结果
线粒体分裂抑制剂的化学筛选
线粒体分裂和线粒体融合缺陷突变体的生长表型构成了我们筛选抑制线粒体分裂小分子的基础。具体来说,暴露于对温度敏感的酵母细胞fzo1-1型非许可温度的等位基因导致线粒体膜断裂,因此,细胞在数量上丢失线粒体DNA,无法在非发酵碳源甘油上生长(,fzo1-1型,YPEG,37°C)。如果使用可发酵的碳源(如葡萄糖)生长,这些细胞仍然可以繁殖(,fzo1-1型,YPD,37°C)。除法所需的成分突变,例如DNM1(DNM1)编码线粒体分裂动力蛋白,抑制分裂介导的线粒体断裂和线粒体DNA丢失fzo1-1型从而在非允许温度下抑制甘油生长缺陷(,fzo1-1Δdnm1). 在酵母中,线粒体分裂的缺失在实验室条件下几乎没有相关的生长表型(,Δdnm1、YPD和YPEG)。
线粒体分裂抑制剂的化学筛选答:。线粒体融合的生长表型(fzo1-1型)和分裂(Δdnm1)突变体。B。喹唑啉酮的化学结构,mdivi-1。重要的结构特征以红色突出显示,并通过比较mdivi-1类化合物的功效确定,如.C、。mdivi-1抑制线粒体融合突变体的生长缺陷,fzo1-1型和5毫克在限制温度下.D和E。mdivi-1导致线粒体网状结构的形成(E,右面板,mdiv-1;左面板,DMSO)Δprd1Δprd 3酵母细胞呈剂量依赖性(D,代表性实验显示,n≥100)。在E中,左侧面板是DMSO控件,右侧面板是mdivi-1。F、。mdivi-1对F-actin细胞骨架无影响。线粒体为红色,而磷脂酶为绿色。左侧面板:DMSO控制单元。中心面板:mdivi-1处理细胞。右侧面板:Latrunculin-A和mdiv-1-处理的细胞。N=线粒体网。比例尺=2μ。
因此,为了确定线粒体分裂抑制剂,我们进行了一个简单的基于生长的筛选,以确定抑制甘油生长缺陷的小分子fzo1-1型细胞。为了提高酵母细胞中药物的稳态细胞内浓度PDR1(PDR1)和保时捷车主精品3编码转录调控蛋白的基因积极控制多药耐药ABC转运体的表达,这些基因是在筛选和小分子鉴定中使用的菌株中产生的(罗杰斯等人,2001年). 这些额外的突变对细胞线粒体分裂和融合没有影响(未显示)。最初,由于获得的化合物数量有限,在一次和二次测定中,以10-100μM的单一浓度筛选小分子。单独测试时,用于溶解小分子的溶剂二甲基亚砜在所述的任何分析中均无显著影响。
我们使用基于初级生长分析的筛选筛选了大约23000种化合物,这些化合物代表了几种商用库(,1°屏幕)。在二次分析中进一步测试了所有鉴定的化合物对酵母中稳态线粒体形态的影响(,2°屏幕)。酵母和哺乳动物细胞线粒体的稳态结构是细胞线粒体分裂和融合相对速率的指标(Bleazard等人,1999年;赫尔曼等人,1998年;Nunnari等人,1997年;Sesaki和Jensen,1999年). 具体而言,线粒体结构碎片的存在表明线粒体融合选择性减弱。相反,网状线粒体结构的存在表明线粒体分裂选择性减弱。我们使用线粒体靶向GFP检测这些形态表型,该GFP有效定位于野生型和呼吸缺陷型线粒体。在第二次检测中,如果小分子在超过20%的细胞群体中产生突变表型,则判断为阳性。总结如下,使用我们的一次和二次分析确定的分裂抑制剂命中总频率(共3次)极低,表明我们的筛选策略是选择性的。
表1
图书馆 | 库大小 | 点击1°屏幕 | 点击2°屏幕 |
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Bionet公司 | 4,800 | 16 | 1 (mdivi-1型) |
塞雷普 | 4,800 | 三 | 0 |
五月桥 | 8,800 | 42 | 2 |
NCI多样性 | 1,900 | 6 | 0 |
皮克代尔 | 2,800 | 0 | 0 |
总计 | 23,100 | 67 (0.3%) | 3 (0.013%) |
线粒体分裂抑制剂mdivi-1的特性
