人巨细胞病毒对缺失双链RNA-结合蛋白基因E3L的痘苗病毒的补体

摘要

病毒感染的先天免疫反应部分由干扰素介导，干扰素结合细胞受体并激活许多基因的表达，包括蛋白激酶PKR和2′5′寡腺苷酸（2-5A）合成酶（参考文献综述26). 当这两个基因的产物被双链RNA（dsRNA）激活时，会触发旨在阻断受感染细胞蛋白质合成的途径，从而阻止病毒复制。在二聚化和自磷酸化后，PKR磷酸化真核起始因子2（eIF2α）的α亚基，从而抑制翻译起始。2-5A合成酶催化2′-5′寡腺苷酸的合成，进而激活潜在的RNase L，导致mRNA和rRNA降解，并抑制蛋白质合成。

由于病毒复制依赖于持续的蛋白质合成，许多病毒已经进化出策略来逃避宿主细胞的抗病毒反应(8,15,18,25,26,29,30,36). 例如，痘苗病毒（VV）E3L基因编码一种dsRNA-结合蛋白，该蛋白可阻止PKR和2-5A合成酶的激活(18). 删除E3L的VV（VVΔE3L）对干扰素的抗病毒作用敏感，并且显示出有限的宿主范围(2). VVΔE3L的蛋白质合成和复制可以通过野生型E3L或编码dsRNA-结合蛋白的其他基因的表达来补充反式或将其他病毒的基因插入VVΔE3L基因组，这些病毒也抑制这些抗病毒反应，例如编码呼肠孤病毒σ3和丙型肝炎病毒NS5A蛋白的病毒(1,11,17).

因为最近在其他病毒系统中的研究已经证明了阻断抗病毒反应途径的病毒机制的关键致病作用(6,21,23)，我们设计了研究来评估人类巨细胞病毒（CMV）是否可以对抗这些途径。我们假设CMV感染细胞具有强大的蛋白质合成能力(22,35,37)部分原因是病毒因素阻碍了宿主细胞的抗病毒反应，否则会阻断翻译。使用VVΔE3L作为激活CMV许可细胞中PKR和RNase L途径的手段，我们发现CMV可以阻止PKR和2-5A合成酶途径介导的翻译的阻断。

材料和方法

结果

CMV拯救了VVΔE3L复制。

为了确定CMV是否编码一种能对抗宿主细胞抗病毒反应的功能，我们使用了一个特征良好的VV突变体VVΔE3L(1,三,6,31,32). VVΔE3L对干扰素的敏感性和宿主细胞范围有限似乎是由于PKR和2-5A合成酶途径的激活以及由此导致的感染细胞蛋白质合成障碍所致。

我们首先研究了CMV感染能否克服VVΔE3L的复制缺陷。HF被模拟感染或感染CMV后24小时，细胞被模拟感染，或感染VVΔE3L或野生型VV（VC-2），24小时后通过测定BHK细胞中细胞内病毒的滴度来评估VV生成，这是一种允许VV△E3L复制的细胞类型（图。​（图1A）。1安培). 在HF中，VVΔE3L的产生比野生型VC-2低约1000倍，这一发现与在其他细胞类型中观察到的这些病毒的表型类似(11,31). CMV感染导致VVΔE3L滴度可重复增加约100倍。相反，CMV感染导致VC-2复制减少10倍。因此，CMV似乎补充了E3L基因缺失导致的VVΔE3L复制缺陷。

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图1。

CMV拯救VVΔE3L复制和晚期基因表达。（A） 在三个重复的HF孔被模拟感染（−，阴影条）或感染CMV（+，黑色条）后24小时，它们被模拟感染了（−）或感染了指示的VV。24小时后制备的冻融裂解物中的VV滴度（+标准偏差）通过BHK细胞中的斑块分析测定。（B） HF被模拟感染（−）或感染CMV（+）后24小时，他们被模拟感染或感染VVΔE3L。24小时后，按照材料和方法中的描述测量β-Gal活性。

因为VVΔE3L含有VV晚期启动子-拉奇盒取代E3L基因(1)，测量感染细胞中的β-Gal活性为监测VV晚期基因表达提供了一种手段。CMV感染导致VVΔE3L感染细胞中β-Gal活性增加50倍（图。​（图1B）。1B年). 因此，CMV可以挽救晚期基因表达以及VVΔE3L在HF中的复制。

