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《维罗尔杂志》。2007年10月；81(20): 11106–11115.
2007年8月1日在线发布。 doi（操作界面）：10.1128/JVI.01063-07
PMCID公司：项目编号：C2045534
PMID：17670836

应激诱导GADD34蛋白通过哺乳动物丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶mTOR途径抑制病毒复制▿

卡霍里·米纳米,1 田部幸弘,2 渡边良介,1 高弘·伊索诺,三 羽田Masataka,4 Isobe健一,4 小林俊之,5 奥基奥·日野,5 冈部英寿,1 德川弘,1,6和井上弘子2,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

GADD34是一种由多种应激源诱导的蛋白质，包括DNA损伤、热休克、营养剥夺、能量消耗和内质网应激。在这里，我们证明了由水疱性口炎病毒（VSV）感染诱导的GADD34抑制了野生型（WT）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中的病毒复制，而GADD34-KO缺陷型（GADD34-KO）MEF中的复制增强。GADD34的逆转录病毒基因拯救降低了GADD34-KO MEF中增强的病毒复制。GADD34-KO MEF中VSV蛋白的表达水平显著高于WT MEF。在GADD34-KO MEFs中，eIF2α的磷酸化和细胞蛋白合成都与病毒复制无关。另一方面，mTOR下游蛋白S6和4EBP1的磷酸化在WT MEF中被VSV感染抑制，但在GADD34-KO MEF则没有。GADD34能够与TSC1/2结合，并在Thr1462对TSC2进行去磷酸化。TSC2-null细胞的VSV复制高于TSC2-expressing细胞，并且组成活性Akt增强了VSV复制。另一方面，雷帕霉素，一种mTOR抑制剂，显著抑制了GADD34-KO MEFs中VSV的复制。这些发现表明，VSV感染诱导的GADD34通过mTOR通路抑制病毒复制，表明应激诱导的GADD34和mTOR信号通路之间的相互作用在抗病毒防御中起着关键作用。

GADD34公司(克罗思一rrest和D类不适用d日amage蛋白34）属于一个蛋白家族，其表达因生长停滞和DNA损伤而增加(12,43). 在细胞应激（如热休克）条件下，它也是翻译的主要调节器(16)、营养剥夺(26)，能量消耗(41)，以及暴露于导致内质网（ER）中蛋白质不正确折叠的试剂(27). 细胞通过丝氨酸51处真核翻译起始因子2α（eIF2α）的磷酸化关闭蛋白质合成来应对应激(14). 磷酸化eIF2α诱导GADD34的表达，GADD34与蛋白磷酸酶1（PP1）形成功能复合物，去磷酸化eIB2α，从而导致蛋白质合成的恢复(27). 对GADD34缺乏小鼠的研究表明，GADD34是eIF2α去磷酸化和从内质网应激导致的蛋白质合成中断中恢复所必需的(22). 这些过程似乎与细胞应激条件下的翻译控制密切相关。虽然病毒感染已被证明通过PKR和PERK磷酸化eIF2α诱导GADD34(7)GADD34在病毒感染中的作用尚待阐明。雷帕霉素（TOR）是一种进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞应激反应中翻译机制的另一个调节器。哺乳动物TOR同源物mTOR通过磷酸化主要的mTOR靶点、核糖体蛋白S6激酶（S6K）和真核生物起始因子4E结合蛋白（4EBP1）来刺激蛋白质合成。mTOR通过磷酸化S6K和4EBP1调节翻译，在控制细胞生长中发挥关键作用(11,19,35,42). S6K和4EBP1的磷酸化通过改变蛋白质合成速率来传递营养素和生长因子信号。结节性硬化综合征1(TSC1类)和TSC2系统基因分别编码肿瘤抑制因子hamartin和tubin，它们是mTOR通路的有效抑制剂(2,11,19,35,42). 各种类型的细胞应激，如葡萄糖(18)或氨基酸饥饿(13)和缺氧(5)，激活TSC1/TSC2功能并抑制mTOR功能，从而抑制蛋白质合成(30).

虽然mTOR和GADD34介导的信号通路被认为是独立调节的，但我们之前已经证明，由能量耗竭诱导的GADD34与TSC1/2形成稳定的复合物，并抑制mTOR信号通路(41). 这一发现表明GADD34和mTOR信号通路之间的相互作用调节了蛋白质合成机制以应对环境应激。在本研究中，我们利用感染水疱性口炎病毒（VSV）的GADD34缺陷（GADD34-KO）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）研究了GADD34在抗病毒保护中的作用，并揭示GADD34通过抑制mTOR通路抑制病毒复制。

材料和方法

材料。

抗人GADD34（H-193）、抗TSC2（C-20）、抗eIF2α（FL-315）和抗Myc（9E10）抗体购自圣克鲁斯生物技术公司。抗血凝素（anti-HA）（3F9）大鼠高亲和力抗体来自Roche。抗α-微管蛋白（DM1A）和抗β-肌动蛋白抗体购自Sigma。抗磷蛋白eIF2α（Ser51）抗体购自Biosource International。抗磷酸S6（Ser240/244）、抗磷酸4EBP1（Thr37/46）、抗TSC1、抗Akt、抗磷酸Akt（Ser473）抗caspase 3和抗caspase12抗体购自Cell Signaling Technology。抗VSV抗体由Bin Gotoh（志贺医科大学）提供。雷帕霉素购自LC实验室。全长人类GADD34（GenBank登录号：。电话：003067)从Open Biosystems购买并亚克隆到Myc-tagged pcDNA3载体或pCXbsr逆转录病毒载体(1).