我们确定了三种潜在的线粒体分裂抑制剂,并寻求最有效的,即喹唑啉酮衍生物,称为mdivi-1(米伊托软骨分区视觉我抑制剂,). 正如预期的那样,我们观察到mdivi-1抑制了fzo1-1型单元格(). 值得注意的是,mdivi-1还抑制了线粒体融合途径缺陷的其他突变体中观察到的甘油生长缺陷,例如5毫克含有编码线粒体内膜融合动力蛋白Mgm1基因突变拷贝的细胞(5毫克,). 此外,我们观察到,mdivi-1可在野生型细胞中快速(≤5分钟)、可逆和剂量依赖性地形成网状线粒体,并伴有IC50约10μM(). 这些观察结果表明,mdivi-1通过选择性抑制线粒体分裂,起到线粒体融合缺陷的一般抑制作用。
我们还通过延时荧光显微镜直接测量添加mdivi-1后酵母中分裂和融合事件的速率。对mdivi-1处理细胞中线粒体的时程分析表明,未发生可检测到的分裂事件,但观察到融合事件(未显示)。此外,mdivi-1并没有改变线粒体的网状形态Δdnm1细胞,进一步表明它通过作用于依赖Dnm1的分裂途径来阻止分裂(未显示)。综上所述,我们的结果表明,mdivi-1是线粒体分裂的选择性抑制剂。
为了解决mdivi-1对线粒体分裂的特异性影响,我们检测了它对两种细胞结构的影响,当受到干扰时,这两种细胞会导致线粒体形态的间接变化:肌动蛋白细胞骨架和外周ER网络。这些结构在酵母线粒体形态突变体中进行常规检测,以测试线粒体表型的特异性(McConnell等人,1990年). 用100μM mdivi-1处理细胞可导致线粒体网状结构的形成,但肌动蛋白细胞骨架均未发生显著变化(,100%,n=100,左面板)或外围ER网络(未显示,100%,n=50),与对照DMSO处理细胞相比。相比之下,在mdivi-1治疗后添加F-actin解聚化合物Latrunculin-A会导致肌动蛋白线缆和斑块的分解,并导致线粒体网络崩溃和聚集,这与已发表的观察结果一致(Bleazard等人,1999年)(,右侧面板)。这些观察结果表明,mdivi-1对线粒体形态的影响不是肌动蛋白细胞骨架或内质网二次变化的结果,这与我们的数据一致,表明mdivi-1通过直接减弱线粒体分裂产生网状结构。
mdivi-1的结构活性分析
为了确定哪些结构特征对mdivi-1对线粒体分裂的影响很重要,我们使用ChemNavigator搜索可用的小分子化合物数据库,这些小分子独特地代表了mdivi-1的关键结构特征。我们测试了总共30多个mdivi-1样分子对酵母线粒体形态的影响。被称为A-H的代表性化合物的摘要及其功效如所示和在任何情况下,我们都没有发现比mdivi-1(化合物a)更有效的化合物;相反,大多数化合物都具有相同的性质(,化合物B),中等(,化合物C-E),或疗效差/无疗效(,化合物F-H)的线粒体形态检测(). 我们利用这些衍生物作为工具来帮助确定mdivi-1的靶点和特异性。
与mdivi-1相关的化合物具有不同的功效化合物(A-H)按其相对功效分组,以在酵母中形成线粒体网状结构。每个分子和mdivi-1(A)之间的结构差异以红色突出显示。
表2
化合物一 | %网状线粒体形态b条 |
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A类 | 90 |
B类 | 90 |
C类 | 80 |
D类 | 80 |
E类 | 50 |
F类 | 6 |
G公司 | 9 |
H(H) | 4 |
我 | 2 |
二甲基亚砜 | 4 |
对我们的结构-功能结果的分析表明,至少有两个结构特征对mdivi-1的疗效很重要((以红色显示):喹唑啉酮的2位上的一个无阻碍的巯基部分,以及围绕3位氮-苯基键的有限旋转。的确,笨重的正交的连接在mdivi-1的N-3上的苯环的氯取代基预测,mdivi-1是两种萎缩异构体的混合物:在这种情况下,异构体是不同的,因为围绕氮-苯基键的旋转受到体积庞大所产生的旋转能量屏障的阻止或大大减慢正交的氯取代基。与此相一致,mdivi-1可以通过手性色谱拆分为两种不同的物种(未显示)。假设一种mdivi-1异构体在减弱线粒体分裂中具有选择性活性,那么mdivi-1的功效将是我们实验数据的两倍。总之,我们的初步结构-活性分析表明,mdivi-1抑制线粒体分裂的能力取决于严格的结构要求,这与它是一种选择性抑制剂相一致。
mdivi-1是线粒体分裂动力蛋白的选择性抑制剂
