型或PTEN视网膜切片抗p-S6或TUJ1抗体的免疫荧光分析飞行/飞行不同动物组注射AAV-GFP或AAV-Cre的小鼠。比例尺，20µm。(B类)p-S6的量化+RGC。数据以p-S6的平均百分比表示+TUJ1公司+总TUJ1中的单元格+每个视网膜GCL中的细胞。对每组三只小鼠的至少四个非连续切片进行细胞计数，P（P）经Dunnett检验<0.01。与未受损的对照视网膜进行比较。
接下来，我们评估PTEN缺失是否影响成年RGC损伤前后的mTOR活性。AAV-Cre注射并未显著增加未受损PTEN中被p-S6抗体染色的RGC的百分比飞行/飞行小鼠，这可能是由于AAV Cre注射和组织学分析之间的短间隔（2周）。然而，在视神经损伤后，在注射了AAV-Cre的PTEN中，在损伤后1、3或7天，p-S6阳性RGCs的比例相似飞行/飞行老鼠(). 因此，尽管轴切断后会产生应激反应，但这些PTEN缺失的神经元能够维持与未受损野生型神经元类似的mTOR活性水平。值得注意的是，再生纤维的百分比（8-10%）与p-S6阳性轴切RGC相似().
为了进一步评估p-S6阳性RGC和再生轴突的RGC之间的关系，我们将生物素化右旋糖酐-胺（BDA）注射到病变部位远端约2至2.5 mm的视神经区域。这种方法在损伤后14天在野生型小鼠的视网膜中产生少量BDA标记细胞（图S10A），这与野生型动物缺乏再生一致。在PTEN缺失的动物中，该程序平均标记每个视网膜共68个RGC，其中88%的标记RGC被p-S6抗体阳性染色（图S10）。这一结果表明，大多数再生纤维来自p-S6阳性RGC。
接下来，我们评估了激活mTOR对PTEN缺失的再生效应的必要性。给予雷帕霉素（一种mTOR抑制剂）显著降低RGC中的p-S6信号（图S11、E和F），并在很大程度上中和PTEN中观察到的存活和再生飞行/飞行注射AAV-Cre的小鼠（图S11，A至D）。虽然在用雷帕霉素治疗的PTEN缺失小鼠中观察到的残余轴突再生可能反映了PTEN下游其他通路的可能参与，但这些结果表明，mTOR激活在PTEN缺失的影响中起着重要作用。
为了进一步研究mTOR通路的激活是否足以促进轴突再生，我们在TSC1中建立了视神经损伤模型飞行/飞行（结节性硬化综合征1）条件性敲除小鼠(21). TSC1/2形成一种蛋白质复合物，负调控mTOR信号传导，TSC1或TSC2的缺失导致mTOR通路的组成性激活(22–24)（图S6）。如预期，在AAV-Cre中-注入TSC1飞行/飞行小鼠，在轴切RGC中观察到强烈的p-S6信号()伤后RGC存活率提高(). 更重要的是，大量轴突再生()在TSC1缺失的小鼠中观察到，但在注射AAV-Cre的野生型小鼠中没有观察到。TSC1缺失小鼠的轴突再生程度略弱于PTEN缺失诱导的轴突再生程度（比较，至). 再加上观察到一些p-S6阴性RGC被BDA标记到病变远端的视神经上（图S10），并且在用雷帕霉素治疗的PTEN缺失小鼠中观察到残余再生（图S11），这些结果表明PTEN的其他下游靶点，如Akt和GSK-3的变化(25，26)也可能有助于再生生长。然而，这些数据共同表明，mTOR通路的激活足以促进RGC存活和轴突再生。
TSC1缺失促进视神经损伤后RGC存活和轴突再生(A类)野生型或TSC1病变部位的视神经共焦图像飞行/飞行挤压后14天注射AAV-Cre的小鼠。比例尺，100µm。(B类)不同组再生纤维的量化。根据Student’s吨在每个距离进行测试(P（P）< 0.05). (C类)显示存活TUJ1特征的视网膜整体荧光显微照片+RGC。箭头，带扩大躯体的RGC；*，破碎场地；比例尺，20µm。(D类)14dpc时RGC存活率，表示为TUJ1总数的百分比+未受损视网膜中的RGC。*，P（P）<0.05，学生的吨测试。（E） 注射野生型或TSC1的AAV-Cre视网膜切片的免疫荧光分析飞行/飞行在损伤后14天用p-S6或TUJ1抗体对小鼠进行治疗。比例尺，20µm。
我们的发现揭示了mTOR通路和蛋白质翻译的调节在决定受损CNS神经元内在轴突再生反应性中的重要作用。在轴索切断的成年神经元中，这条通路被深度抑制，这可能会限制持续轴突再生所需的新蛋白质合成。通过沉默成年神经元中的PTEN或TSC1来激活mTOR通路可诱导广泛的轴突再生，这表明在轴切成熟神经元中保留活性蛋白合成足以启动轴突再生的神经元再生程序。鉴于PTEN特定化学抑制剂的可用性(27)这些策略和其他策略可能在CNS损伤后暂时使用，以防止蛋白质合成下调，促进轴突再生和功能恢复。