细胞和病毒。

GADD34-KO公司(22)和野生型（WT）MEF在添加10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中培养。TSC2-空（TSC2−)细胞来源于Eker大鼠肾癌(28). 稳定TSC2表达（TSC2+)细胞由TSC2生成−通过导入表达人质粒的细胞TSC2系统cDNA（GenBank登录号NM000548）(28). TSC2系统−和TSC2+细胞在添加10%FBS的RPMI培养基中培养。F2408是大鼠成纤维细胞系。含有组成活性（肉豆蔻酰化）Akt表达质粒（pcDNA3-Myr-Akt）和载体质粒（pcDNA A3）的F2408细胞在添加5%FBS的DMEM中培养。293T、Vero和3Y1细胞在添加10%FBS的DMAM中培养。VSV（新泽西株）、单纯疱疹病毒1型（HSV-1）（KOS株）、，和小鼠Rous肉瘤病毒（MRSV），一种含有病毒-src公司以小鼠白血病病毒为辅助物的癌基因(29)，用于本研究。通过插入人GADD34 cDNA（GenBank登录号：。BC003067号)转化为逆转录病毒载体pCXbsr(1). 根据先前描述的方法，用pCXbsr/GADD34或pCXbsr转导GADD34-KO MEF(38). 在存在速效杀菌素（5μg/ml）的情况下选择病毒感染的细胞，收集、扩增抗速效杀菌剂细胞，并用于后续实验。

VSV和HSV-1的菌斑检测。

接种5×105WT或GADD34-KO MEF细胞用含有DMEM的60-mm培养皿培养，补充10%FBS。培养24小时后，将病毒以每细胞0.3或100 PFU的感染倍数（MOI）添加到培养物中。在37°C下培养1 h后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗细胞一次，并向培养物中添加5 ml含有2%FBS的DMEM。然后将病毒感染的培养物进一步培养24小时（MOI，0.3）或14小时（MO，100）。收集细胞和培养基，通过冻融并以2000 rpm离心裂解裂解液20 min来制备病毒储备，以清除细胞碎片。使用Vero细胞的菌斑法测定病毒储备的滴度，以确定其传染性。单层Vero细胞被几种稀释的病毒库存感染，并在37°C下培养1小时。然后通过洗涤去除未吸附的病毒，并向培养物中添加添加2%FBS和0.4%甲基纤维素的DMEM覆盖层。培养物培养至斑块可见（～24小时），然后固定在甲醛中，并用20%乙醇中的1%结晶紫染色。

MRSV焦点分析。

接种2×105在含有添加10%FBS的DMEM的60mm培养皿中进行MEF细胞的培养。培养16小时后，用聚布伦（2μg/ml）处理细胞30分钟，并感染MRSV(29). 感染后第三天，从MRSV感染的MEF中回收培养基并进行过滤；然后在3Y1细胞中检测滴度。感染后10天，统计转化灶的数量。

35S代谢标记。

病毒和模拟感染的细胞培养物在补充有透析2%FBS的DMEM中培养13小时，新合成的蛋白质用Tran标记35S-label（100μCi/皿）（MP Biomedical，Inc.），在补充有透析的2%FBS的无蛋氨酸和半胱氨酸DMEM中放置30分钟。在含有20 mM Tris-HCl（pH 7.4）、150 mM NaCl、5 mM EDTA、1%Triton X-100、1%脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）、，和1%蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Nacalai Tesque），在10000×克温度为4°C。用1毫升三氯乙酸沉淀20微升上清液，并使用液体闪烁计数器测量标记蛋白质的放射性。还使用Bio-Read蛋白质分析试剂盒分析了裂解产物的蛋白质含量。35S掺入表示为每分钟每蛋白计数（μg）。

免疫沉淀。

将细胞在含有20mM Tris-HCl（pH 7.4）、150mM NaCl、5mM EDTA、1%Triton X-100、1%脱氧胆酸钠、0.1%SDS、1%蛋白酶抑制剂混合物（Nacalai Tesque）和1%蛋白磷酸酶抑制剂混合物（Sigma）的RIPA缓冲液中裂解，并在10000×克温度为4°C。将上清液与一级抗体在4°C下孵育1 h。免疫复合物与蛋白G-Sepharose在4°C下结合1 h，并用RIPA缓冲液洗涤三次。通过添加含有62.5 mM Tris-HCl（pH 6.8）、10%甘油、5%2-巯基乙醇、2%SDS和0.01%溴酚蓝的Laemmli-SDS样品缓冲液并煮沸3分钟，洗脱与蛋白G-Sepharose结合的蛋白质。在10000×克培养2min后，对上清液进行免疫印迹分析。

免疫印迹分析。

细胞在Laemmli SDS样品缓冲液中溶解。对细胞裂解物样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并将分离的蛋白质电转移至膜过滤器（Immobilon-P；Millipore）。用含有5%牛血清白蛋白（BSA）的TBS-T（10 mM Tris-HCl[pH7.6]，150 mM氯化钠，0.1%吐温20）封闭过滤器后，在4°C的温度下，将过滤器与含有2%BSA的TBS-T中指示的一级抗体孵育过夜。然后在TBS-T中清洗过滤器，并在辣根过氧化物酶结合抗鼠、抗兔或抗鼠免疫球蛋白G（IgG）（GE Healthcare Bio-Science Corp.）中孵育1小时，后者在含有2%BSA的TBS-T稀释液中稀释1:2000。用TBS-T多次清洗后，根据制造商推荐的程序，使用ECL系统（GE Healthcare Bio-Science Corp.）检测免疫反应。

免疫荧光分析。

细胞在Biocoat poly上培养过夜-我-赖氨酸细胞器室滑动（四孔；Becton Dickinson）至70%汇合，然后在100的MOI下感染VSV。孵育后，用1%多聚甲醛固定细胞10分钟，用0.1%Triton X-100渗透5分钟，用兔抗VSV血清以1:100的稀释度孵育过夜。然后用PBS清洗盖玻片，然后用Alexa 488抗兔IgG抗体结合二级抗体（分子探针）和碘化丙啶（PI）孵育盖玻片。用PBS清洗盖玻片以去除多余的荧光染料后，用Prolong Antifade（分子探针）将其安装。在相同条件下，使用配备电荷耦合器件相机（徕卡微系统公司）的荧光显微镜对标本进行观察和拍照。