使用GTPase活性和EM分析的耦合分析,我们先前描述了重组Dnm1的动力学和结构特性(Ingerman等人,2005年)). 我们的分析表明,Dnm1自组装极大地刺激了GTP水解,在存在非水解GTP类似物的情况下,Dnml形成螺旋结构,其直径与体内线粒体收缩位点的直径一致。这些数据有力地表明,Dnm1的自组装在体内分裂期间驱动线粒体收缩。
为了测试mdivi-1是否靶向Dnm1,我们测试了其对自组装刺激的Dnm1 GTPase活性的影响。如所示,mdivi-1以剂量依赖性的方式抑制Dnm1 GTPase活性,估计IC501-10μM,较低,但与IC一致50观察mdivi-1对线粒体网状结构形成的影响。这些观察结果表明,mdivi-1通过抑制Dnm1减弱体内线粒体分裂。
mdivi-1的靶点是线粒体分裂动力蛋白Dnm1A类mdivi-1对Dnm1、Dnm1 1-388(Dnm1 GTPase结构域)和dynamin-1的GTPase活性的剂量依赖性影响。100%活性:Dnm1,50分钟-1; Dnm1 1-388 0.9分钟-1; dynamin-1 3.3分钟-1 B。mdivi-1类似物的作用(参见)Dnm1 GTPase活性。C、。mdivi-1对Dnm1 GTPase活性影响的动力学分析。A-C部分所示的代表性实验。D。Dnm1自组装的负染电镜分析。在加入GMPPCP之前,在GMPPCP(左面板)中培养的Dnm1代表性图像和在添加GMPPCP前用mdivi-1预培养的Dnm1代表性图片(右面板)。比例尺=100 nm。
我们的观察结果提出了一个问题,即mdivi-1是否只是GTPase超级家族成员和/或DRPs的一般抑制剂。因此,我们检测了mdivi-1对Dnm1 1-338的影响,Dnm1的单体GTPase结构域缺乏其他DRP特异性区域(Ingerman等人,2005年). 如所示,mdivi-1对Dnm1 1-338 GTP水解没有影响,这表明它不是GTPases的一般抑制剂,并表明mdivi-1通过与其他DRP区域或更有趣的是,与依赖于多个结构域的区域结合来抑制Dnm1。我们还通过测试mdivi-1对dynamin-1的影响来测试其是否针对其他DRP家族成员,dynamin-1-在细胞内吞过程中从质膜上分离氯氰菊酯包被的小孔。值得注意的是,mdivi-1对dynamin-1的GTP水解的基本速率(未显示)或组装刺激速率均无影响(). 这些结果表明,mdivi-1是线粒体分裂DRP的选择性抑制剂。
为了进一步验证mdivi-1通过抑制Dnm1 GTPase活性而阻断体内线粒体分裂的假设,我们测试了不同功效的mdivi-1like分子抑制体内分裂的能力(和). 多个独立双盲实验的结果表明,体内特定衍生物阻断线粒体分裂的功效与体外Dnm1 GTPase活性密切相关(和). 该观察结果进一步支持线粒体分裂DRP Dnm1是体内mdivi-1的靶点这一结论。
为了深入了解mdiv-1抑制Dnm1的机制,我们对mdiv-1对Dnm1 GTPase活性的影响进行了详细的动力学分析(). 根据我们的分析,我们估计Dnm1的mdivi-1的Ki为1-50μM,在IC的范围内50用于体内mdivi-1。我们的动力学数据很好地符合Monod、Wyman和Changeux的协同转换模型,该模型描述了可形成相同亚单位低聚物的变构蛋白的行为(图S1). 因此,基于这个模型,我们之前已经证明是组装Dnm1的构建块的Dnm1二聚体被预测为以两种状态之一存在:R(松弛和组装)或T(拉紧和未组装),这两种状态彼此平衡,其中R状态与GTP的亲和力相对较高,T与GTP亲和力相对较低。该模型预测,mdivi-1是一种变构抑制剂,对Dnm1的T(未组装)状态具有相对较高的亲和力,而对R(组装)状态的亲和力相对较低,因此意味着mdivi-1通过阻止Dnm1自组装来抑制GTP水解。事实上,mdivi-1对Dnm1的动力学效应与在高离子条件下观察到的动力学效应相似,这种动力学效应可对抗组装(Ingerman等人,2005年). 具体来说,我们观察到mdivi-1增加了表观K0.5对于GTP,降低GTP水解的表观Vmax,并导致在Dnm1 GTP水解反应中观察到的GTP希尔系数增加().