CMV的紫外线灭活消除了VVΔE3L复制的互补性。

巨细胞病毒（CMV）或其主要包膜糖蛋白gB的可溶性形式与细胞表面的结合会影响许多细胞基因的转录，包括许多已知由干扰素诱导的基因(5,34,41,42). 为了评估观察到的VVΔE3L复制的互补性可能是由CMV与细胞表面的结合或病毒携带的因子引起的，我们分析了紫外线照射对CMV拯救VV△E3L的复制能力的影响。本实验使用表达增强型GFP（GFP Toledo）的重组CMV，以便我们可以通过荧光测量监测紫外线灭活病毒基因组的效果。HF感染了经过不同剂量紫外线照射的CMV-GFP-Toledo。在感染后2小时（hpi），采集模拟感染细胞、CMV感染细胞和感染每个紫外线照射接种物的细胞进行pp65免疫印迹分析。其余样本在24 hpi时进行GFP表达分析；然后感染VVΔE3L。在VV感染后24小时，对BHK细胞测定从细胞中采集的病毒滴度。

0.12J紫外线照射/cm处理GFP托莱多²GFP表达减少约5倍，VVΔE3L生成减少约10倍（图。​（图2A）。2安培). 较高剂量的紫外线照射实际上消除了GFP的表达，并将VVΔE3L滴度降低到没有CMV复合感染时检测到的水平。荧光显微镜（数据未显示）以及平板阅读器测量结果表明，紫外线灭活导致GFP表达降低。紫外线处理不会抑制CMV-GFP-Toledo与细胞的结合，这一点可以从在每个紫外线剂量下2 hpi时出现的类似数量的细胞相关pp65（UL83）（一种主要的CMV表皮蛋白）中看出（图。​（图2B）。2B型). 高分子量免疫反应带的存在表明，pp65在最高紫外线照射水平下发生了一些交联，但病毒至少仍能与细胞结合。虽然紫外线灭活可能干扰CMV病毒的进入或脱膜，但这些结果表明，为了挽救VVΔE3L在HF中的复制，CMV基因的从头表达是必要的。

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图2。

CMV的紫外线灭活阻止VVΔE3L复制的拯救。HF被模拟感染或感染CMV，CMV暴露于不同剂量的紫外线照射下，一式四份，如材料和方法所述。（A） 24小时后，用荧光板阅读器测定GFP水平，然后用VVΔE3L感染细胞。在VVΔE3L感染后24小时，测量VVΔ的E3L滴度（•）。GFP水平（○）表示三个孔中表达的平均水平（±标准偏差[SD]）减去模拟感染细胞中存在的背景荧光。VVΔE3L滴度表示从用于测量GFP表达的相同的三个重复孔中获得的VV△E3L的平均值（±SD）。这个x个轴设置为3.8×10^三PFU，表示在没有CMV感染的情况下产生的VVΔE3L的滴度。（B） 在CMV感染后2小时，收集来自同一实验的样本，并使用CMV被膜蛋白pp65抗体进行免疫印迹分析。分子大小标记在左边以千道尔顿表示。

补充VVΔE3L复制不需要CMV晚期基因表达。

为了进一步探讨负责VVΔE3L互补的CMV基因的特征，CMV在更昔洛韦（一种晚期CMV基因表达抑制剂）的存在下拯救VV△E3L基因表达的能力(10)，进行了分析。HF细胞模拟感染或CMV感染；然后在持续存在或不存在更昔洛韦的情况下培养它们。CMV感染后24小时，细胞被模拟感染或感染VVΔE3L或VC-2，这些感染持续24小时，然后测量β-Gal的表达。更昔洛韦对CMV刺激β-Gal表达几乎没有影响，如图所示。​图3。三在更昔洛韦存在的情况下，通过斑块测定测量的CMV对VVΔE3L复制的刺激也很明显（数据未显示）。这些结果表明，晚期CMV基因表达对于VVΔE3L的互补不是必需的。由于病毒粒子结构蛋白似乎不足以产生这种效果（图。​（图2），2)，我们得出结论，CMV的早期或早期基因（或多个基因）很可能是拯救VVΔE3L复制所必需的。

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图3。

即使在更昔洛韦的存在下，CMV也能拯救VVΔE3L晚期基因表达。HF的三个微孔被模拟感染（−）或感染CMV（+）。在1 hpi时，用含有（+，黑色条）或缺乏（-，阴影条）30μM更昔洛韦的培养基喂养细胞。24 hpi时，细胞被模拟感染（−）或感染VVΔE3L（+），24 h后测量β-Gal活性（+SD）。