逆转录PCR（RT-PCR）。

使用TRIzol（Invitrogen）从细胞中分离出总RNA，并使用Superscript III逆转录酶和寡核苷酸（dT）合成第一链cDNA12-18底漆（Invitrogen）。使用以下基因引物序列：小鼠GADD34，5′-CTGCAAGGCTGTGATAAGAGG（正向）和5′-AGGGGTCAGCCTTTTTTCT（反向）；小鼠GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、5′-CATGACAACTTGGCATTGTG（正向）和5′-GTTGAGTCGGAGACAAC（反向）。根据以下方案，PCR包括GADD34的26个周期和GAPDH的21个周期：95°C下变性20 s，55°C下退火20 s，72°C下延伸30 s。

结果

在感染VSV的GADD34-KO MEFs中增强病毒复制。

为了阐明GADD34在病毒感染中的作用，用VSV感染WT和GADD34-KO MEF细胞，然后用RT-PCR检测GADD34 mRNA的诱导。作为内质网应激诱导剂的衣霉素被用作WT MEF中GADD34 mRNA诱导的阳性对照（图。1A和B). 如图所示。​图1，1在MOI为0.3时，VSV感染后9和3 h诱导GADD34 mRNA的表达（图。​（图1A）1安培)和100（图。​（图1B），1B年)分别在WT MEF中，但GADD34-KO MEF未观察到诱导。在感染VSV（MOI，0.3）的GADD34-KO MEF中，在感染后18小时观察到细胞死亡，而WT MEF的细胞死亡可以忽略不计（图。​（图1C）。1摄氏度). 如图所示。​图1D，一维GADD34-KO MEF感染后14 h开始检测到caspase 3和12的显著激活，而WT MEF在感染后14小时开始检测到这两种caspase的弱激活，表明VSV感染MEF的细胞死亡是caspase介导的凋亡。为了评估WT和GADD34-KO MEF中的病毒复制，使用菌斑试验在Vero细胞中检测病毒感染的MEF中产生的感染性VSV的滴度。在感染后24小时（MOI，0.3）或14小时（MOI，100），与野生型MEFs相比，GADD34-KO MEFs中感染性VSV的产生在MOI为0.3（42倍）和100（20倍）时显著升高（图。​（图2A），2安培)，表明GADD34抑制VSV复制。为了验证GADD34对病毒复制的抑制作用，我们使用逆转录病毒载体将GADD34导入GADD34-KO MEF（图。​（图2B）2B型)并检测了这些细胞中的VSV复制。如图所示。​图2C，2摄氏度GADD34拯救GADD34-KO MEF显著抑制了VSV的复制。综上所述，这些结果表明VSV诱导GADD34是抑制病毒复制的原因。

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WT和GADD34-KO MEF中GADD34 mRNA的诱导。WT和GADD34-KO MEF感染了VSV。（A和B）GADD34 mRNA的诱导。WT和GADD34 MEF在MOI为0.3（A）和100（B）时感染VSV，并按照材料和方法中的描述通过RT-PCR研究GADD34的诱导。内质网应激诱导剂Tunicamycin（Tn）以2μg/ml的浓度诱导24 h，作为GADD34 mRNA诱导的阳性对照。GAPDH mRNA作为内部对照进行监测。（C） MOI为0.3时，感染VSV的WT和GADD34-KO MEF的细胞形态变化。（D） 感染VSV的WT和GADD34-KO MEF中caspase 3和12的激活（MOI，0.3）。使用材料和方法中描述的caspase 3、caspase 12和α-微管蛋白抗体进行免疫印迹分析。

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GADD34抑制病毒复制。（A） 在MOI为0.3（左）和100（右）时，比较感染VSV的WT（封闭栅）和GADD34-KO（开放栅）MEF中的病毒复制。按照《材料和方法》中的描述，在感染后24小时（MOI，0.3）和12小时（MO，100），在Vero细胞中测定感染性VSV的滴度。还显示了斑块分析的图像。在三个重复的孔中进行分析。每个条形表示平均值±标准偏差。（B） 感染含人GADD34基因逆转录病毒载体的GADD34-KO MEF中外源GADD34的免疫印迹分析。α-管蛋白被用作内部对照。pCX和GADD34分别表示用载体病毒pCXbsr或表达GADD34的病毒pCXbsr/GADD34感染的GADD34-KO MEFs。（C） 用控制（pCX）（开放条）或GADD34表达（GADD34）（封闭条）载体转导的GADD34-KO MEF中的病毒复制。检测感染后24小时Vero细胞中的感染性VSV滴度（MOI，0.3）。还显示了斑块分析的图像。在一式三份的井中进行分析。每个条形表示平均值±标准偏差。（D） 通过感染MRSV或HSV-1诱导GADD34 mRNA。从感染MRSV（感染3天后）或HSV-1（感染3小时）的MEF中分离出细胞RNA。（E） 在WT（封闭式酒吧）和GADD34-KO（开放式酒吧）MEF中复制MRSV。通过3Y1细胞的转化聚焦能力评估感染后5天的MRSV滴度（MOI，0.01）。在重复的培养皿中进行分析。每个条形表示平均值±标准偏差。（F） 在WT（封闭式酒吧）和GADD34-KO（开放式酒吧）MEF中复制HSV-1。在Vero细胞中测定感染后24小时的感染性HSV滴度（MOI，0.3）。在三个重复的孔中进行分析。每个条形表示平均值±标准偏差。

为了评估GADD34是否也能抑制其他病毒的复制，WT和GADD34-KO MEF被MRSV感染，MRSV是一种含有病毒的小鼠重组逆转录病毒-src公司致癌基因(29)或HSV-1。如图所示。​图2D，二维仅在感染MRSV和HSV-1的WT MEF中观察到GADD34 mRNA的诱导。在MRSV病例中，根据病毒在3Y1细胞中形成转化灶的能力来评估病毒复制。与WT MEF相比，GADD34-KO MEF中MRSV复制显著升高（图。​（图2E）。第二版). 另一方面，通过菌斑试验检测Vero细胞中HSV-1的复制在WT和GADD34-KO MEF中相似（图。​（图2F）。2楼). 这些结果表明，GADD34对病毒复制的影响不仅限于VSV，尽管这种影响在病毒中并不常见。