我们通过检测EM对在非水解GTP类似物GMPPCP存在下形成的Dnm1螺旋的影响,直接验证了mdivi-1抑制Dnm1自组装的假设。如所示在自组装反应开始时,mdivi-1在浓度范围内定量阻断GMPPCP依赖的Dnm1自组装,其作用类似于其对体外Dnm1 GTPase活性和体内线粒体分裂的影响。有趣的是,当在GMPPCP-Dnm1螺旋形成后添加mdivi-1时,该化合物没有明显效果,即未能促进其分解(未显示)。鉴于在非水解GMPPCP存在下形成的Dnm1螺旋可能是稳定的,而不是动态结构,我们的观察表明,mdivi-1通过抑制Dnm1聚合而不是促进分解来阻止自组装。
与此一致,我们观察到mdivi-1抑制二聚体中间结构域突变体Dnm1G385D的GTP水解,该突变体在自组装方面存在缺陷(Ingerman等人)(图S2A和图S2B). 对Dnm1G385D动力学数据的分析表明,与Dnm1的协同过渡机制相反,mdivi-1可能是Dnm1G185D的混合型抑制剂,Ki为1-4μM,这显著降低了Dnm1对GTP的亲和力。这些观察结果表明,mdivi-1靶向Dnm1螺旋结构的基本构建块,以阻止聚合。这种机制类似于latrunculin A的作用,它改变肌动蛋白单体亚单位界面,改变核苷酸结合,并阻止F-actin丝的聚合(Morton等人,2000年). 综上所述,我们对mdivi-1对Dnm1活性影响机制的分析表明,它通过与阻止或延缓Dnm1自组装和GTP水解所需构象变化的变构位点结合来抑制分裂。
mdivi-1减弱哺乳动物线粒体分裂
Drp1是哺乳动物的线粒体分支DRP,与它的酵母同源基因Dnm1具有高度的同源性(拉布卢斯等人,1999年). 这鼓励我们利用化学遗传学方法,研究mdivi-1对哺乳动物细胞线粒体形态的影响。在哺乳动物细胞中,当显性阴性Drp1的表达或线粒体分裂蛋白的RNAi阻碍线粒体分裂时,管状线粒体会逐渐变得更加互联,形成网状结构,并坍塌为退化的核周结构(Smirnova等人,2001年;Smirnova等人,1998年).
在培养的哺乳动物细胞(COS)中加入mdivi-1后,可快速可逆地形成线粒体网状结构和退化的核周结构,这与线粒体分裂减弱一致(和补充表1). IC50mdivi-1对哺乳动物细胞线粒体形态的影响50≈50μM)与mdivi-1对酵母线粒体形态的影响(IC50≈10μM)。此外,我们观察到,不影响酵母线粒体形态且不抑制Dnm1 GTPase活性的mdivi-1结构衍生物也不影响COS细胞线粒体形态(补充表4). 因此,mdivi-1对哺乳动物细胞线粒体的作用特征与在酵母细胞中观察到的类似,并进一步表明,mdivi-1通过抑制Drp1活性抑制哺乳动物细胞线粒体分裂。
mdivi-1通过减弱Drp1自组装抑制哺乳动物细胞线粒体分裂答:。在缺乏(左侧面板,DMSO对照)和存在(右侧面板,50μM)mdivi-1的情况下,COS细胞的线粒体形态。B类与转染对照空载体(深灰色条)的细胞相比,过度表达Drp1(浅灰色条)细胞中产生COS细胞线粒体网状结构和核周结构所需的mdivi-1浓度增加。C、。添加staurosporine后,COS细胞中线粒体的网状形态(左图)变得支离破碎(STS,中央图)。mdivi-1可减弱STS诱导的线粒体碎片(50μM,右侧)。D。mdivi-1(50μM,化合物A)和活性衍生物,而非非活性衍生物G和H(各为50μM)抑制STS处理(绿色)刺激的GFP-Drp1在COS细胞中的自组装。底部面板是顶部面板中显示的每个单元的代表区域,并放大了七倍。线粒体用MitoTracker Red CMXRos标记,并以红色显示。所有图像均使用相同的曝光和增益设置获得。尺寸棒为10μm。
为了测试mdivi-1是否靶向Drp1,我们在体外检测了其对重组Drp1 GTPase活性的影响。与对Dnm1的影响相反,mdivi-1对Drp1 GTP水解没有影响。然而,Drp1的最大GTP水解率相对较低(2.1分钟-1)而且,即使在分子拥挤的条件下(未显示),我们也无法通过EM在体外检测到GMPPCP依赖性Drp1螺旋的形成,这表明重组Drp1不能自我组装,因此不能完全发挥功能。
因此,我们询问哺乳动物细胞中Drp1的过度表达是否可以挽救mdivi-1对线粒体形态的影响。如所示,在过度表达Drp1的细胞群体中,观察细胞中网状或塌陷/退化的核周线粒体结构所需的mdivi-1浓度显著更高(IC5075-100μM之间)5010-50μM之间)。此外,与已发表的工作一致,RNAi对Drp1的消耗也会导致细胞中网状或核周线粒体结构的崩溃,用mdivi-1处理这些细胞不会对线粒体形态产生任何额外的变化(未显示)。这些观察结果证实了我们的结论,即线粒体分裂动力蛋白是酵母和哺乳动物细胞中mdivi-1的靶点。
