生物化学杂志。 2009年1月30日； 284（5）：2719–2728。
JNK1依赖的Bcl-2磷酸化在神经酰胺诱导中的作用 自噬 * S⃞ , ‡ § , ‡ § , ¶ ∥ , ¶ ∥ , ** ‡‡ §§ 和 ‡ §, 1
苏菲·帕丁格 ‡ INSERM U756， § 法国巴黎南11大学 de Pharmacie，5 rue Jean-Baptiste Clément，92296 法国马拉布里酒庄， ¶ INSERM U858、， ∥ 莫莱库莱尔医学研究所 法国图卢兹31000号图卢兹第三大学Rangueil和 ** 霍华德·休斯医学院和各部门 属于 ‡‡ 内科和 §§ 德克萨斯大学微生物学 德克萨斯州达拉斯市达拉斯西南医疗中心75390
香塔尔·鲍维 ‡ INSERM U756， § 法国巴黎南11大学 de Pharmacie，5 rue Jean-Baptiste Clément，92296 法国马拉布里酒庄， ¶ INSERM U858、， ∥ 莫莱库莱尔医学研究所 法国图卢兹31000号图卢兹第三大学Rangueil和 ** 霍华德·休斯医学院和各部门 属于 ‡‡ 内科和 §§ 德克萨斯大学微生物学 德克萨斯州达拉斯市达拉斯西南医疗中心75390
斯特凡·卡彭蒂尔 ‡ INSERM U756， § 法国巴黎南11大学 de Pharmacie，5 rue Jean-Baptiste Clément，92296 法国马拉布里酒庄， ¶ INSERM U858、， ∥ 莫莱库莱尔医学研究所 法国图卢兹31000号图卢兹第三大学Rangueil和 ** 霍华德·休斯医学院和各部门 属于 ‡‡ 内科和 §§ 德克萨斯大学微生物学 德克萨斯州达拉斯市达拉斯西南医疗中心75390
蒂埃里·利瓦德 ‡ INSERM U756， § 法国巴黎南11大学 de Pharmacie，5 rue Jean-Baptiste Clément，92296 法国马拉布里酒庄， ¶ INSERM U858、， ∥ 莫莱库莱尔医学研究所 法国图卢兹31000号图卢兹第三大学Rangueil和 ** 霍华德·休斯医学院和各部门 属于 ‡‡ 内科和 §§ 德克萨斯大学微生物学 德克萨斯州达拉斯市达拉斯西南医疗中心75390
贝斯·莱文 ‡ INSERM U756， § 法国巴黎南11大学 de Pharmacie，5 rue Jean-Baptiste Clément，92296 法国马拉布里酒庄， ¶ INSERM U858、， ∥ 莫莱库莱尔医学研究所 法国图卢兹31000号图卢兹第三大学Rangueil和 ** 霍华德·休斯医学院和各部门 属于 ‡‡ 内科和 §§ 德克萨斯大学微生物学 德克萨斯州达拉斯市达拉斯西南医疗中心75390
帕特里斯·科多诺 ‡ INSERM U756， § 法国巴黎南11大学 de Pharmacie，5 rue Jean-Baptiste Clément，92296 法国马拉布里酒庄， ¶ INSERM U858、， ∥ 莫莱库莱尔医学研究所 法国图卢兹31000号图卢兹第三大学Rangueil和 ** 霍华德·休斯医学院和各部门 属于 ‡‡ 内科和 §§ 德克萨斯大学微生物学 德克萨斯州达拉斯市达拉斯西南医疗中心75390
‡ INSERM U756， § 法国巴黎南11大学 de Pharmacie，5 rue Jean-Baptiste Clément，92296 法国马拉布里酒庄， ¶ INSERM U858、， ∥ 莫莱库莱尔医学研究所 法国图卢兹31000号图卢兹第三大学Rangueil和 ** 霍华德·休斯医学院和各部门 属于 ‡‡ 内科和 §§ 德克萨斯大学微生物学 德克萨斯州达拉斯市达拉斯西南医疗中心75390
收稿日期：2008年7月31日； 2008年11月3日修订
补充资料 [补充数据]
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摘要 大自噬是一种受刺激的空泡溶酶体分解代谢途径 在营养缺乏期间保持细胞完整性。 神经酰胺是 一种与多种细胞过程相关的生物活性鞘脂。 在这里 我们证明了短链神经酰胺（C 2 -神经酰胺和 C类 6 -神经酰胺）和刺激 从头开始 神经酰胺 三苯氧胺的合成诱导了在 自噬蛋白Beclin 1和抗凋亡蛋白Bcl-2。 这个 解离是诱导大细胞自噬的必要条件 神经酰胺或饥饿。 三个潜在的磷酸化位点， 瑟 69 ，序列号 70 和Ser 87 ，位于 Bcl-2的非结构N末端环在解离中起主要作用 来自Beclin 1的Bcl-2。 我们进一步表明c-Jun N末端的激活 神经酰胺的蛋白激酶1是磷酸化Bcl-2和 刺激大量自噬。 这些发现揭示了鞘磷脂的一个新方面 上调参与细胞适应的主要细胞过程的信号转导 压力。
巨自噬（以下称为“自噬”）是一种 胞质成分的液泡、溶酶体降解途径 在真核细胞中保守 ( 1 – 三 ). 自噬由多膜结合的自噬体的形成启动 吞噬细胞质蛋白质和细胞器。 中的最后一个阶段 该过程导致与溶酶体室融合，其中 自噬货物发生降解。 基础自噬在 通过去除受损的细胞器和 蛋白质聚集体。 抑制大脑中的基础自噬是有害的， 并导致小鼠模型的神经退化 ( 4 , 5 ). 自噬刺激 在营养缺乏期间 已经证明，它能为新生幼犬的各种组织提供能量 ( 6 ). 在培养细胞中， 饥饿诱导的自噬是一种自主的细胞生存机制 提供营养以维持代谢率和ATP兼容水平 细胞存活( 7 ). 在 此外，饥饿诱导的自噬阻断了细胞凋亡的诱导 ( 8 ). 在其他情况下，例如 药物治疗和缺氧环境下，自噬也被证明是 癌细胞的细胞保护作用 ( 9 , 10 ). 然而，自噬是 在某些情况下也是细胞死亡途径的一部分 ( 11 ). 自噬可以是 凋亡非依赖性2型细胞死亡（1型细胞死亡 凋亡），也称为自噬细胞死亡。 这种情况已经显示出来 当哺乳动物细胞中的凋亡机制受损时发生 ( 12 , 13 ). 自噬也可以 凋亡程序的一部分，例如肿瘤坏死 NF-κB被抑制时因子-α诱导细胞死亡 ( 14 )，或人类 免疫缺陷病毒包膜介导的旁观者单纯CD4 T细胞死亡 单元格( 15 ). 此外，自噬 最近已经证明需要外部化 吞噬细胞表面的eat-m信号磷脂酰丝氨酸 凋亡细胞( 16 ).