为了排除WT和GADD34-KO MEF之间所观察到的病毒复制差异是由于病毒感染效率不同所致的可能性，采用抗VSV血清的免疫荧光法评估VSV蛋白的表达。如图所示。​图3A，3A级WT（96%）和GADD34-KO（100%）MEF中表达病毒蛋白（绿色荧光）的细胞百分比相似，但在VSV感染后6h，GADD34-GO MEF中每个细胞的免疫荧光强度都强于WT MEF。免疫印迹分析显示，VSV感染后14小时，GADD34-KO MEF中VSV蛋白的表达水平显著高于WT MEF（图。​（图3B）。3B公司). 这些结果表明，尽管VSV同样感染WT和GADD34-KO MEF，但WT MEF中病毒蛋白的生成量较低，GADD34-GO MEF中的病毒蛋白生成量较高，表明WT MEFs中VSV复制的抑制是由于VSV蛋白的生成减少所致。

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感染VSV的WT和GADD34-KO MEF中病毒和细胞蛋白的合成和eIF2α的磷酸化。（A） 免疫荧光法检测VSV感染的WT和GADD34-KO MEF中病毒蛋白的表达（MOI，100）。感染后6小时，根据材料和方法中描述的程序，使用稀释的兔抗VSV血清和Alexa 488标记的抗兔IgG进行检测。同时进行PI染色。绿色荧光表示VSV蛋白的表达。红色荧光表明细胞核被PI染色。在荧光显微镜下观察到荧光。右侧显示了红色荧光阳性细胞中绿色荧光阳性细胞的百分比。（B） VSV感染的WT和GADD34-KO MEF中病毒蛋白的免疫印迹分析（MOI，100；感染后14 h）。用稀释的兔抗VSV血清探测印迹。β-肌动蛋白的表达被用作内部对照。（C） eIF2α的磷酸化。使用材料和方法中描述的抗磷酸化eIF2α（Ser51）和抗eIF2β抗体进行免疫印迹分析。对每条带的强度进行了量化，并给出了磷酸化eIF2α（p-eIF2 al/eIF2α）的比率。β-肌动蛋白的表达被用作内部对照。（D） 病毒感染对WT和GADD34-KO MEF细胞蛋白合成的影响。细胞感染VSV（MOI，100），孵育13 h，并用Tran标记35S标记30分钟。标记细胞在RIPA缓冲液中溶解35如材料和方法中所述测量S的掺入。在重复的培养皿中进行分析。每个条形表示平均值±标准偏差。

感染VSV的WT和GADD34-KO MEF中eIF2α磷酸化和细胞蛋白合成。

在病毒感染期间，eIF2α在Ser51被PKR和PERK磷酸化，以关闭细胞蛋白合成。为了阐明GADD34抑制病毒复制的机制，我们首先评估了感染VSV（MOI，100）的WT和GADD34-KO MEF中Ser51处eIF2α磷酸化的变化。如图所示。​图3C，3C公司在WT MEF中，Ser51处eIF2α的磷酸化在感染后6 h增加，但在感染后14 h降低，这表明VSV感染在感染早期（6 h）增加了eIF2的磷酸化但磷酸化eIF2α诱导的GADD34在感染后期（14h）与PP1联合去磷酸化eEF2α。另一方面，GADD34-KO MEF中磷酸化eIF2α的基线水平（0 h）高于WT MEF（0 h。后者，即使在感染后期（14小时），磷酸化水平仍保持增加。这些结果表明，eIF2α磷酸化的增加并不总是与抑制病毒复制相关。为了阐明VSV在GADD34-KO细胞中复制增强是否是由于细胞蛋白质合成的失调，我们评估了VSV感染对WT和GADD34-GO MEF细胞蛋白质合成产生的影响。VSV或模拟感染细胞被标记为[35S] 感染后13小时蛋氨酸维持30分钟（MOI，100），并比较合并放射性水平。如图所示。​图3D，三维在WT和GADD34-KO MEF中，病毒感染细胞中正在进行的蛋白质合成均显著降低，表明eIF2α磷酸化的翻译抑制不会导致GADD34-GO MEF中VSV复制的抑制。

GADD34对VSV感染MEF中mTOR通路的抑制。

蛋白质合成的另一个重要调节机制是mTOR信号通路，它被能量消耗、营养剥夺和缺氧等应激源通过激活TSC1/2而抑制(11,19,30,35,42). 最近，我们报道了GADD34与TSC1/2形成稳定的复合物，去磷酸化TSC2，并在葡萄糖饥饿条件下抑制mTOR信号(41). 为了评估mTOR通路在GADD34抑制病毒复制中的作用，我们研究了感染VSV（MOI，100）的WT和GADD34-KO MEF中S6和4EBP1的磷酸化变化，这两种蛋白都是mTOR下游的蛋白。如图所示。​图4A，4A级感染后14 h，WT MEF中S6（Ser240/244）和4EBP1（Thr37/46）的磷酸化被抑制，但GADD34-KO MEF没有。这些结果表明，VSV感染诱导的GADD34可抑制mTOR通路。为了评估GADD34通过TSC1/2负调控mTOR通路的能力，将293T细胞与Myc标记的GADD34和HA标记的TSC2/Myc标记的TSC1共转染；GADD34与TSC1/2的结合以及TSC2在Thr1462的磷酸化，已知Thr1462被Akt磷酸化以激活mTOR途径(17)，然后进行调查。如图所示。​图4B，4B类TSC2与抗HA抗体免疫沉淀后与Myc-tagged GADD34和TSC1相互作用，表明GADD34能够与TSC1/2形成复合物。在同一个共转染实验中，我们还评估了TSC2在Thr1462的磷酸化。如图所示。​图4C，4摄氏度，TSC2被GADD34显著去磷酸化。内源性Akt在Ser473的磷酸化不受GADD34表达的影响，表明TSC2在Thr1462的磷酸化降低不是由Akt激酶介导的（图。​（图4C）。4摄氏度). 为了证实GADD34和mTOR通路的相互作用，在GADD34-KO MEF中检测了GADD34对TSC2、S6和4EBP1磷酸化的影响。如图所示。​图4D，4D（四维）逆转录病毒载体异位表达GADD34显著抑制了GADD34-KO MEF中TSC2（Thr1462）、S6（Ser240/244）和4EBP1（Thr37/46）的磷酸化。这些结果表明，GADD34在病毒感染期间通过结合TSC2和去磷酸化TSC2发挥mTOR通路的负调控作用。