mdivi-1在细胞凋亡过程中减弱哺乳动物线粒体分裂和Drp1自组装
哺乳动物细胞中Drp1介导的线粒体分裂受到凋亡信号的刺激,如staurosporine(STS),其通过Bcl-2蛋白促进固有的凋亡细胞死亡(Frank等人,2001年). 我们研究了mdivi-1对STS引起的哺乳动物COS细胞线粒体断裂的影响(以及表5)。如前所示,STS刺激导致细胞线粒体碎片显著增加((Frank等人,2001年),和补充表2). 相比之下,STS和mdivi-1处理的细胞线粒体碎片显著减少(和表5)。作为对照,我们观察到显性负性Drp1或RNAi介导的Drp1缺失的表达也抑制了STS诱导的线粒体断裂,其程度与mdivi-1相似,这与已发表的观察结果一致(未显示)(Frank等人,2001年). 这些观察结果表明,mdivi-1抑制凋亡刺激的Drp1依赖性线粒体分裂。
为了深入了解mdivi-1抑制Drp1介导的线粒体分裂的机制基础,我们利用了这样一个事实:在细胞凋亡过程中,Drp1的自组装和向线粒体的募集显著增加,这些事件可以通过监测GFP-Drp1在细胞中的行为来轻松分析(Frank等人,2001年). 如所示,添加凋亡刺激物STS导致弥漫定位的GFP-Drp1减少,同时与线粒体相关的GFP-Drp1簇和GFP-Drp2簇数量增加(比较-STS/DMSO和+STS/DMSO细胞中的绿色荧光)。相反,在用STS和mdivi-1(化合物A)或活性化合物B处理的细胞中,大多数GFP-Drp1以类似于未用STS处理细胞中GFP-Drp1的方式弥散分布在细胞质中(,将-STS/DMSO和+STS/DMSO与+STS/A和+STS/B进行比较)。与我们之前的观察一致()正如预期的那样,与仅用STS处理的细胞中的碎片线粒体相比,用STS和mdivi-1(化合物A)或活性化合物B处理的细胞的线粒体呈管状(,红色)。此外,在用STS和非活性mdivi-1化合物G和H处理的细胞中,GFP-Drp1的定位模式和线粒体形态与仅用STS处理的细胞相似(,将+STS/DMSO与+STS/G和+STS/H进行比较)。这些观察结果表明,mdivi-1通过阻断Drp1自组装和Drp1组装结构向线粒体的募集来减弱细胞凋亡过程中的线粒体分裂,这与我们的生化数据一致,表明mdivi-1通过阻断聚合来抑制酵母同源物Dnm1。总之,这些观察结果表明,mdivi-1以线粒体分裂动力蛋白为靶点,在酵母和哺乳动物细胞中以机械保守的方式发挥作用
mdivi-1通过抑制线粒体外膜通透性减轻细胞凋亡
鉴于mdivi-1对STS诱导的线粒体分裂的抑制作用,我们测试了mdivi-1是否也能延缓哺乳动物HeLa细胞的凋亡。我们最初检测了mdivi-1对质膜磷脂酰丝氨酸(PS)外化的影响,这是凋亡细胞死亡中相对较晚的事件(Fadok和Henson,2003年). 我们使用荧光标记(FITC)-膜联蛋白V(一种Ca2+-与PS具有高亲和力的依赖性磷脂结合蛋白,结合已建立的荧光活化细胞分选仪(FACS)方法。如所示,我们观察到,根据FACS分析评估,mdivi-1,而非非活性mdivi-1衍生物G,显著抑制STS诱导的非坏死细胞annexin V染色,表明mdiv-1抑制凋亡。值得注意的是,尽管mdiv-1对STS诱导的凋亡的抑制作用是部分的,但其抑制程度与HeLa细胞中显性阴性Drp1K38A突变过度表达时观察到的抑制程度相当,并且与体内靶向Drp1的mdiv-1一致(Frank等人,2001年和STS诱导的Drp1中的凋亡细胞:通过annexin V分析,Drp1 K38A=0.8)。
mdivi-1及其活性类似物抑制细胞凋亡答:。在存在或不存在活性化合物B(左图)和非活性化合物G(左图)的情况下,对staurosporine处理的Hela细胞进行FACS分析。B。分析mdivi-1衍生物(B和F)对C8-Bid注射HeLa细胞刺激的细胞色素c释放的影响。注射标记物为德克萨斯红(红色),细胞色素c释放用细胞色素c-GFP(绿色)监测。尺寸条为10μm。