自噬和凋亡之间的复杂关系反映了 这些过程的相互交织的调节 ( 17 , 18 ). 许多信号通路 参与调节自噬也调节细胞凋亡。 这个 最近研究表明，缠结发生在分子水平 自噬机制。 事实上，抗凋亡蛋白Bcl-2已经 显示通过与 自噬蛋白Beclin 1 ( 19 ). Beclin 1是 从酵母到人类保守的Atg蛋白（它是 酵母Atg6）并参与自噬体的形成 ( 20 ). Beclin 1是一个平台 与多种不同伙伴相互作用的蛋白质，包括hVps34 （III类磷脂酰肌醇3-激酶），负责 磷脂酰肌醇3-磷酸的合成。 这种脂质的产生是 对与隔离膜成核相关的事件很重要 在它伸长并闭合形成自噬体以响应其他Atg之前 蛋白质，包括Atg12和 生命周期3 2 （微管相关蛋白轻链3是 酵母Atg8）泛素样结合系统 ( 三 , 21 ). 各种合作伙伴 与Beclin 1复合物相关联调节hVps34的活性。 对于 例如，Bcl-2抑制该酶的活性，而UVRAG、Ambra-1、， 和Bif-1都能调节它 ( 22 , 23 ).
鉴于自噬和凋亡之间的相互交织 值得注意的是，Beclin 1属于BH3-唯一的蛋白质家族 ( 24 – 26 ). 然而，与这个家族中的大多数蛋白质不同，Beclin 1不能 当其在细胞中强制表达时触发细胞凋亡 ( 27 ). 一种BH3-模拟药物， ABT-737能够解离Beclin-1-Bcl-2复合物，并触发 反映饥饿影响的自噬 ( 25 ).
鞘磷脂是一类生物活性脂类 ( 28 – 32 ) 其中一些成员，如神经酰胺和1-磷酸鞘氨醇，是 信号分子。 这些分子构成“鞘脂 “变阻器”决定电池的命运，因为在许多情况下 神经酰胺是促凋亡的，1-磷酸鞘氨醇可以减轻这种凋亡 效果( 31 , 32 ). 然而，神经酰胺也是 参与多种其他细胞过程，例如 外泌体( 33 ), 分化、细胞增殖和衰老 ( 34 ). 最近我们展示了 神经酰胺和1-磷酸鞘氨醇都能刺激自噬 ( 35 , 36 ). 它也已显示 神经酰胺在一大片哺乳动物细胞中触发自噬 ( 37 – 39 ). 然而，神经酰胺刺激自噬机制的阐明 仍处于初级阶段。 我们之前已经证明神经酰胺可以诱导 通过抑制I类蛋白在乳腺癌和结肠癌细胞中的自噬作用 磷脂酰肌醇3-磷酸/mTOR信号通路 抑制自噬的作用 ( 36 ). mTOR的抑制是 饥饿诱导自噬的另一个特征 ( 17 ). 这一发现使我们 研究神经酰胺对Beclin 1-Bcl-2复合物的影响。 结果 这里展示的是神经酰胺在 分离Beclin 1-Bcl-2复合物（参见参考文献。 40 ). 这种分离是 依赖于三个磷酸化位点（Thr 69 ，序列号 70 , 和Ser 87 )位于Bcl-2的非结构回路中。 神经酰胺 诱导Bcl-2的c-Jun N末端激酶1依赖性磷酸化。 显性阴性形式JNK1的表达阻断Bcl-2磷酸化， 因此神经酰胺可以诱导自噬。 这些发现有助于 解释脂质第二信使是如何调节自噬的。
材料和方法 试剂 -C 2 -证书，C 6 -证书， C类 2 -DHCer和C 6 -DHCer来自Sigma 使用前溶解在乙醇中。 FB1、Myriocin和TAM购自 生物摩尔。 细胞培养基、Lipofectamine 2000和胎牛血清 来自Invitrogen。 放射性同位素 我 -[美]- 14 C] 缬氨酸（256 mCi/mmol）、ECL™蛋白质印迹检测试剂盒和驴 抗兔抗体购自Amersham Biosciences。 山羊抗鼠 从Bio-Rad和Caltag中获得猪抗羊抗体 （加利福尼亚州伯林盖姆）。 小鼠单克隆抗p62抗体 从BD Biosciences获得。 小鼠单克隆抗Bcl-2和山羊多克隆 抗Beclin 1抗体从圣克鲁斯生物技术公司（Santa Cruz Biotechnology）获得 加利福尼亚州克鲁兹）。 抗p-Bcl-2、p-JNK和总JNK的兔单克隆抗体 从细胞信号学中获得。 兔多克隆抗Beclin 1抗体 来自Novus Biologicals。 兔多克隆抗LC3抗体为 如前所述获得 ( 41 ).
