Barkor作为Beclin 1和III类磷脂酰肌醇3-激酶的哺乳动物自噬特异性因子的鉴定

Barkor对体内高效生产PI3P至关重要。

由于Beclin 1是PI3KC3复合体的主要组成部分，我们检查了Barkor是否也是该复合体的组成部分。事实上，Barkor和Beclin 1与PI3KC3抗体共同免疫沉淀(图S5)，表明Barkor是PI3KC3复合物的一部分。

Beclin 1和PI3KC3之间的相互作用不受Barkor基因敲除的影响(图S6A类和B类)或过度表达(图S6C类). 由于Barkor与Beclin 1直接互动，我们询问PI3KC3与Barkor之间的关联是否需要Beclin 1。事实上，在贝克林1比1淘汰赛中(图S6D类)细胞，PI3KC3免疫沉淀中Barkor的数量(图1D类，车道7）与Beclin 1-profective小区相比显著减少(图1D类，车道3）。Beclin-1敲除细胞Barkor免疫沉淀中PI3KC3的含量(图1D类与Beclin 1熟练细胞相比，通道8）也受到了很大的损害(图1D类，车道4）。总之，PI3KC3和Barkor之间的相互作用需要Beclin 1。

为了测试Barkor是否可以调节PI3KC3活性，我们测量了其在野生型和Barkor敲除细胞中的脂质磷酸化活性。PI3KC3磷酸化磷脂酰肌醇（PtdIns）环的3′-羟基位置，生成PtdIns3P（P）（PI3P）(9). PI3KC3产生PI3P的过程可以通过Hrs蛋白的GFP标记双FYVE指的荧光进行可视化和定量(15). 由于FYVE探针与PI3KC3的唯一终产物PI3P特异性结合，我们可以通过检测FYVE荧光来测量PI3KC3的活性。与野生型细胞相比，Barkor敲除细胞中PI3P的生成减少，并且可以通过PI3K抑制剂3-甲基腺苷（3-MA）的治疗进一步耗尽PI3P(图1 E类和F类).

LC3结合和自噬体组装需要Barkor。

为了直接证明Barkor在自噬中的作用，我们在U₂OS细胞(图S7A类和B类). 自噬活性的一个可靠标志是LC3与磷脂酰乙醇胺（PE）的结合，这是由饥饿或雷帕霉素治疗等刺激强烈诱导的(16). LC3-共轭形式（也称为LC3II）的迁移速度略快于细胞溶质游离形式（LC3I）。在野生型细胞中，LC3II型在饥饿时显著增加(图2A类，车道3和7）与未处理细胞相比(图2A类，车道1和5）。然而，在Barkor诱导的敲除细胞中，LC3II形式减少(图2A类，车道8），与Beclin 1敲除细胞的水平相当(图2A类，车道4）。同样，在雷帕霉素处理的野生型细胞中强烈诱导LC3II(图2B类，通道3），但不在Barkor击倒牢房内(图2B类，车道7）。蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制素和E-64D预处理使雷帕霉素处理后的LC3II型累积(图2B类，车道4）和未处理(图2B类，通道2）Barkor增殖细胞，但对Barkor缺陷细胞的LC3结合没有影响(图2B类，第6和第8车道）。所有这些数据表明，Barkor对于LC3结合到PE和自噬激活至关重要。一直以来，Barkor敲除细胞中LC3 punta也显著受损(图S8).

在单独的窗口中打开

图2。

Barkor是LC3脂质化和自噬体形成所必需的。(A类)在Beclin 1和Barkor敲除U中检测LC3结合₂全培养基（DMEM+10%FBS）或饥饿培养基（厄尔平衡盐溶液，EBSS）中的OS细胞。(B类)用500 nM雷帕霉素处理Barkor敲除细胞过夜，检测LC3结合。蛋白酶抑制剂（2μg/mL E64D和2μg/mL胃蛋白酶抑制素4小时）用于阻断溶酶体降解。(C–E类). Barkor敲除细胞的电子显微镜（EM）分析。两个控制单元(C类)和Barkor敲除细胞(D类)在EBSS中饥饿1h，并进行透射电镜分析。(E类)中框架区域的高清晰度图片C类显示含有细胞内内容物的AV（用箭头标记）。[比例尺：2μM(C类)，2微米(D类)和1μM(E类).] (F类)每个横截面细胞的AVs（平均值±SD；n个=21）在EM下进行计算和总结。CM，全介质。箭头表示自噬液泡。(G–I型)Barkor-overpression（OE）U公司₂OS细胞(H（H）和我)和U₂OS亲代细胞(G公司)在EM下观察到(我)中框架区域的高清晰度图片H（H）显示包含细胞内内容物的AV（用箭头标记）。[比例尺：1μM(G–I型).] (J型)计算EM下每个横切面细胞的AVs。(K（K）)计算并总结Barkor OE细胞或正常细胞AVs的平均大小。(L（左）)用Barkor（野生型或CCD缺失突变体）或UVRAG转染HEK293T细胞，并在这些细胞中检测LC3结合。