为了解决mdivi-1抑制细胞凋亡的问题,我们通过细胞色素c释放来检测其对早期MOMP事件的影响。为了直接刺激MOMP和细胞色素c的释放,向HeLa细胞微量注射caspase-8裂解的重组Bid(C8-Bid)。C8-直接投标(Kuwana等人,2002年;Walensky等人,2006年)或间接(Willis等人,2007年)激活Bax/Bak,导致MOMP和细胞色素c释放。正如预期的那样,通过细胞色素c-GFP融合监测到的细胞色素c释放,在注射有或没有活性mdiv-1衍生物B的标记物德克萨斯红的对照细胞中没有受到刺激(和补充表3). 相反,正如预期的那样,注射C8-Bid的细胞中细胞色素c-GFP的释放受到极大刺激(,DMSO,细胞被德克萨斯红和补充表3). 值得注意的是,活性mdivi-1衍生物B显著抑制C8-Bid刺激的细胞色素c-GFP释放,而非活性mdivi-1衍生物F对C8-Bid刺激的细胞铬c-GFP的释放几乎没有影响(和补充表3). mdivi-1对STS诱导的细胞色素c释放也有类似作用(图S3). 总之,我们的结果表明,mdivi-1抑制线粒体分裂dynamin-Drp1的活性,因此通过阻断Bax/Bak依赖的MOMP阻止内在途径的早期凋亡。
为了进一步验证这一结论,我们检测了mdivi-1对C8-Bid诱导的BAK依赖性细胞色素c从分离的野生型小鼠肝线粒体释放的影响(). 通过使用抗细胞色素c对线粒体衍生上清液和颗粒组分进行western blot分析,当单独测试时,mdivi-1衍生物对体外细胞色素c释放没有影响(). 与此相反,正如预期的那样,添加重组活性C8-Bid大大刺激了细胞色素c的释放(). 值得注意的是,添加mdivi-1以及活性mdivi-1-like化合物B和C,明显阻止了C8-Bid诱导的细胞色素C释放,而缺乏疗效的mdivi-1衍生物要么失败,要么对细胞色素C的释放影响相对较小(,比较化合物A-C和D-H)。此外,在MxCre-bak-/-BAX-/-肝脏的bak/BAX双敲除线粒体中,检测了mdivi-1和活性mdivi-1化合物抑制C8-BID诱导的、BAX依赖的细胞色素c释放的能力()补充有单体全长BAX。
mdivi-1及其活性类似物体外抑制激活的Bax/Bak依赖型MOMP答:。通过监测小鼠肝线粒体细胞色素c体外释放,分析mdivi-1及其类似物对MOMP的影响。B。用C8-Bid刺激小鼠肝线粒体,分析mdivi-1及其类似物对体外MOMP的影响。C类mdivi-1及其类似物对C8-Bid刺激的MOMP的影响取决于Bax的存在。如A和B所述,使用从经polydIdC处理的MxCre-bak的肝脏中分离的线粒体进行检测-/-bax(巴克斯)(f)/-老鼠。D。mdivi-1及其类似物不直接抑制Bid-activated Bax对大单层囊泡的通透性。按照方法所述,通过过滤分析,通过释放封装的荧光素提取物来监测渗透性。
这些发现表明,mdivi-1和活性衍生物通过阻止Bax和Bak的完全Bid依赖性激活来抑制细胞色素c的释放。最后,作为对照,我们使用一种已建立的大单层囊泡(LUV)释放试验(其中LUV预载荧光素-右旋糖酐)来检测mdivi-1衍生物是否直接影响Bid-dependent Bax诱导的膜通透性(Kuwana等人,2002年). 如所示通过C8-Bid/Bax诱导的渗透作用,LUV释放的荧光素-右旋糖酐的量不受mdivi-1和mdivi-1衍生物的添加的影响,mdiv-1-化合物本身也不会引起显著的渗透作用。这些观察结果表明,mdivi-1不会通过直接抑制C-8 Bid激活的Bax来阻断MOMP。因此,我们的数据表明,mdivi-1通过抑制线粒体分裂动力蛋白(上游功能)与Bcl-2蛋白的自组装,直接刺激Bcl-2介导的外膜通透性,从而减弱MOMP。与此结论一致,我们观察到存在显著水平的Drp1,并且在体外与线粒体膜共分离(未显示)。
讨论
DRP自组装机理
在本研究中,我们确定mdivi-1是线粒体分裂动力蛋白的第一个选择性抑制剂。mdivi-1的抑制机制与更通用的DRP抑制剂Dynasore不同,Dynasorie是最近在一个动态-1 GTPase活性抑制剂的化学筛选中发现的(Macia等人,2006年). Dynasore通过在组装和未组装状态下与GTPase结构域结合,以非竞争方式抑制dynamin-1、dynamin-2和Drp1的GTP水解。我们的数据表明,mdivi-1通过与不通过GTPase结构域发挥作用的变构位点结合,选择性抑制线粒体分裂DRP的活性。结合后,mdivi-1产生或稳定未组装的、可能是二聚体的Dnm1的构象形式,该构象形式可以结合GTP,但亲和力明显较低。这种依赖于mdivi-1的构象状态不能组装成Dnm1长丝/螺旋,这表明mdivi-1通过阻止其聚合而不是通过导致分解来抑制分裂DRP。与Dnm1突变体Dnm1K41A相比,Dnm1/mdivi-1复合物的行为既有相似又有有趣的差异。与Dnm1/mdivi-1类似,Dnm1K41A能够结合GTP,但不能水解GTP,然而,与Dnm1/1不同,Dnm1 K41A可以聚合成GMPPCP依赖的螺旋状结构(Naylor等人,2006年). 这增加了mdivi-1结合特异性阻断GTP诱导的Dnm1构象变化的可能性,这些构象变化是促进自组装所必需的。有趣的是,mdivi-1还通过装配缺陷二聚体Dnm1G385D抑制GTP水解。这一发现表明Dnm1G385D不是零级组装中间体,这与我们的数据一致,即在较高浓度下,Dnm1G185D可以经历自组装所需的构象变化(未显示)。mdivi-1的作用机制强调了DRP的构象可塑性,以及调控构象变化对这些蛋白质的自组装至关重要。