CMV可防止VVΔE3L诱导的蛋白质合成抑制。

干扰素敏感性和VVΔE3L在许多细胞类型中的低效复制与病毒和细胞蛋白合成的阻断有关(1,三,11). 为了评估CMV是否能阻止VVΔE3L阻断蛋白质合成，将CMV和VV单独或联合感染HF和U373MG细胞，并用代谢标记法监测蛋白质合成[³⁵S] 蛋氨酸和细胞裂解物放射自显影。VVΔE3L显著抑制了两种CMV许可细胞类型的整体蛋白质合成（图。​（图4）。4). 先前感染CMV后，VVΔE3L感染挽救了病毒蛋白合成，如图所示的病毒特异性蛋白表达水平所示。​图4。4此外，在本实验中，CMV使VVΔE3L感染的U373MG细胞中β-Gal的表达增加了54倍，与在HF中的作用类似（图。​（图1B）。1B年). 在CMV存在和不存在的情况下，VC-2蛋白的合成都是有效的。因此，CMV可特异性逆转E3L基因缺失导致的蛋白质合成缺陷。

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图4。

CMV对VV感染细胞蛋白质合成的影响。HF（A）和U373MG（B）细胞模拟感染（−）或感染CMV（+），24小时后模拟感染（–）或感染指示的VV。VV感染后24小时，细胞被标记为[³⁵S] 蛋氨酸作用1h，然后用SDS-PAGE和放射自显影术分析细胞提取物中的20μg蛋白质。分子大小标记在左边以千道尔顿表示。

CMV可防止VVΔE3L诱导的eIF2α磷酸化。

VVΔE3L感染细胞中的翻译关闭被认为是由于eIF2α磷酸化增加和RNase L激活所致(18). 因此，我们研究了CMV在VVΔE3L感染后保持翻译的能力是否是由于其阻断这些途径激活的能力。

我们首先确定了CMV感染对VVΔE3L感染细胞中eIF2α磷酸化的影响。在模拟感染或感染CMV后24小时，U373MG细胞被模拟感染或VC-2或VVΔE3L感染。在VV感染后24小时，制备细胞裂解物，并通过免疫印迹分析评估eIF2α磷酸化水平（图。​（图5）。5). 虽然模拟感染和VC-2感染的细胞含有少量磷酸化eIF2α，但用VVΔE3L感染这些细胞会导致eIF2β磷酸化显著增加，这一发现与感染HeLa细胞后观察到的结果类似。与CMV联合感染使eIF2α磷酸化的丰度几乎降低到模拟感染细胞中检测到的水平，而这些样本中的总eIF2β蛋白水平相似。尽管在一些实验中，即使在模拟感染的HF中磷酸化eIF2α的背景水平已经很高，并且没有随着VVΔE3L感染而进一步增加，但HF感染后也获得了类似的结果（数据未显示），因此我们无法评估CMV的任何影响。然而，在HF和U373MG细胞的所有信息实验中，CMV降低了VVΔE3L感染引起的eIF2α磷酸化水平。这些结果表明，CMV含有一个阻止PKR和/或另一个eIF2α激酶激活或刺激eIF2β去磷酸化的基因。

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图5：。

CMV和VV感染后eIF2α磷酸化。U373MG细胞被模拟感染（−）或被CMV感染（+）。24小时后，细胞被模拟感染（−）或感染指示的VV，然后用SDS-PAGE分离24小时后制备的裂解物以及VV感染的HeLa细胞的对照提取物，并使用磷酸化eIF2α（顶部）或总eIF2β（底部）特异性抗体进行免疫印迹分析。分子大小标记以千道尔顿为单位显示在每个面板的左侧。

CMV可防止VVΔE3L诱导的RNase L活性。

为了确定CMV是否也阻断VVΔE3L诱导的2-5A合成酶途径的激活，我们监测了感染细胞中rRNA的切割。RNase L的激活导致rRNA分裂为离散产物(40). HF（图。​（图6）6)或模拟感染或感染VC-2的U373MG细胞（数据未显示）包含完整的18S和28S rRNA条带，无论这些细胞是否预先感染了CMV。然而，感染VVΔE3L的细胞显示出RNase L诱导的rRNA切割模式，这种切割在之前感染CMV后得到了显著缓解，表明CMV可以阻断2-5A合成酶途径的激活。

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图6。

CMV和VV感染细胞中的RNase L活性。HF被模拟感染（−）或感染CMV（+）。24小时后，细胞被模拟感染（−）或感染指示的VV。在VV感染后24小时，收集RNA，并通过甲醛琼脂糖电泳和SyBr绿色染色观察～6μg。RNase L裂解产物用星号表示。