细胞培养 -人乳腺癌细胞系MCF-7细胞 稳定转染 贝克林1 （MCF7。 贝克林1 )是 如前所述培养 ( 42 ). 获得HeLa细胞 来自ATCC，并在10%CO中保持在37°C 2 在Dulbecco家 添加5%胎牛血清和100 ng/ml的改良Eagle's培养基 青霉素和链霉素各一种。 HeLa GFP-LC3细胞，由A提供。 M.Tolkovsky（英国剑桥大学）在 200微克/毫升G418。 人类结肠癌细胞系HT-29转染了 带有空向量或编码Bcl-2的向量由M.T提供。 Dimanche-Boitrel（INSERM U620，法国），并在37°C培养10% 一氧化碳 2 在Dulbecco改良的Eagle培养基中添加10% 胎牛血清和青霉素、链霉素各100ng/ml加200 μg/ml G418。 MEF WT和Atg5–/–由N。 水岛（日本东京医科牙科大学），培养为 前面描述过( 6 ). 这个 台盼蓝排斥试验显示细胞活力大于90% 在所有使用的实验条件下。
内源性神经酰胺的定量 -神经酰胺是 使用确定 大肠杆菌 先前报道的DAG激酶 ( 43 ). 这个 大肠杆菌 菌株由D.K.Perry博士和Y.A.Hannun（医学 南卡罗来纳大学查尔斯顿分校）。
Beclin 1和Bcl-2协同免疫沉淀 -收件人 HeLa细胞中免疫沉淀内源性Beclin 1和内源性Bcl-2或 将Beclin 1稳定转染MCF.7细胞，在CHAPS中进行细胞裂解 裂解缓冲液（20 m 米 Tris，pH 7.4137 m 米 氯化钠，2 米 米 EDTA、10%甘油和2%CHAPS）在4°C下保持3小时，以及 在4℃下用山羊多克隆进行免疫沉淀过夜 抗体（1:80稀释，Santa Cruz Biotechnology）。 蛋白质A-琼脂糖珠 在4°C下添加（Amersham Biosciences）2 h，用137清洗两次 米 米 NaCl CHAPS清洗缓冲液（20 m 米 Tris，pH 7.4，137 米 米 氯化钠，2米 米 EDTA、10%甘油和0.5%CHAPS），以及 两次，274 m 米 NaCl CHAPS清洗缓冲液。 抗褪色1 免疫沉淀物经过SDS-PAGE，Bcl-2通过 免疫印迹分析( 19 ).
GFP-LC3分析 -该试验在HeLa细胞中进行 稳定转染大鼠GFP-LC3（由大阪吉森提供 日本大学）或瞬时转染MCF-7。 贝克林 1 使用Lipofectamine 2000的HT-29和HeLa细胞 ( 19 , 42 ). HeLa细胞也 转染人GFP-LC3B或突变型GFP-LC3 BΔG（善意地 由东京国立传染病研究所I.Tanida提供， 日本）。 载体pcDNA3-FLAG-MKK7-JNK1（APF）（显性阴性JNK1， dnJNK1），由R.J.Davis（霍华德·休斯医学研究所）提供 ( 44 ). 需要时， 用编码GFP-LC3的质粒和编码 在MCF-7中执行dnJNK1或空载体pcDNA3。 贝克林1 细胞（比率GFP-LC3:载体，1:3）。 分析之前，细胞处于饥饿状态 在Earle的平衡盐溶液（EBSS，饥饿培养基）中放置4小时， 保存在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中 （控制介质），或按文中所述处理。 自噬当时 用GFP-LC3点状细胞进行光镜计数 如前所述( 42 ). 一个 每个样品中至少有50–100个细胞被计数为三份样品 每个实验的条件。
蛋白质降解分析 -培养HT-29细胞 以0.2μCi/ml在37°C下持续24小时 我 -[ 14 C] 缬氨酸。 在放射标记期结束前三小时，细胞暴露于 C浓度增加 2 -Cer或C 2 -DHCer和 需要时100 n 米 添加FB1，也是在 放射性标记。 在放射性标记期结束时，将细胞洗涤三次 PBS，pH 7.4。 然后将细胞培养在完全培养基中 补充10m 米 冷缬氨酸。 孵育1小时后 当短寿命蛋白质降解时，培养基被替换为 新鲜无营养培养基（EBSS加0.1%牛血清白蛋白和10 米 米 冷缬氨酸），并继续培养 4h。4h培养基中的细胞和放射性标记蛋白 在最终浓度为10%（v/v）的三氯乙酸中沉淀 4°C。 沉淀的蛋白质从可溶性蛋白质中分离出来 600×离心辐射 克 10分钟，然后 溶于0.5 ml 0.2 n个 氢氧化钠。 放射性测定方法 液体闪烁计数。 蛋白质降解通过除以 通过 细胞和培养基沉淀蛋白中的放射性 ( 45 ).
免疫印迹法 -经SDS-PAGE溶解后，蛋白质 转移到硝化纤维素膜上。 膜被堵住了 在室温下，在PBST（PBS和0.1%吐温20）中加入5%的脱脂干乳1小时 温度，然后与适当的一级抗体孵育 在4°C的PBST中过夜。抗体稀释如下： 抗LC3 1:10000； 抗JNK1-P（Thr 183 /Tyr公司 185 ), 抗JNK1、抗Bcl-2-P（Ser 70 )，抗Bcl-2 1:1000； 抗p62 1:2000； anti-Beclin 1 1:2000； 抗肌动蛋白1:5000）。 在PBST中清洗三次后 在室温下用合适的 辣根过氧化物酶标记的二级抗体。 结合抗体 使用ECL检测。
统计分析 -差异的统计分析 使用Student’s t吨 测试。 第页 <0.05被认为具有统计学意义。
结果 神经酰胺在几种细胞系中诱导自噬 -我们有 此前报道，渗透短链C 2 -神经酰胺 （C） 2 -Cer）诱导MCF-7乳腺癌细胞和乳腺癌细胞的自噬 HT-29结肠癌细胞内源性长链的产生 神经酰胺类( 36 ). 自噬是 通过电子显微镜监测和通过测量自噬通量 长寿命蛋白质降解速率分析 3-甲基腺嘌呤，自噬体形成的抑制剂 ( 46 ). 在第一个系列中 实验中，我们通过分析HeLa GFP-LC3细胞 形成GFP-LC3点。 在自噬过程中，LC3蛋白被重新定位到 C末端结合的自噬体膜 磷脂酰乙醇胺。 因此，GFP-LC3点的积累提供了 检测自噬体的有效方法 ( 47 ). C类 2 -证书 处理诱导HeLa GFP-LC3细胞中GFP-LC3puncta的积累， 而用C治疗 2 -二氢神经酰胺（C 2 -DHCer），a C类 2 -在MCF-7和HT-29中不诱导自噬的Cer类似物 单元格( 36 )，未能执行此操作 ( ). 要检查 GFP-LC3突起的形成是对C的反应 2 -Cer不是 仅仅是由于C诱导的嵌合蛋白聚集 2 -证书 治疗后，我们在转染了突变体的细胞中重复了实验 GFP-LC3ΔG，不能支持自噬体的形成 ( 48 ). 在这些条件下， 突变嵌合蛋白对 C类 2 -Cer处理( ). 此外，C 2 -Cer也无法 诱导Atg5中的GFP-LC3点 –/– MEF细胞 （补充图S1 一个 )缺乏必需的自噬蛋白 附件5( 49 ). 不同于 C类 2 -证书，C 2 -DHCer在wt-MEF中没有诱导自噬 （补充图S1 一个 ). GFP-LC3点状蛋白的积累也是 在MCF-7中观察到。 贝克林1 细胞。 该细胞系由 具有低水平Beclin 1表达的MCF-7细胞群，并提供 研究自噬的便捷工具，因为 Beclin 1受Tet-OFF系统控制 ( 50 ). 如果没有 我们观察到C 2 -Cer，但不是C 2 -DHCer、， 诱导GFP-LC3穿孔的形成（补充图S2 一个 ). 收件人 确认C诱导的GFP-LC3点的形成 2 -Cer是 确实是由于自噬途径的刺激， 即 到 自噬体的形成和自噬的消耗增加 溶酶体室，我们分析了C 2 -二级证书 自噬通量、p62降解和 [ 14 C] 缬氨酸标记的长寿蛋白质。 在HeLa GFP-LC3细胞中，我们 观察到p62蛋白是饥饿诱导自噬的底物 ( 51 )，也是一样 在无营养培养基（EBSS）中降解，如在C中 2 -Cer-处理细胞 ( ). 在 相反，用完全培养基（CM）或C处理的细胞 2 -DHCer公司 无法刺激p62降解 ( ). 在 MCF-7。 贝克林1 单元格，C 2 -Cer处理增加了 对3-甲基腺嘌呤敏感的长寿命蛋白质的降解（补充 图S2 B类 ).