Drp1在MOMP中的作用
Drp1在哺乳动物细胞凋亡中的分子作用一直难以捉摸,因为在细胞凋亡过程中,Drp1介导的线粒体分裂和MOMP都是尚未暂时解决的早期凋亡事件(Martinou和Youle,2006年). 这种时间联系增加了Drp1作为线粒体碎片导致MOMP和细胞凋亡的可能。我们的数据表明,在MOMP期间,Drp1的功能与线粒体分裂和断裂本身无关,因此表明Drp1在哺乳动物细胞中具有多种功能。值得注意的是,我们发现mdivi-1抑制体外分离线粒体中由C8-Bid诱导的Bak/Bax依赖性MOMP,其中MOMP前后线粒体的EM分析表明线粒体没有分裂(Scorrano等人,2002年). 此外,我们的数据表明,mdivi-1不抑制缺乏Drp1的C8-Bid/Bax依赖性脂质体的通透性,这与mdivi-1通过Drp1抑制MOMP一致。因此,我们的数据表明,Drp1作用于上游或与Bcl-2蛋白一起直接调节MOMP。
我们对哺乳动物细胞中mdivi-1机制的分析表明,它在细胞凋亡过程中阻断了Drp1的自组装,并表明Drp1自组装对其在MOMP中的作用至关重要。一种可能性是,Drp1直接与Bid-activated Bax/Bak相互作用并共同组装,形成一种对MOMP和线粒体分裂更为活跃的复合物。与此一致,通过EM和光学显微镜,Drp1与Bax在与线粒体收缩位点相关的线粒体外膜上簇合定位(Karbowski等人,2002b). 此外,在细胞凋亡过程中,线粒体上的Drp1簇表现出的动态行为在Bax募集到线粒体后显著丢失,这表明Drp1的生化特性以Bax依赖的方式发生改变(Wasiak等人,2007年). 因此,Drp1/Bax/Bak复合物的MOMP和分裂活性可以通过构象变化而改变,或者更间接地通过补充脂质(如心磷脂)而改变,这些脂质是Bax依赖性膜通透性体外所需的。
Drp1在凋亡过程中的另一个可能机制是通过调节线粒体融合机制对MOMP产生影响。最近的研究表明,在健康细胞中,Bax和Bak需要维持线粒体融合活性的正常水平,并改变线粒体外膜融合蛋白Mfn2的行为(Karbowski等人,2006年). 这与Bak/Bax在细胞凋亡中的作用形成对比,Bax和Mfn2如Drp1一样,在细胞凋亡过程中被激活后,共同定位于外膜上的簇中,线粒体融合减弱(Karbowski等人,2004年;Karbowski等人,2002a). 因此,激活Bax/Bak复合物的Drp1募集可能会改变它,导致Mfn2依赖性融合活性的抑制,这反过来可能通过控制嵴结构促进MOMP(Germain等人,2005年). 事实上,有报道称,HeLa细胞中Drp1的RNAi缺失并不影响细胞凋亡过程中线粒体SMAC/Diablo的释放,而是减弱细胞色素c的释放,而细胞色素c被固定在嵴中(Estaquier和Arnoult,2007年;Parone等人,2006年). 相反,我们观察到,体外mdivi-1阻断了线粒体对SMAC/Diablo的C8-Bid Bax/Bak依赖性释放,表明mdivi-1对MOMP具有一般影响,并且可能不会通过嵴结构的改变发挥其作用(未显示)。这种差异可能是这些研究中用于抑制Drp1功能的方法大不相同的结果,即RNAi耗尽Drp1与药物介导的Drp1功能阻滞。
不管机制如何,Bcl-2和线粒体分裂和融合蛋白似乎已经进化形成了一个调节网络,其功能是感知细胞的健康状态。最近对无脊椎动物蠕虫和苍蝇模型的研究表明,Drp1在线粒体断裂和细胞死亡中具有调节作用,表明该网络是保守的。然而,线粒体分裂和融合蛋白似乎不是凋亡途径的重要组成部分(Abdelwahid等人,2007年;Estaquier和Arnoult,2007年;Frank等人,2001年;Goyal等人,2007年;Parone等人,2006年;Wasiak等人,2007年). 与这一观察结果一致,我们发现mdivi-1仅通过在抑制MOMP的途径早期发挥作用来部分阻断细胞凋亡。因此,Drp1的翻译后修饰可能受到细胞应激的调节,并调节Drp1的自组装,以协调和积极地激活细胞凋亡。事实上,证据表明Drp1通过磷酸化、泛素化和琥珀酰化进行共价修饰,这些修饰调节Drp1的活性(Harder等人,2004年;Nakamura等人,2006年;田口等人,2007年).