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GADD34对mTOR通路的抑制作用。（A） 感染VSV的WT和GADD34-KO MEF中S6和4EBP1磷酸化的变化（MOI，100）。使用材料和方法中所述的指示抗体进行免疫印迹分析。对每条带的强度进行了量化，并给出了磷酸化比率（p-S6/S6，p-4EBP1/4EBP1）。β-肌动蛋白的表达被用作内部对照。（B） GADD34和TSC1/2之间的相互作用。将HA标记的TSC2/Myc标记的TSC1与Myc标记的GADD34在293T细胞中进行共转染。用抗Myc和抗HA抗体分析抗HA抗体免疫沉淀的蛋白复合物。免疫沉淀；IB，免疫印迹。（C） GADD34抑制293T细胞中TSC2在Thr1462的磷酸化。将HA标记的TSC2/Myc标记的TSC1与Myc标记的GADD34在293T细胞中进行共转染。用所示抗体进行免疫印迹分析TSC2在Thr1462的磷酸化和Akt在Ser473的磷酸化以及TSC2、TSC1（Myc）和GADD34（Myc）的表达。（D） 通过GADD34-KO MEF中GADD34的异位表达抑制TSC2、S6和4EBP1的磷酸化。如图所示，用逆转录病毒载体将GADD34导入GADD34-KO MEF。​图2B。2B型用所示抗体进行免疫印迹分析TSC2、S6和4EBP1的磷酸化和表达。

TSC2和mTOR参与抑制病毒复制。

TSC2是mTOR的一个强有力的负调节器。如果GADD34对TSC2的调节确实在抑制VSV复制中起到关键作用，那么与TSC2表达细胞相比，TSC2-完整细胞中的病毒复制有望增强。为了评估TSC2在抑制VSV复制中的作用，我们比较了TSC2中的病毒复制−和TSC2+VSV感染后的细胞。免疫印迹分析证实TSC2蛋白仅在TSC2中表达+细胞，不在TSC2中−电池（图。​（图5A）。5A级). TSC1蛋白在两种类型的细胞中都有表达，尽管TSC2中的表达水平−细胞数低于TSC2+电池（图。​（图5A）。5A级). VSV感染后，在这两种类型的细胞中诱导了相似水平的GADD34 mRNA（图。​（图5B）。5亿). 在TSC2中−然而，与TSC2相比，病毒复制增加了（3.5倍）+电池（图。​（图5C），5摄氏度)从而表明TSC2参与GADD34抑制病毒复制。为了进一步评估mTOR通路是否在VSV复制中发挥关键作用，在大鼠成纤维细胞系F2408中研究了通过TSC2磷酸化激活mTOR途径的组成活性（肉豆蔻酰化）Akt的作用。如图所示。​图5D，第五天，肉豆蔻酰化Akt的异位表达增强了F2408细胞中mTOR下游蛋白S6的磷酸化。与对照细胞相比，表达肉豆蔻酰化Akt的细胞中的VSV复制也增加（7.4倍）（图。​（图5E）。第五版). 此外，为了证实mTOR参与GADD34抑制病毒复制，我们检测了mTOR激酶特异性抑制剂雷帕霉素对GADD34-KO MEF中病毒复制的影响。如图所示。​图5F，5楼雷帕霉素治疗以剂量依赖性方式抑制GADD34-KO MEF中的病毒复制，证实mTOR通路参与抑制病毒复制。综上所述，这些结果表明，VSV感染诱导的GADD34通过激活TSC1/2抑制mTOR通路，并且TSC-mTOR途径在抑制病毒复制中起着关键作用（图。​（图66).

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mTOR通路参与抑制病毒复制。（A） TSC2中TSC1/2的免疫印迹分析−和TSC2+细胞。（B） TSC2中GADD34 mRNA的诱导−和TSC2+VSV感染细胞（MOI，感染后100,5小时）。RNA和RT-PCR的分离按照材料和方法中的描述进行。GAPDH mRNA作为内部对照进行监测。（C） TSC2中的病毒复制−和TSC2+VSV感染后的细胞。在Vero细胞中检测感染后5 h VSV的滴度。在三个重复的孔中进行分析。每个条形表示平均值±标准偏差。（D） 外源性肉豆蔻酰化Akt和内源性S6磷酸化的免疫印迹分析。（E） 表达肉豆蔻酰化Akt（Myr-Akt）的F2408细胞和对照细胞（Vec.）中的病毒复制。两个细胞均感染VSV（MOI，0.3），并在Vero细胞中测定感染后18 h VSV的滴度。在重复的井中进行分析。每个条形表示平均值±标准偏差。（F） 雷帕霉素对GADD34-KO MEF中病毒复制的影响。WT和GADD34-KO MEF感染VSV（MOI，0.3），并用雷帕霉素（50和100 nM）培养。当雷帕霉素原液在二甲基亚砜中溶解时，向所有培养物中加入1%的二甲基亚砜。在感染后12小时，在Vero细胞中测定感染性VSV的产生。在三个重复的孔中进行分析。每个值表示平均值±标准偏差。

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GADD34和mTOR通路在抑制病毒复制中所起作用的示意图模型。GADD34由VSV感染诱导，在抑制病毒复制中起关键作用。诱导的GADD34与TSC2相互作用，抑制mTOR通路，从而抑制病毒蛋白合成和病毒复制。

讨论

在病毒感染期间，双链RNA依赖性蛋白激酶（PKR）被激活并磷酸化Ser51的eIF2α(21). 磷酸化eIF2α导致细胞蛋白质合成的抑制。另一种eIF2α激酶，PKR-like ER resident protein kinase PERK，也有助于细胞抵抗病毒感染(三,33). 这些过程被认为在转化控制和抗病毒宿主防御中发挥关键作用。尽管GADD34已被证明由eIF2α诱导，eIF2由PKR和PERK磷酸化(7)病毒感染的生理意义尚未完全阐明。在本研究中，使用WT和GADD34-KO MEF细胞证明GADD34是由VSV感染诱导的，并且在抑制病毒复制中起着关键作用。GADD34对病毒复制的抑制是通过mTOR信号通路的抑制介导的。GADD34能够与TSC1/2结合，并在Thr1462对TSC2进行去磷酸化。通过TSC2缺失或组成活性Akt的表达激活mTOR通路增强VSV复制。此外，雷帕霉素处理显著抑制GADD34-KO细胞中的病毒复制。这些发现表明，应激诱导的GADD34和mTOR途径之间的相互作用有助于抗病毒宿主防御（图。​（图66).