C类 2 -Cer诱导HeLa细胞自噬。 一个 、希拉 GFP-LC3细胞在EBSS或完全培养基中培养4h ( 厘米 )单独或补充100μ 米 C类 2 -Cer或100μ 米 C类 2 -DHCer公司。 左侧 面板 ，通过用 GFP-LC3点。 所示结果代表了三个独立的 实验。 每次分析50–100个细胞。 右侧面板 , 代表性图像。 B类 ，HeLa细胞被质粒转染 编码人GFP-LC3 WT或人GFP-LC 3ΔG。 转染后24小时， 将细胞置于EBSS或完全培养基中4小时( 厘米 ), 单独或补充100μ 米 C类 2 -证书或 100 μ 米 C类 2 -DHCer公司。 通过计数定量自噬 带有GFP-LC3或GFP-ΔG点的细胞数量。 显示的结果是 三个独立实验的代表。 50–100个细胞 每次分析。 所示结果代表了三个独立的 实验。 C类 ，HeLa细胞放置在EBSS，CM中4 h，100 μ 米 C类 2 -Cer或100μ 米 C类 2 -DHCer公司。 使用 抗p62抗体（1:2000）或抗肌动蛋白抗体（1:5000）。 D类 , DAG法测定内源性长链神经酰胺 在“材料和方法”下。报告的值是平均值 ±三个独立实验的S.D.。*， 第页 < 0.05 与 厘米。
我们以前的结果表明，自噬的诱导依赖于 C的伸长率 2 -Cer形成长链神经酰胺 ( 36 ). HeLa GFP-LC3中 ( )、MEF （补充图S1 B类 )和MCF-7。 贝克林1 细胞 （补充图S2 C类 )长链神经酰胺的积累 C后观察 2 -Cer处理。 伸长步骤取决于 神经酰胺合成酶活性对FB1敏感 ( 52 ). 在所有细胞系中 使用，FB1处理（100 n 米 )阻止了 C类 2 -证书和证书 2 -Cer诱导的自噬 ( 和补充图。 S1和S2）。 与我们之前的发现一致 ( 35 , 36 )，这些结果强烈 表明内源性长链神经酰胺是 自噬。
为了进一步证实长链神经酰胺在自噬中的作用，我们 使用短链C重复上述实验 6 -Cer，其中 是生成长链鞘氨醇骨架的良好基质 神经酰胺类( 53 ). 我们发现了 将HeLa GFP-LC3细胞暴露于100μ 米 第页，共页 6 -证书（适用于 4 h）通过计算自噬的数量评估自噬显著增加 每个细胞的穿孔数( ). 相反，它的非活动对应物， C类 6 -DHCer无法调节自噬 ( ). 在 在这些实验过程中，我们观察到长链的积累 C中的神经酰胺 6 -Cer-treated细胞。 FB1治疗再次受阻 C的伸长率 6 -证书 ( )和 C类 6 -Cer诱导的自噬（数据未显示）。 自噬刺激 当 C类 6 -Cer的使用浓度较低（40μ 米 )的 不同时间段（补充图S3）。 C类 6 -Cer也是 通过分析 长期蛋白质降解（数据未显示）。 我们之前已经表明 他莫昔芬（Tam）和1-苯基-2-癸酰氨基-3-吗啉-1-丙醇刺激 通过增加内源性长链神经酰胺水平实现MCF-7的自噬 ( 36 ). 这些治疗都是 增加长链神经酰胺的形成 刺激 从头开始 ER中的神经酰胺合成，或通过 抑制神经酰胺向葡萄糖基神经酰胺的转化 ( 36 , 54 ). 这里我们展示了Tam和 1-苯基-2-癸酰氨基-3-吗啉-1-丙醇刺激的自噬 ( )和 增加长链神经酰胺的形成 ( )在 HeLa-GFP-LC3细胞。 此外，Myriocin是丝氨酸的一种有效抑制剂 棕榈酰转移酶是 从头开始 神经酰胺的合成( 52 ), 阻断自噬和长链神经酰胺的积累 Tam处理的HeLa GFP-LC3细胞( ).