为了直接观察自噬体的形成，我们进行了电子显微镜分析。在自噬过程中，包括蛋白质和细胞器在内的细胞质成分被双膜自噬体吞噬，与溶酶体小泡融合形成自溶体，其中的内容物被降解为其成分(17). 包括自噬体和自溶体的自噬空泡（AVs）可以在透射电镜下捕获，表现为双膜囊泡（自噬小体）或单膜囊泡，其中包含细胞内物质，包括胞浆和细胞器（线粒体和/或内质网）(图2E类，用箭头标记）(17). 在Barkor野生型细胞中，我们观察到大量AV对营养剥夺的反应(图2 C类,E类、和F类). Barkor敲除细胞中很少观察到AVs(图2 D类和F类).

然后我们询问Barkor的强制表达是否会刺激自噬体的形成。为此，我们在U₂在这些细胞中观察到OS和自噬液泡的形成。Barkor OE细胞中的AV数量显著增加(图2 H（H）–J）与亲代细胞相比(图2 G公司和J型). 此外，Barkor OE细胞中的AV更加异质，我们观察到大量的大AV(图2 H（H）和我). Barkor OE细胞AV的平均大小几乎是对照细胞的两倍(图2K（K）). 一直以来，Barkor在HEK293T细胞中的过度表达导致自噬激活，LC3II形式的数量增加说明了这一点(图2L（左）). 所有这些数据表明，Barkor在自噬体的形成和扩张中起着重要作用。

Barkor对自噬介导的细菌清除至关重要。

自噬被认为是抑制细菌感染的重要防御机制(18). 据报道鼠伤寒沙门菌是食物中毒和伤寒的病原体，由自噬控制(19——21). 我们首先询问在非吞噬细胞哺乳动物细胞中控制细菌感染是否需要自噬。敲除小鼠胚胎成纤维细胞附件7(22)，一个重要的自噬基因，被感染沙门氏菌标记有GFP，并且摄取沙门氏菌用绿色荧光显微镜监测。正如预期，附件7^−/−MEF对细胞内复制更为宽容沙门氏菌与野生型细胞相比，细胞液中GFP荧光显著增强(图3A类). 我们进一步进行了定量分析，以测量细菌的生长。沙门氏菌年增长加快附件7-敲除细胞与野生型细胞的比较(图3B类)，确认需要自噬沙门氏菌非吞噬细胞哺乳动物细胞的扩增。

在单独的窗口中打开

图3。

Barkor在体内对细菌复制的自噬介导抑制中不可或缺。(A类)附件7^+/+ 和附件7^−/−MEF细胞被野生型GFP标记物感染鼠伤寒沙门氏菌（SL1344）（绿色）8小时，并通过免疫染色进行分析。用抗微管蛋白抗体（红色）对细胞进行复染。(B类)附件7^+/+或附件7^−/−MEF感染了鼠伤寒沙门氏菌（SL1344）。感染细胞用硫酸庆大霉素处理以阻止细胞外细菌扩增，然后溶解，并将内化细菌涂布在培养皿上。通过计算培养皿上的菌落数来量化细菌的复制。(C类)Barkor-击倒U₂强力霉素诱导OS细胞2天并感染鼠伤寒沙门氏菌如中所述A类. (D类)Barkor-knowdown U中的细菌生长₂按照中所述测量OS细胞B类.