虽然GADD34-KO MEF对VSV和MRSV的病毒复制高度敏感，但WT和GADD34-KO MEFs对HSV-1的复制没有差异。与其他病毒不同，HSV-1编码γ134.5蛋白，与GADD34的C末端区域同源并拮抗(8). 这种蛋白可以帮助病毒逃避细胞对WT MEF中病毒感染的反应。这一发现也支持GADD34在病毒感染中的保护作用。为了阐明GADD34抑制病毒复制的机制，我们首先关注VSV感染细胞中eIF2α的磷酸化状态，因为人们认为eIF2的磷酸化增加会导致细胞蛋白合成的完全抑制，从而抑制病毒复制(21,36,37). 然而，通过增强eIF2α磷酸化对细胞蛋白合成的全面抑制与GADD34对病毒复制的抑制无关。GADD34-KO MEF中VSV蛋白的产生和病毒复制显著增强，与eIF2α磷酸化增加和细胞蛋白合成受到抑制无关。这些发现意味着eIF2α对细胞翻译的控制并不总是影响病毒的翻译和复制。需要另一种细胞机制来解释为什么GADD34-KO细胞对VSV复制高度敏感。

然后我们将注意力转向mTOR途径，该途径也被认为是调节翻译机制以应对细胞应激。mTOR信号通路有助于蛋白质合成机制对诸如能量消耗、营养剥夺和缺氧等环境应激源的反应(5,13,18,30). 与eIF2α不同，mTOR通过其下游效应器S6K和4EBP1参与更有限类型mRNA的翻译调控，这些mRNA包含5′-TOP（嘧啶束）序列或5′-帽结构(24,31). 通过S6（S6K的下游靶标）和4EBP1的磷酸化监测的mTOR活性在VSV感染的WT MEFs中受到抑制，但在GADD34-KO MEFs中没有受到抑制，这表明mTOR介导的翻译控制对抵御病毒感染的细胞保护有贡献。以下实验进一步支持了这一观点。首先，TSC2-null细胞对VSV复制表现出高度敏感性。其次，组成活性Akt激活mTOR也增强了VSV的复制。第三，雷帕霉素，一种mTOR的特异性抑制剂，抑制了VSV在GADD34-KO MEFs中的复制。GADD34 KO MEF中细胞蛋白合成减少与病毒蛋白合成增加之间的差异可能是由eIF2α和mTOR调节的mRNA种类的差异所解释的。虽然病毒复制经常伴随着细胞蛋白质合成的“关闭”，以选择性地增强病毒蛋白质合成(15,34)，作用机制尚未完全理解。阐明mTOR信号对病毒蛋白质合成的调节可能为这一问题提供新的见解；有必要进一步研究其分子机制。

已知TSC1和TSC2是mTOR途径的有效抑制剂。来自生长因子或细胞应激的各种信号影响TSC1/TSC2功能以调节mTOR活性，进而导致蛋白质合成的控制。生长因子信号如胰岛素激活Akt，Akt磷酸化并灭活TSC2，从而激活mTOR(17). 另一方面，能量消耗激活AMP激活的蛋白激酶，该激酶磷酸化并激活TSC2，导致mTOR的抑制(18). 因此，TSC2是mTOR信号调节的关键分子。我们之前的报告表明，GADD34与TSC2相互作用，在葡萄糖消耗时负调节mTOR(41). 在本研究中，我们证明GADD34的表达能够与293T和GADD34-KO MEF细胞中的TSC1/2结合，并随后在Akt磷酸化的Thr1462位点进行TSC2去磷酸化。虽然GADD34本身不起磷酸酶的作用，但已经证明GADD34在其C末端KVRF结构域与丝氨酸/苏氨酸磷酸酶PP1结合，将PP1招募到各种分子，并调节其磷酸化状态和各自的酶活性(6). PP1很可能与GADD34在TSC2去磷酸化中的功能有关，从而抑制mTOR通路。以前，我们已经证明，缺乏PP1结合基序的C末端突变对S6K磷酸化没有抑制作用，尽管GADD34的WT形式和C末端结构域能够抑制S6K的磷酸化(41)表明PP1参与GADD34对TSC2的去磷酸化。

由于多种细胞应激诱导GADD34表达(4,16,26,27,39,41)GADD34对mTOR功能的抑制可能是细胞对各种应激反应的基础。这项研究尤其为更好地理解mTOR介导的翻译控制和细胞对病毒感染的反应之间的功能关系提供了新的见解。最近，mTOR被证明可以抑制自噬，自噬也参与了对病毒感染的防御(10). mTOR介导的自噬调节也可能有助于GADD34抑制病毒复制。mTOR信号的改变已被证明与多种疾病有关，包括癌症、糖尿病、神经退行性疾病和肥胖(9,20,23,25,40). mTOR的一种特异性抑制剂雷帕霉素是一种抗癌药物，已成功应用于临床。雷帕霉素也被证明可以逆转亨廷顿病果蝇和鼠标模型(32). 在寻找新的感染性疾病治疗方法的过程中，GADD34和/或雷帕霉素对mTOR信号的调节仍然具有相当大的兴趣。

致谢

我们感谢Hiroko Kita（志贺医科大学微生物系）提供的技术援助。我们感谢K.L.Guan（密歇根大学医学院）提供pcDNA3-Myc-TSC1和pcDNA3-HA-TSC2质粒。我们还感谢青木正弘（京都大学）提供Myr-Akt表达质粒。VSV（新泽西株）由日本国家动物卫生研究所提供。抗-VSV血清是Bin Gotoh（志贺医科大学微生物系）慷慨赠送的礼物。