C类 6 -Cer诱导HeLa细胞自噬。 一个 、希拉 GFP-LC3细胞在EBSS或完全培养基中培养4h ( 厘米 )单独或补充100μ 米 C类 6 -Cer或C 6 -DHCer公司。 左侧面板 ，自噬是 通过用GFP-LC3点计数细胞数量进行量化。 结果 所示为三个独立实验的代表。 50–100个单元格 每次分析的结果。 右侧面板 ，具有代表性的图像。 B类 ，HeLa GFP-LC3细胞与CM一起培养24小时，1 μ 米 Tam，或1μ 米 Tam加100 n 米 粘蛋白或2.5μ 米 1-苯基-2-癸酰基氨基-3-吗啉-1-丙醇。 左侧面板 , 通过计数带有GFP-LC3点的细胞数量来量化自噬。 所示结果代表了三个独立的实验。 每次分析50–100个细胞。 显示的结果具有代表性 三个独立实验的结果。 右侧面板 ，具有代表性的图像。 C类 ，内源性长链神经酰胺的定量，通过DAG as 在“材料和方法”中描述。报告的值是 三个独立实验的平均值±S.D。 星号 表明 第页 < 0.05 与 厘米。
在之前的研究中，我们证明神经酰胺通过以下途径刺激自噬 干扰关键调节器mTOR上游Akt/PKB的激活 自噬信号( 36 ). 然而，我们想知道神经酰胺是否也可以通过直接刺激自噬 调节与自噬体有关的Atg机制的活性 形成。
神经酰胺诱导Beclin 1-Bcl-2解离 复杂 -自噬受到 Beclin 1复合物启动自噬体的形成 ( 22 , 23 ). 在这个综合体中 抗凋亡蛋白Bcl-2抑制自噬。 Beclin的离解 1-Bcl-2复合物刺激自噬，无论是由饥饿还是 对BH3模拟分子的反应 ( 19 , 25 ). 然而 Beclin 1-Bcl-2复合物调节中的脂质介质尚不清楚。 我们 使用表达Beclin 1和 Bcl-2研究神经酰胺对Beclin 1解离的影响 和Bcl-2。 类似于饥饿（参见参考。 19 和 ), 免疫共沉淀实验表明，当C 2 -证书或 C类 6 -将Cer添加到细胞中，使Beclin 1-Bcl-2解离 复合物与自噬的诱导一起被观察到。 C类 2 -DHCer和C 6 -DHCer在 这里所用的实验条件，也没有使络合物分离 ( ).
神经酰胺在HeLa细胞中诱导Beclin 1-Bcl-2复合物解离。 一个 ，HeLa细胞在EBSS或完全培养基中培养4h ( 厘米 )单独或补充100μ 米 C类 6 -证书，C 6 -DHCer，C公司 2 -证书，或 C类 2 -DHCer公司。 用山羊免疫沉淀内源性Beclin 1 多克隆抗体（1:80稀释）。 免疫沉淀蛋白 使用多克隆抗Bcl-2抗体进行免疫印迹。 裂解物 使用多克隆抗Bcl-2或多克隆抗Beclin 1进行免疫印迹 抗体。 B类 ，HeLa细胞在EBSS或 CM，单独或补充1μ 米 Tam或1 μ 米 Tam加100 n 米 粘蛋白。 内源性Beclin 1是 使用山羊多克隆抗体（1:80稀释）进行免疫沉淀。 免疫沉淀蛋白使用 多克隆抗Bcl-2抗体。 使用多克隆对裂解产物进行免疫印迹 抗Bcl-2或多克隆抗Beclin 1抗体。 西方斑点是 三个独立实验的代表。
为了证实长链神经酰胺确实对 Beclin 1-Bcl-2复合物的解离，我们接下来研究其影响 Tam的。 我们观察到Beclin 1-Bcl-2复合物在 Tam处理的细胞与GFP-LC3斑点的积累相关 ( ). 此外， 当Myriocin，丝氨酸棕榈酰转移酶的抑制剂 神经酰胺生物合成( 52 ), 存在时，Tam不再诱导Beclin 1-Bcl-2复合物的解离； 即 酪氨酸通过Tam-treated减少GFP-LC3点的形成 单元格( ). 发件人 这些发现，我们得出结论，长链神经酰胺的积累 通过促进Beclin 1-Bcl-2的分解刺激自噬 复杂。
Bcl-2表达对Beclin 1-Bcl-2复合物的影响 -我们 接下来想了解Bcl-2表达的调节是否减轻 C的自噬反应 2 -证书。 为此，我们使用HT-29结肠 癌细胞系，我们之前曾报道对其敏感 饥饿诱导的自噬和C 2 -Cer诱导的自噬 ( 36 , 55 ). 此外，这个细胞系 表达Beclin 1，但未检测到Bcl-2水平 ( 19 ). 按照 以前发布的结果 ( 19 )，当Bcl-2稳定时 在该细胞系中表达，阻断Beclin 1-Bcl-2复合物是 观察到的( )作为 以及抑制饥饿诱导的自噬 GFP-LC3点较少( )不刺激长期蛋白质降解 ( ). 在 对比度，C 2 -Cer能够触发自噬，如 GFP-LC3斑点数量增加，并刺激长寿蛋白 HT-29-Bcl-2细胞中的降解( ). 通过刺激自噬 C类 2 -HT-29-Bcl-2细胞中Cer的特征是分离 Beclin 1-Bcl-2复合体( ). 与C相比 2 -证书， C类 2 -DHCer既没有诱导Beclin 1-Bcl-2的解离 复杂( )也不是 HT-29-Bcl-2细胞中触发的自噬 ( ). 这些结果表明，在以下条件下 Bcl-2抑制饥饿诱导的自噬，神经酰胺能够克服这一点 抑制作用。 这些结果通过分析解离得到了证实 Beclin 1-Bcl-2复合物，以及GFP-LC3点的形成 MCF-7。 贝克林1 用Myc-tagged形式的 Bcl-2型( ). 在这个 饥饿不会导致Beclin 1-Bcl-2复合物的解离 但与对照组相比，确实刺激了GFP-LC3点的形成 未转染细胞（参见参考文献。 19 , 40 和 ). 相反，C 2 -Cer确实触发了这两个 MCF-7的自噬和Beclin 1-Bcl-2复合物解离。 贝克林1 表达Myc-Bcl-2的细胞( ).