在Barkor敲除细胞中也观察到类似的现象，即当Barkor蛋白被清除时，细菌会更多地生长(图3C类). 同样的细菌生长定量分析表明，在Barkor缺乏的Barkor生产细胞中可以检测到细菌复制增加2到3倍(图3D类). 这一结果表明，Barkor对哺乳动物细胞中自噬介导的细菌清除至关重要。

Barkor通过CCD与Beclin 1互动。

我们对Barkor和Beclin 1之间的相互作用进行了深入分析。我们根据Beclin 1和Barkor的假定结构构建了一系列表达不同缺失突变体的载体。Barkor包含一个N-末端锌指基序和一个中央CCD(图4A类)，Beclin 1由3个结构域组成：一个N端BH3结构域、一个中央CCD结构域和一个C端进化保守结构域(图4B类) (23). IP分析表明，所有含有CCD的Barkor片段，包括单独的CCD片段(图4A类，第2、4、5和6道），免疫沉淀Beclin 1，而缺乏CCD的Barkor片段无法结合(图4A类，第3和第7车道），证明Barkor通过其CCD与Beclin 1特异性结合(图4A类). 此外，Beclin 1还通过其CCD与Barkor进行特异性相互作用(图4B类).

在单独的窗口中打开

图4。

Barkor和UVRAG通过其CCD与Beclin 1形成不同的亚复合物。(A类)Barkor通过CCD与Beclin 1结合。用FLAG-Beclin 1、Myc-Barker或其Myc-tagged突变体转染293T细胞。全细胞裂解物（WCL）用抗Myc免疫沉淀（IP），然后用抗FLAG免疫印迹（IB）。§表示非特定带。(B类)Beclin 1通过其CCD与Barkor结合。用Myc-Barker、FLAG-Beclin 1或其FLAG标记突变体转染293T细胞。用抗FLAG免疫沉淀WCL，然后用抗Myc免疫沉淀IB。(C类)Beclin 1与Barkor或UVRAG直接相互作用。Ni-column首先与His-Beclin 1-CC孵育，然后与FLAG标记的Beclin 1-CC、Barkor-CC和UVRAG-CC孵育。分析与珠子和输入物结合的蛋白质。(D类)Barkor和UVRAG与Beclin 1形成不同的亚复合物。用FLAG-UVRAG、Myc-Barker和HA-Beclin 1转染293T细胞。用抗FLAG、抗HA或Myc免疫沉淀WCL，并分析免疫沉淀。(E类)Barkor与UVRAG竞争与Beclin 1的结合。UVRAG首次与Beclin 1在体外孵育；然后将增加剂量的Barkor CCD添加到反应中。在大量洗涤后，用考马斯蓝染色的SDS/PAGE分析与珠结合的蛋白质。(F类)UVRAG与体内Barkor–Beclin 1相互作用竞争。用Myc-Barker或FLAG标记的UVRAG将HA-Beclin 1共转染到HEK293T细胞中。用抗HA免疫沉淀WCL，然后用抗Myc、FLAG或HA抗体免疫沉淀IB。

Barkor和UVRAG与Beclin 1形成互斥复合物。

UVRAG是最近发现的Beclin 1的阳性调节物(24)并通过CCD交互与Beclin 1进行交互。由于Beclin 1的同一结合面被用于与Barkor和UVRAG结合，我们推测Barkor与UVRAG可能通过竞争与Beclin l形成互斥配合物。为了验证这一假设，我们在体外结合试验中检测了Barkor、UVRAG和Beclin 1之间的直接相互作用。在本试验中，我们从中纯化了Beclin 1、Barkor和UVRAG的不同重组CCD大肠杆菌(图S9)并进行体外结合反应。如所示图4C类(底部)Barkor CCD（4道）和UVRAG CCD（6道）直接与Beclin 1 CCD相连。使用Barkor CCD进行了类似的实验(图S10A类)或UVRAG CCD(图S10B类)作为诱饵；两个CCD都与Beclin 1绑定，但不相互绑定。

我们进一步研究了Barkor和UVRAG是否在体内与Beclin 1形成相互排斥的亚复合物。我们进行了共免疫沉淀实验，以检测体内Beclin 1、Barkor和UVRAG的相互作用。Beclin 1抗体(图4D类，通道3）但不控制抗体(图4D类Beclin 1与Barkor和UVRAG均发生相互作用，但Barkor与UVRAG之间未检测到相互作用(图4D类).