该项目得到了日本教育、科学、体育和文化部对PRESTO、JST（给T.Chano）的资助，对重点领域的科学研究的资助（编号17013038和18012022）（给T.Chano），以及对科学研究的补助（C）（编号17590341）（给H.Inoue）。

脚注

▿2007年8月1日提前出版。

参考文献

1Akagi、T.、T.Shishido、K.Murata和H.Hanafusa。v-Crk在转化过程中激活磷脂酰肌醇3-激酶/AKT途径。程序。国家。阿卡德。科学。美国 20:7290-7295.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
2.Astrinidis，A.和E.P.Henske。2005年，结节性硬化症综合征：将生长和能量信号通路与人类疾病联系起来。癌基因 24:7475-7481. [公共医学][谷歌学者]
三。Baltzis，D.、L.K.Qu、S.Papadopoulou、J.D.Blais、J.C.Bell、N.Sonenberg和A.E.Koromilas。对水疱性口炎病毒感染的抵抗需要真核生物翻译起始因子2α激酶PERK和PKR之间的功能性相互作用。J.维罗尔。 78:12747-12761.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
4布莱斯、J.D.、V.Filibenko、M.Bi、H.P.Harding、D.Ron、C.Koumenis、B.G.Wouters和J.C.Bell。激活转录因子4受低氧应激的翻译调节。分子细胞。生物。 24:7469-7482.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
5Brugarolas，J.、K.Lei、R.L.Hurley、B.D.Manning、J.H.Reiling、E.Hafen、L.A.Witters、L.W.Ellisen和W.G.Kaelin，Jr。2004年。通过REDD1和TSC1/TSC2抑癌复合物调节mTOR功能以应对缺氧。基因发育。 18:2893-2904.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
6Brush、M.H.、D.C.Weiser和S.Shenolikar。2003.生长停滞和DNA损伤诱导蛋白GADD34将蛋白磷酸酶1α靶向内质网，并促进真核翻译起始因子2α亚基的去磷酸化。分子细胞。生物。 23:1292-1303.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
7Cheng、G.、Z.Feng和B.He。单纯疱疹病毒1感染激活内质网驻存激酶PERK并通过γ介导eIF-2α去磷酸化134.5蛋白质。J.维罗尔。 79:1379-1388.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
8周，J.和B.罗伊兹曼。1994年单纯疱疹病毒1γ134.5阻断宿主对感染的反应的基因功能定位于生长停滞和DNA损伤期间表达的基因的同源域。程序。国家。阿卡德。科学。美国 91:5247-5251.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
9Corradetti，M.N.、K.Inoki、N.Bardeesy、R.A.DePinho和K.L.Guan。LKB1对TSC通路的调节：结节性硬化综合征与Peutz-Jeghers综合征之间分子联系的证据。基因发育。 18:1533-1538.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
10Espert，L.、P.Codogno和M.Biard-Piechaczyk。2007.病毒感染中自噬的参与：抗病毒功能和病毒的破坏。《分子医学杂志》。 85:811-823.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
11Fingar，D.C.和J.Blenis。雷帕霉素（TOR）的靶点：营养素和生长因子信号的整合者，细胞生长和细胞周期进展的协调者。癌基因 23:3151-3171. [公共医学][谷歌学者]
12Fornace、A.J.、Jr.、D.W.Nebert、M.C.Hollander、J.D.Luethy、M.Papathanasiou、J.Fargoni和N.J.Holbrook。1989年，哺乳动物基因受生长停滞信号和DNA损伤剂的协调调节。分子细胞。生物。 9:4196-4203.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
13Gao，X.，Y.Zhang，P.Arrazola，O.Hino，T.Kobayashi，R.S.Yeung，B.Ru和D.Pan。Tsc肿瘤抑制蛋白拮抗氨基酸-TOR信号。自然细胞生物学。 4:699-704. [公共医学][谷歌学者]
14Harding，H.P.，I.Novoa，Y.Zhang，H.Zeng，R.Wek，M.Schapira和D.Ron。2000.调节翻译起始控制哺乳动物细胞中应激诱导的基因表达。分子电池 6:1099-1108. [公共医学][谷歌学者]
15哈德威克，M.A.和R.M.桑德里·戈尔丁。单纯疱疹病毒调节蛋白ICP27有助于感染期间细胞mRNA水平的降低。J.维罗尔。 68:4797-4810.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
16长谷川、T.、H.肖、F.滨岛和K.Isobe。2000.DNA损伤蛋白GADD34与由DNA损伤试剂诱导的热休克蛋白Hsp40家族新成员之间的相互作用。生物化学。J。 352:795-800.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
17Inoki，K.、Y.Li、T.Zhu、J.Wu和K.L.Guan。TSC2被Akt磷酸化和抑制，并抑制mTOR信号。自然细胞生物学。 4:648-657. [公共医学][谷歌学者]
18Inoki，K.、T.Zhu和K.L.Guan。TSC2介导细胞能量反应以控制细胞生长和存活。单元格 115:577-590. [公共医学][谷歌学者]
19Inoki，K.、H.Ouyang、Y.Li和K.L.Guan。细胞生长控制中雷帕霉素蛋白靶向信号传递。微生物。分子生物学。版次。 69:79-100.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
20Inoki，K.、M.N.Corradetti和K.L.Guan。2005.人类疾病中TSC-mTOR通路的失调。自然遗传学。 37:19-24. [公共医学][谷歌学者]
21.考夫曼，R.T。2000.双链RNA激活蛋白激酶PKR，第503-527页。在N.Sonenberg、J.W.B.Hershey和M.B.Mathews（编辑）基因表达的翻译控制。纽约州冷泉港实验室出版社。