C类 2 -Cer诱导自噬和Beclin/Bcl-2复合物 HT-29细胞中的解离。 一个 ，培养HT-29 Bcl-2细胞 在EBSS或完全培养基中培养4小时( 厘米 )补充100 μ 米 C类 2 -Cer或100μ 米 C类 2 -DH（决断高度） 证书。 使用山羊多克隆免疫沉淀内源性Beclin 1 抗体（1:80稀释）。 免疫沉淀蛋白 使用多克隆抗Bcl-2抗体进行免疫印迹。 裂解物为 使用多克隆抗Bcl-2或多克隆抗Beclin 1进行免疫印迹 抗体。 B类 ，蛋白质水解（参见“材料和方法”） 在用CM或EBSS处理4小时的HT-29细胞中测量； 或在HT-29 Bcl-2中 CM、EBSS处理的细胞，100μ 米 C类 2 -DHCer或100 μ 米 C类 2 -证书。 C类 、HT-29和HT-29 Bcl-2细胞 用编码GFP-LC3的质粒转染。 转染后24小时， HT-29细胞在EBSS或CM中培养4h 用CM、EBSS、100μ 米 C类 2 -DHCer，或 100 μ 米 C类 2 -证书。 通过计数定量自噬 带有GFP-LC3点的细胞数量。 所示结果代表了 三个独立的实验。 每次分析50–100个细胞。 报告的值是三个独立实验的平均值±S.D。 星号 表明 第页 < 0.05 与 厘米。
C类 2 -Cer刺激MCF-7中的Bcl-2磷酸化。 贝克林 1 细胞。 一个 ，MCF-7。 贝克林1 细胞培养用于 在EBSS中完全培养基中培养4小时( 厘米 )或在CM中补充100 μ 米 C类 2 -证书。 对裂解液进行免疫印迹 使用抗磷酸化Bcl-2（Ser）的单克隆抗体 70 ) (1:1000, 上部面板 )或小鼠单克隆抗Bcl-2抗体（1:1000， 下部面板 ). B类 ，MCF-7。 贝克林1 个单元格 用编码Bcl-2 WT、Bcl-2 AAA或Bcl-2 EEE的质粒转染。 24 转染后h，将细胞放置在CM或100中4 h μ 米 C类 2 -证书。 使用山羊对Beclin 1进行免疫沉淀 多克隆抗体（1:80稀释）。 免疫沉淀蛋白是 使用多克隆抗Bcl-2抗体进行免疫印迹。 裂解液是 使用多克隆抗Bcl-2或多克隆抗Beclin 1进行免疫印迹 抗体。 C类 ，MCF7。 贝克林1 细胞与 编码GFP-LC3的质粒、空载体或编码Bcl-2 WT的质粒， Bcl-2 AAA或Bcl-2 EEE。 转染后24小时，培养细胞 EBSS、CM中4小时，100μ 米 C类 2 -Cer或100 μ 米 C类 2 -DHCer公司。 自噬通过计数 带有GFP-LC3点的细胞数量。 所示结果代表了 分析了四个独立实验±S.D.50–100个细胞 每次分析。
神经酰胺诱导的自噬依赖于Bcl-2 磷酸化 -然后我们研究了调节 Beclin 1-Bcl-2复合物的神经酰胺依赖性解离。 磷酸化是已知的调节翻译后变化之一 蛋白质复合物。 例如，在自噬途径中 Atg1的伴侣是磷酸化依赖性的 ( 三 ). 此外，神经酰胺 调节Bcl-2的磷酸化 ( 56 )，并且已经显示 最近，Bcl-2磷酸化对刺激 饥饿诱导的自噬和Beclin 1:Bcl-2的调节 变阻器( 40 ). 在第一次 在一系列实验中，我们分析了Bcl-2在 MCF-7。 贝克林1 用C处理的细胞 2 -Cer使用 检测Ser残基磷酸化的商业抗体 位置70。 我们观察到在 序号 70 暴露于100μ后 米 C类 2 -证书 4小时( ). 我们还 发现饥饿会导致血清Ser的增加 70 磷酸化比CM（参见参考。 ( 40 )和 ). 序号 70 位于Bcl-2的非结构回路内 以包含三个氨基酸Thr为特征 69 , 序号 70 和Ser 87 已知为激酶底物 ( 57 ). 这三个一样 残基在Beclin 1-Bcl-2解离中起主要作用 饥饿( 40 ). 收件人 研究这些磷酸化位点是否参与调节 神经酰胺诱导的自噬和Beclin 1-Bcl-2的解离 我们转染了MCF-7。 贝克林1 带有cDNA的细胞 编码野生型Myc-Bcl-2、Myc-Bcl-2AAA（其中Thr 69 , 序号 70 和Ser 87 被定点突变为丙氨酸 突变）和Myc-Bcl-2EEE（其中Thr 69 ，序列号 70 、和 序号 87 通过定点突变突变为Glu）。
如所示 ，与饥饿形成对比 ( 40 )，C 2 -证书 刺激自噬并诱导Beclin 1-Bcl-2的解离 MCF7中的复合物。 贝克林1 表达野生型Myc-Bcl-2的细胞。 这些结果与HT-29-Bcl-2细胞的结果一致（参见 ). 作为 在HT-29-Bcl-2细胞中观察到，C 2 -DHCer没有诱导自噬 MCF-7。 贝克林1 细胞。 C类 2 -Cer治疗未诱导 MCF-7中Beclin-1-Bcl-2复合物的解离。 贝克林1 细胞 转染Myc-Bcl-2AA突变体 ( 和参考。 40 ). 因此，它不是 令人惊讶的是，C的自噬反应 2 -Cer处理 饥饿在这些细胞中消失了 ( ). 在 相比之下，在MCF-7中。 贝克林1 表达Myc-Bcl-2EEE突变体的细胞， 它模拟了Bcl-2的磷酸化形式，即Beclin的解离 即使自噬不受任何一种刺激，也观察到1-Bcl-2复合物 C类 2 -Cer处理或饥饿 ( 和参考。 40 ). 自噬率低于 这些条件与C 2 -证书 治疗或饥饿( ). 这表明自噬不能再进一步 饥饿或C刺激 2 -Cer曾经是Beclin 1-Bcl-2复合物 已解除关联。 最近有研究表明 Thr 69 ，序列号 70 和Ser 87 Bcl-2至Ala 导致Beclin 1和Bcl-2在 饥饿期（参见参考。 40 ). 相反，同时 苏氨酸突变 69 ，序列号 70 和Ser 87 属于 Bcl-2到Glu改变了Beclin 1和Bcl-2之间的相互作用。 因此， 神经酰胺处理对Beclin-1-Bcl-2解离和 自噬反应如所示 只有在非结构 Bcl-2的环突变为Glu或Ala（数据未显示）。
JNK1调节神经酰胺诱导的自噬和神经酰胺依赖的Bcl-2 磷酸化 -非结构回路中的残留物为基质 用于各种不同的Ser/Thr蛋白激酶 ( 57 ). 在激酶中 磷酸化非结构环中的三个残基，JNK1已经 显示磷酸化所有三个残基 ( 57 , 58 ). 此外，初步 结果表明，PKC和p38 MAPK抑制剂不能缓解 C诱导的Beclin 1-Bcl-2解离 2 -Cer（未显示数据）。 因此，我们首先分析了HeLa GFP-LC3细胞中JNK1的磷酸化。 C类 2 -Cer处理在孵育后触发JNK1的激活 持续4小时( )，由 何时长链神经酰胺水平显著增加（参见 ). 它是 值得注意的是，孵育2小时不会改变Bcl-2 磷酸化或JNK1磷酸化（数据未显示），这加强了 长链神经酰胺合成的想法至关重要。 此外，我们 证实饥饿刺激了Bcl-2磷酸化（参见 )和JNK1 磷酸化( ). 根据这些结果，我们表示 JNK1的主导负形式。 当该突变体在HeLa GFP-LC3中表达时 细胞、神经酰胺诱导的自噬和饥饿诱导的自吞噬均为 完全阻塞( )，表明JNK1激活是一个重要步骤 在自噬的刺激中。 此外，在这种情况下 Bcl-2磷酸化在C 2 -铈处理的细胞和 饥饿细胞( ).