然后我们询问Barkor是否与UVRAG竞争Beclin 1的结合。在结合试验中，我们首先培养了His₆-Beclin 1 CCD带Ni底座，然后带UVRAG CCD，以允许Beclin 1-UVRAG(图4E类)复杂地层。将过量的Barkor CCD以不同浓度添加到反应混合物中，以与UVRAG–Beclin 1结合竞争。正如预期的那样，UVRAG CCD以剂量依赖的方式从Beclin 1复合物中移出(图4E类). 通过共免疫沉淀在体内进行类似的竞争试验。Barkor可与抗HA-Beclin 1抗体有效共免疫沉淀(图4F类，车道5）。然而，当UVRAG过度表达时，Beclin 1–Barkor相互作用减弱(图4F类，车道6）。因此，过量的UVRAG可以与体内的Beclin 1–Barkor相互作用竞争。这些结果表明，Barkor和UVRAG通过直接竞争以互斥的方式与Beclin 1相互作用。

Barkor亚细胞定位受自噬应激调控。

我们首先研究了Barkor在人骨肉瘤U中的亚细胞定位₂转染GFP-Barkor的OS细胞。大约20%的GFP阳性细胞显示出稀少的点状染色，其余细胞显示出弥散的细胞质染色(图5人工智能). 通过自噬诱导剂雷帕霉素的治疗，含有丰富Barkor病灶的细胞百分比显著增加（≈80%）(图5AII公司)或养分提取(图5全部). 自噬抑制剂3-MA治疗使Barkor点状染色转变为弥散细胞质染色(图5AIV公司). 对每个细胞的病灶或有病灶的细胞数量的统计分析也与观察结果一致(图5 B类和C类). Barkor点状染色在无应力条件下与LC3几乎完美共定位(图5D I–III型)或雷帕霉素治疗后(图5D IV–VI类). 所有这些结果都证明Barkor主要位于自噬体上，自噬体受自噬刺激的调节。作为对照，在雷帕霉素治疗前后，Barkor和早期内体标记EEA1之间没有明显重叠(图5D七–九和数据未显示）。

在单独的窗口中打开

图5。

Barkor通过直接相互作用促进Beclin 1易位到自噬体。(A类)Barkor的亚细胞定位。转染U中检测到荧光Barkor-EGFP₂模拟处理后的OS细胞(我)，500 nM雷帕霉素(二)，EBSS介质(三)或EBSS和5 mM 3-MA。(B类)每个细胞Barkor-EGFP点的量化。(C类)Barkor EGFP点状染色阳性细胞的定量。(D类)Barkor和LC3的Colocalization。A U型₂表达Myc-LC3的OS稳定细胞系转染Barkor-EGFP，然后模拟处理(I–III级)或用500 nM雷帕霉素处理(四至九)持续12小时(I–VI类)GFP-Barkor（绿色）与Myc-LC3（红色）共染。(七至九)GFP-Barkor（绿色）与内源性EEA1（红色）（内体标记）共染色。(E类)U型₂用RFP-Beclin 1转染OS细胞。(I–III级)RFP-Beclin 1与内源性TGN38（绿色）（a）共染色反式-高尔基网络标记）。(IV–VI类)U型₂将Barkor-EGFP（绿色）和RFP-Beclin 1（红色）转染OS细胞，观察Barkor-EGFP（红色）和RFP-Beclin 2（红色）的荧光。(七至九)U型₂用RFP-Beclin 1、Myc-Barker和GFP-LC3转染OS细胞，观察GFP-LC2（绿色）和RFP-Bellin 1（红色）的荧光。(X–XII号)，单位₂用RFP-Beclin 1和Barkor CCD缺失突变体融合EGFP转染OS细胞，观察GFP-Barkor CCD缺失（绿色）和RFP-Beclin 1（红色）的荧光。

我们感谢所有钟实验室成员的有益讨论和技术援助；Terje Johansen（特罗姆瑟大学）、Jae Jung（南加州大学）、Harald Stenmark（奥斯陆大学）、Masaaki Komatsu（Juntendo大学医学院）和Denise Monack（斯坦福大学医学院；王晓东（Xiaodong Wang）、罗伯特·特健（Robert Tjian）、兰迪·舍克曼（Randy Schekman）、丹尼尔·克林斯基（Daniel Klonsky）、杰里米·索纳（Jeremy Thorner）和尤利娅·莫斯托维（Yulia Mostovoy）对手稿进行了；德克萨斯大学西南医学中心的Nick V.Grishin对Barkor进行生物信息学分析；圣安东尼奥得克萨斯大学健康科学中心和上海Abmart的Yumay Chen博士从事Barkor和Beclin 1抗体生产。这项工作得到了埃里森医学基金会（Q.Z）颁发的新老龄研究者奖的部分支持。