Drp1在细胞凋亡中发挥的关键积极调节作用使其成为神经退行性疾病、中风和心肌梗死的诱人药物靶点,在这些疾病中,抑制细胞凋亡可能具有治疗益处。此外,Drp1是神经退行性疾病(Charcot-Marie Tooth 2A型和常染色体显性视神经萎缩)的合理靶点,这两种疾病分别由线粒体融合蛋白Mfn2和OPA1突变引起。与哺乳动物细胞融合丧失相关的主要表型之一是线粒体呼吸功能丧失,部分原因是线粒体过度分裂导致线粒体亚群内线粒体DNA丢失,这可能是导致这些神经退行性疾病病因的重要因素(Chan,2006一,b条;陈和陈,2006;Chen等人,2005年;Olichon等人,2006年;Parone等人,2006年). 事实上,线粒体融合的基本作用之一是提供一种交换机制,使细胞内的所有线粒体都能获得线粒体DNA及其产物(Hoppins等人,2007年). 减少线粒体分裂和增加线粒体连接性可能有助于人类许多异质线粒体DNA相关疾病中的某些疾病。因此,我们的结果表明,mdivi-1是哺乳动物细胞线粒体分裂和凋亡的选择性抑制剂,具有潜在的重大临床意义,因为它们为许多疾病揭示了一个有希望的新靶点和治疗方法。
实验程序
线粒体分裂抑制剂的化学遗传筛选
菌株:RDY84(W303背景:ade公司2-1他的3 -11,-15信托收据1-1可以1-100pdr1型::KanR(右) 个人数据记录器3::他的5+,是布里格姆女子医院病理科Russell Dorer的礼物)被划入JNY539(赫尔曼等人,1998年,W303背景:ade公司2-1他的3-11,-15信托收据1-1可以1-100fzo1型::fzo公司1-1),二倍体产孢,四分体解剖获得ACY201(ade公司2-1他的3-11,-15信托收据1-1可以1-100脉冲多普勒雷达1::菅直人R(右) 脉冲多普勒雷达3::His5+fzo公司1个:fzo公司1-1). RDY84与JNY905交叉(ade公司2-1他的3-11,-15信托收据1-1可以1-100域名管理1::His3),二倍体孢子化,四分体解剖获得ACY208(ade公司2-1他的3 -11,-15信托收据1-1可以1-100pdr1型::KanR(右) 脉冲多普勒雷达3::他的5+域名管理1::他的3)。
筛查在ICCB-Longwood筛查设施(马萨诸塞州波士顿)进行。ACY201细胞,密度1.2×104使用Bio-Tek Precision 2000机器人将每个孔的细胞校准成384孔板。使用精工针转移机器人向每个孔中添加100 nl的每种化合物(每种化合物在DMSO中的浓度为5 mg/ml或~15 mM)。每块板制作四份。两份拷贝在24°C的潮湿室中培养,两份在37°C的湿润室中培养。3天后,通过评估浊度对单个微孔中的细胞进行生长评分。筛选了来自以下商业图书馆的代表性小分子:Bionet、Cerep、Maybridge、NCI Diversity和Peakdale。
使用基于网络的ChemNavigator程序鉴定了市场上可买到的mdivi-1结构类似物。在所有分析中测试的小分子在DMSO中以10 mg/ml的速度重新悬浮,并在-20°C下干燥储存。本研究中使用的所有商业化合物均通过质谱法进行了验证。
化验
本研究中描述的所有使用小分子的实验都是双盲的。选择了具有代表性的图像,并在不知道被测化合物身份的情况下进行量化。使用一组已建立的基于酵母和哺乳动物细胞的体外试验分析这些化合物。这些在手稿的补充数据部分有详细描述。