22Kojima，E.、A.Takeuch、M.Haneda、A.Yagi、T.Hasegawa、K.Yamaki、K.Takeda、S.Akira、K.Shimokata和K.Isobe。2003年。GADD34的功能是从GADD34缺乏小鼠内质网应激-清醒诱导的蛋白质合成中断中恢复过来。美国财务会计准则委员会J。 17:1573-1575. [公共医学][谷歌学者]
23Majumder，P.K.、P.G.Febbo、R.Bikoff、R.Berger、Q.Xue、L.M.McMahon、J.Manola、J.Brugarolas、T.J.McDonnell、T.R.Golub、M.Loda、H.A.Lane和W.R.Sellers。mTOR抑制通过调节凋亡和HIF-1依赖性通路逆转Akt依赖性前列腺上皮内瘤变。自然医学。 10:594-601. [公共医学][谷歌学者]
24.Mamane，Y.、E.Petroulakis、L.Rong、K.Yoshida、L.W.Ler和N.Sonenberg。2004.eIF4E-从翻译到转换。癌基因 23:3172-3179. [公共医学][谷歌学者]
25Neshat，M.S.、I.K.Mellinghoff、C.Tran、B.Stiles、G.Thomas、R.Petersen、P.Frost、J.J.Gibbons、H.Wu和C.L.Sawyers。2001.PTEN缺乏肿瘤对FRAP/mTOR抑制的敏感性增强。程序。国家。阿卡德。科学。美国 98:10314-10319.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
26Novoa，I.、H.Zeng、H.P.Harding和D.Ron。2001.通过GADD34介导的eIF2α去磷酸化对未折叠蛋白反应的反馈抑制。《细胞生物学杂志》。 153:1011-1022.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
27Novoa，I.、Y.Zhang、H.Zeng、R.Jungreis、H.P.Harding和D.Ron。2003.应激诱导的基因表达需要从翻译抑制中程序化恢复。EMBO J。 22:1180-1187.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
28Orimoto，K.、H.Tsuchiya、T.Kobayashi、T.Matsuda和O.Hino。通过替换Eker大鼠肾癌细胞中的Tsc2基因抑制肿瘤表型。生物化学。生物物理学。Res.Commun公司。 219:70-75. [公共医学][谷歌学者]
29Pierce，J.H.、S.A.Aaronson和S.M.Anderson。1984.通过含有劳斯肉瘤病毒src基因的小鼠重组逆转录病毒进行的造血细胞转化。程序。国家。阿卡德。科学。美国 81:2374-2378.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
30C·G·普劳德。mTOR在细胞应激反应中的多方面作用。DNA修复 三:927-934. [公共医学][谷歌学者]
31C·G·普劳德。2007.信号转导到翻译：信号转导途径如何控制蛋白质合成机制。生物化学。J。 403:217-234. [公共医学][谷歌学者]
32拉维库马尔（Ravikumar）、B.、C.Vacher、Z.Berger、J.E.Davies、S.Luo、L.G.Oroz、F.Scaravilli、D.F.Easton、R.Duden、C.J.O'Kane和D.C.Rubinsztein。2004年。在亨廷顿病的苍蝇和小鼠模型中，抑制mTOR可诱导自噬并降低聚谷氨酰胺扩增的毒性。自然遗传学。 36:585-595. [公共医学][谷歌学者]
33Ron，D.和H.P.Harding。2000.RERK和内质网应激对翻译的控制，p547-560。在N.Sonenberg、J.W.B.Hershey和M.B.Mathews（编辑）基因表达的翻译控制。纽约州冷泉港实验室出版社。
34Sacks，W.R.、C.C.Greene、D.P.Ashmen和P.A.Schaffer。1985年。1型单纯疱疹病毒ICP27是一种重要的调节蛋白。J.维罗尔。 55:796-805.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
35Shamji、A.F.、P.Nghiem和S.L.Schreiber。2003.生长因子和营养信号的整合：对癌症生物学的影响。分子细胞。 12:271-280. [公共医学][谷歌学者]
36Stark、G.R.、I.M.Kerr、B.R.Williams、R.H.Silverman和R.D.Schreiber。细胞对干扰素的反应。每年。生物化学评论。 67:227-264. [公共医学][谷歌学者]
37Stojdl，D.F.、N.Abraham、S.Knowles、R.Marius、A.Brasey、B.D.Lichty、E.G.Brown、N.Sonenberg和J.C.Bell。小鼠双链RNA依赖性蛋白激酶PKR是抵抗水泡性口炎病毒所必需的。J.维罗尔。 74:9580-9585.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
38Tambe，Y.、A.Yoshioka-Yamashita、K.Mukaisho、S.Haraguchi、T.Chano、T.Isono、T.Kawai、Y.Suzuki、R.Kushima、T.Hattori、M.Goto、S.Yamada、M.Kiso、Y.Saga和H.Inoue。2007.新凋亡诱导基因drs。致癌作用 28:777-784. [公共医学][谷歌学者]
39Tee、A.R.和C.G.Proud。2000.DNA损伤剂导致与mTOR信号相关的翻译调控因子失活。癌基因 19:3021-3031. [公共医学][谷歌学者]
40嗯，S.H.、F.Frigerio、M.Watanabe、F.Picard、M.Joaquin、M.Sticker、S.Fumagalli、P.R.Allegrini、S.C.Kozma、J.Auwerx和G.Thomas。2004年。不含S6K1可以防止年龄和饮食诱导的肥胖，同时提高胰岛素敏感性。自然 431:200-205. [公共医学][谷歌学者]
41渡边、R.、Y.Tambe、H.Inoue、T.Isono、M.羽田、K.Isobe、T.Kobayashi、O.日野、H.Okabe和T.Chano。2007.GADD34抑制哺乳动物雷帕霉素靶点在生物能量应激下的存活信号。国际分子医学杂志。 19:475-483. [公共医学][谷歌学者]
42Wullschleger，S.、R.Roewith和M.N.Hall。生长和代谢中的TOR信号。单元格 124:471-484. [公共医学][谷歌学者]
43詹（Zhan，Q.）、K.A.Lord、I.Alamo Jr.、M.C.Hollander、F.Carrier、D.Ron、K.W.Kohn、B.Hoffmann、D.A.Liebermann和A.J.Fornace Jr。gadd和MyD基因定义了一组新的哺乳动物基因，它们编码协同抑制细胞生长的酸性蛋白。分子细胞。生物。 14:2361-2371.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
文章来自病毒学杂志由以下人员提供美国微生物学会（ASM）