C类 2 -Cer通过HeLa中JNK1活性刺激自噬 细胞。 一个 ，HeLa细胞在EBSS中培养4h，完成 介质( 厘米 )单独或补充100μ 米 C类 2 -证书。 用兔单克隆抗体对裂解液进行免疫印迹 抗磷-JNK（Thr 183 /Tyr公司 185 )抗体（1:1000， 上部面板 )或兔单克隆抗JNK抗体（1:1000， 下部面板 ). B类 ，HeLa细胞与 GFP-LC3、空载体或编码非活性载体的质粒编码 JNK1号机组( dnJNK1号 ). 转染24小时后，对细胞进行处理 使用EBSS、CM或100μ 米 C类 2 -证书。 自噬 通过用GFP-LC3点计数细胞数量进行量化。 结果 所示为三个独立实验的代表。 50–100个单元格 每次分析的结果。 C类 ，HeLa细胞被转染 编码dnJNK1的质粒。 转染后4h，对细胞进行处理 使用EBSS，CM，100μ 米 C类 2 -Cer或100 μ 米 100 μ 米 C类 2 -DHCer公司。 当时的细胞 用兔单克隆进行电泳和免疫印迹 抗磷-JNK（Thr 183 /Tyr公司 185 )抗体（1:1000），a 兔单克隆抗JNK抗体（1:1000）或单克隆抗体 针对磷酸化Bcl-2（Ser 70 ) (1:1000, 上部面板 )或a 小鼠单克隆抗Bcl-2抗体（1:1000）。 报告的值为平均值 ±三个独立实验的S.D。
讨论 神经酰胺是鞘磷脂的第二信使，参与多种 细胞过程( 28 , 31 ). 更好地理解 它在细胞内稳态中的作用需要对其进行表征 细胞内靶点。 在这里报道的工作中，我们确认了Beclin 1-Bcl-2复合物参与as自噬体形成的早期阶段 神经酰胺的新靶点。 在这个复合物中，抗凋亡蛋白Bcl-2 具有抗自噬功能 ( 19 )，所以分离 这种复合物需要在饥饿时触发自噬以促进细胞生长 在缺乏营养的情况下生存 ( 19 ). 除了 生理刺激，如饥饿或神经酰胺、药物的产生 与癌症治疗相关的药物，如BH3-模拟物ABT-747，已经被证明 通过与BH3结构域竞争来分离Beclin 1-Bcl-2复合物 贝克林1( 25 ).
基于目前和以往的研究 ( 36 )，我们得出结论 神经酰胺通过干扰mTORC1的活性刺激自噬 复合体和Beclin1复合体。 这种情况令人想起 在饥饿诱导的自噬过程中观察到 复数被调制( 23 ). 有趣的是，已知Beclin 1蛋白作为支架蛋白 直接或间接招募几个合作伙伴，包括癌蛋白 （Bcl-2和Bcl-X L（左） )和肿瘤抑制剂（UVRAG、Ambra-1和 Bif-1）( 22 , 23 ). 癌蛋白具有 对hVps34（Ⅲ类磷脂酰肌醇）活性的抑制作用 3-磷酸），从而导致自噬。 肿瘤抑制物 对自噬和hVps34活性具有相反的作用。 在这个 上下文中，有趣的是注意到神经酰胺，它是一种肿瘤抑制 脂质( 31 )，诱导 Beclin 1-Bcl-2复合物的分离并刺激自噬。
Ceramide诱导的Beclin 1-Bcl-2复合物的解离需要 Bcl-2的磷酸化。 以前的研究表明神经酰胺调节 通过降低Bcl-2的磷酸化作用来抑制其抗凋亡能力 激活蛋白磷酸酶2A的结果 ( 56 ). 这表明 神经酰胺通过抑制 Bcl-2通过其磷酸化和通过去磷酸化Bcl-2的凋亡。 到目前为止 就Bcl-2的抗自噬功能而言 非结构环减轻其抗自噬能力，如 对饥饿或神经酰胺的反应（参考。 40 和本研究）。 Bcl-2非结构环的缺失阻断了由饥饿引起的 自噬（参见参考。 40 )和 神经酰胺诱导的自噬（数据未显示）。 如其他地方所述 ( 59 )，缺少 病毒型Bcl-2的结构环可能是病毒的一种策略 阻断细胞感染过程中自噬的诱导。 有趣的是， 删除这个非结构环和氨基磷酸化的缺失 这个环中的酸都能增强细胞的抗凋亡功能 Bcl-2型( 58 , 60 ).
Bcl-2在神经酰胺诱导自噬中的亚细胞定位 神经酰胺诱导的细胞凋亡可能是一个重要参数。 线粒体 已证明在神经酰胺诱导的细胞凋亡中起主要作用 ( 61 ). 此外，a 线粒体蛋白磷酸酶2A与 触发细胞凋亡的Bcl-2的神经酰胺依赖性去磷酸化 ( 56 ). 这些发现表明 线粒体靶向的Bcl-2在调节 神经酰胺诱导细胞凋亡。 相反，只有靶向ER的Bcl-2 调节自噬( 19 , 25 ). 磷酸化 ER-located Bcl-2抑制其与促凋亡家族成员的结合 ( 62 )并诱导其 与Beclin 1分离 ( 40 ).
鞘脂代谢的巨大可塑性意味着神经酰胺可以 通过几种不同的路线生产( 从头开始 合成，水解 不同亚细胞中鞘磷脂和糖脂的降解 位置( 63 ). 它是 有趣的是 从头开始 合成 内质网中神经酰胺对Tam治疗的反应导致 Beclin-1-Bcl-2复合物。 这可能表明神经酰胺的ER池 可能通过Beclin 1-Bcl-2参与调节自噬 复杂。 神经酰胺从内质网的转运依赖于CERT 蛋白质( 64 ). 抑制 已知CERT表达可诱导内质网应激反应 ( 65 ). 另一方面，在 已知不同的内质网应激会诱导自噬 ( 66 , 67 ). 这很诱人 设想神经酰胺可能是以下信号的一部分： 触发ER-依赖性自噬。 然而，神经酰胺可能 由内质网外鞘氨醇回收途径产生 ( 53 )也可能干扰 Beclin 1-Bcl-2复合物的组成。 值得调查 不同种类神经酰胺在诱导中的作用 研究自噬，看看这是否能阐明 这种脂质在调节自噬和凋亡中的不同池。 有趣的是，最近的一份报告显示CD95依赖性神经酰胺可以触发 促生存信号（自噬）和促死亡信号（凋亡） 癌细胞( 68 ), 这表明神经酰胺不能被视为是细胞的唯一介质 死亡。
神经酰胺通过以下途径介导Beclin 1-Bcl-2复合物的分解 通过JNK1刺激Bcl-2的磷酸化。 JNK，它们是 神经酰胺可以激活应激激活蛋白激酶 ( 69 , 70 ). 这样做的一个效果 神经酰胺依赖性激活JNK是Bcl-2家族的磷酸化 成员( 71 ). JNK是一个密钥 细胞存活和细胞死亡之间平衡的调节器。 持续时间 活化和基质的性质是 JNK促凋亡或抗凋亡活性之间的平衡 ( 72 ). 神经酰胺依赖性 通过JNK激活自噬是 JNK的促生存和促死亡活动，因为 细胞死亡和存活中的自噬。
在这项工作中，我们注意到神经酰胺比饥饿更有效 在解离Beclin-1-Bcl-2复合物中。 事实上，神经酰胺诱导 复合物和刺激自噬的解离 强制表达Bcl-2（HT-29-Bcl-2细胞和MCF-7。 贝克林 1 -Bcl-2细胞），而在这种情况下，饥饿对 Beclin 1-Bcl-2解离且不刺激自噬 ( 40 ). 这两者之间的差异 饥饿和神经酰胺的影响可能不是 不同的信号通路。 事实上，这两种刺激都抑制mTOR信号 途径，作用于Beclin 1-Bcl-2复合物的上游 自噬体的形成 ( 17 , 36 ). 一个可能的解释 神经酰胺对Beclin 1-Bcl-2解离的强健作用 复杂的是，除了Bcl-2磷酸化，神经酰胺也可能 通过其他机制促进复合物的解离。 神经酰胺 显示通过诱导BH3-only蛋白BNIP3触发自噬 ( 37 ). BNIP3开始 治疗4-5小时后，神经酰胺引起的累积， 即 在与这里进行的实验相一致的时间尺度上。 此外，一些报告表明BNIP3参与了诱导 自噬( 37 , 73 – 75 ). 最近的一项研究表明，在缺氧期间，BNIP3能够取代Bcl-2 可能是通过与Beclin的BH3域竞争 1 ( 75 ). 这意味着我们 不能排除神经酰胺可能使用两种策略来 从Beclin1中分离Bcl-2：首先，通过增加其磷酸化 Bcl-2通过JNK1，其次是通过有利于BNIP3-Bcl-2复合物而不是 Beclin 1-Bcl-2复合物。 一个有待回答的问题是如何 神经酰胺导致 Bnip3号机组 。最近 包括BNIP3在内的几个自噬基因中，已被证明在 转录因子FOXO3的控制 ( 73 ). FOXO3被抑制 Akt/PKB依赖性磷酸化 ( 76 )，但这种抑制 神经酰胺可抑制Akt/PKB ( 77 ). 此外，正如我们所做的那样 其他地方报道，神经酰胺增加了Beclin 1 mRNA的水平 ( 36 ). 所以我们假设 神经酰胺诱导的Akt/PKB抑制可能通过两个途径刺激自噬， 非互斥途径：通过干扰 mTORC1复合物和通过调节自噬基因的表达 FOXO3。
目前的研究结果表明神经酰胺是第二信使，具有 在自噬调节中的中心作用。 目标的说明 自噬途径中的神经酰胺将阐明其在细胞内稳态中的作用。 加上我们之前的研究结果显示，第二个鞘磷脂 信使1-磷酸鞘氨醇也调节自噬 ( 35 )，很明显 鞘脂代谢的可塑性意味着存在多种 应激状态下触发自噬的可能机制 并影响细胞命运 ( 78 ).
致谢 我们感谢M.-T.Dimanche-Boitrel博士、Y.A.Hannun、N.Mizushima、， D.K.Perry、I.Tanida、A.M.Tolkovsky、R.J.Davis和T.Yoshimori 为我们提供本研究中使用的试剂。
笔记
* 这项工作得到了National的全部或部分支持 卫生研究院拨款R01 CA109618（对B.L.）。 这项工作也得到了机构的支持 来自INSERM的资金，来自 巴黎南11大学，来自 癌症研究协会 （向P.C.拨款3503，向S.P.拨款4006）。 出版成本 这篇文章的部分费用是由页面费支付的。 这个 因此，物品必须在此标记“ 广告 ” 根据《美国法典》第18卷第1734节，仅为了表明这一事实。
S⃞ 本文的在线版本（可在 网址：http://www.jbc.org ) 包含补充图S1–S3。
脚注 2 使用的缩写为：LC3、Light Chain 3； C类 2 -证书， C类 2 -神经酰胺； C类 2 -DHCer，C公司 2 -二氢神经酰胺； C类 6 -证书，C 6 -神经酰胺； C类 6 -DHCer、， C类 6 -二氢神经酰胺； 二酰甘油； dnJNK1，显性-阴性 JNK1； 伏马菌素B1； EBSS，厄尔平衡盐溶液； Tam，三苯氧胺； CHAPS，3-[（3-胆酰胺丙基）二甲基铵]-1-丙磺酸； 呃， 内质网； PBS，磷酸盐缓冲盐水； CM，全培养基； mTOR，雷帕霉素的哺乳动物靶点。
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