讨论

宿主对病毒感染的反应通常包括产生与细胞膜受体结合的干扰素，触发信号转导级联，导致多个基因的诱导，包括2-5A合成酶和PKR。dsRNAs激活这些因子导致蛋白质合成停止。由于病毒复制需要持续的蛋白质合成，许多病毒已经进化出对抗PKR和2-5A合成酶途径的策略(26). 即使病毒成功阻止了翻译的关闭，它们的mRNA可能仍在竞争限制细胞中翻译机制的成分，因此病毒也进化出了策略，可以促进自身mRNA的选择性翻译，同时抑制细胞mRNA的翻译。巨细胞病毒与许多其他研究充分的病毒的不同之处在于，尽管病毒蛋白合成增加，但在整个感染过程中细胞蛋白仍大量合成(22). 为了确保病毒和细胞蛋白质的充分生产，巨细胞病毒可能需要细胞中具有非凡的蛋白质合成能力。事实上，CMV感染期间，总体蛋白质合成增加和rRNA合成增加的峰值已被描述(22,35,37). 至少，巨细胞病毒可能需要对抗任何细胞抗病毒机制，否则会阻断翻译。这些考虑因素，以及最近的研究表明PKR途径在单纯疱疹病毒1型（HSV-1）发病机制中的关键作用(21)促使我们调查CMV是否有能力对抗这些细胞抗病毒防御。

为了评估巨细胞病毒是否具有这样的机制，我们利用了具有良好特征的VV突变体VVΔE3L，该突变体在各种细胞类型中激活PKR和2-5A合成酶途径(18). 我们发现，VVΔE3L感染两种CMV许可细胞类型HF和U373MG，导致病毒晚期基因表达、复制和整体蛋白质合成水平低，eIF2α磷酸化和RNase L活性高。先前感染巨细胞病毒会逆转这些结果（图。​（图1，1、4、5和6）。由于CMV对VVΔE3L的野生型亲本VC-2的复制和翻译特性影响很小或没有影响，因此CMV的这些影响对VV△E3L是特定的。因此，CMV具有阻止VVΔE3L触发的宿主细胞抗病毒反应的功能。

CMV或甚至其包膜糖蛋白B与细胞表面的结合激活许多细胞基因的转录，包括2-5A合成酶和其他干扰素调节基因(5,34,41,42). 类似地，HSV-1进入细胞后激活几个干扰素调节基因，这些基因可以抑制随后的病毒复制(24). 这些观察结果表明，疱疹病毒感染的常见早期细胞反应是干扰素反应成分的激活，这可能反映了细胞限制病毒复制的企图。由于CMV可能利用这种细胞反应来增强病毒复制，我们评估了CMV拯救VVΔE3L复制的能力是CMV与细胞膜或病毒相关因子结合的结果的可能性。然而，CMV的紫外线灭活导致CMV基因表达的平行减少和VVΔE3L复制的挽救，而不改变CMV的结合或进入（图。​（图2）。2). 这一结果表明，在进入细胞时递送到细胞的病毒结合或病毒粒子相关蛋白不是VVΔE3L复制增强的介质。相反，新生CMV基因表达似乎是CMV拯救VVΔE3L复制所必需的。

到目前为止，我们的研究几乎没有提供关于CMV基因或拯救VVΔE3L复制所需基因的性质的额外线索。CMV晚期基因表达对这种效果不是必需的，因为即使在更昔洛韦存在的情况下，CMV也能拯救VVΔE3L晚期基因表达（图。​（图3）。三). 尽管这些结果并不排除CMV晚期基因具有类似功能的可能性，但一个或多个以即刻或早期动力学表达的基因必须能够抵消宿主细胞抗病毒反应途径并拯救VVΔE3L复制。

其他病毒在途径的不同阶段干扰抗病毒反应。事实上，包括VV和HSV-1在内的几种病毒至少有两个基因发挥这一功能(9,12,16,18,25). 在这两种病毒和其他几个系统中(26)，防止翻译关闭的一个常见机制似乎是通过病毒编码的dsRNA结合蛋白隔离dsRNA，从而阻止PKR和2-5A合成酶的激活。在大多数情况下，作为这些蛋白质激活剂的dsRNAs的来源尚不清楚，但被认为包括RNA病毒的复制中间产物或来自DNA病毒两条链的转录的dsRNA。此外，某些mRNA可能折叠成激活PKR的结构(13,28,39). 由于CMV同时抑制PKR和2-5A合成酶途径，我们考虑了CMV编码dsRNA-结合蛋白的可能性。然而，我们无法通过计算机分析确定任何具有可识别dsRNA-binding基序或与已知抑制PKR通路的蛋白质具有实质性序列相似性的CMV开放阅读框。CMV可能表达一种非常规的dsRNA-结合蛋白或诱导一种细胞dsRNA--结合蛋白。CMV诱导p58转录的最新发现^IPK公司（或DNAJ-C3），一种PKR的细胞抑制剂，在流感病毒感染期间被激活，表明该蛋白在CMV感染期间也能阻断PKR的活性(7,20). 而p58^IPK公司尚不清楚是否阻断2-5A合成酶途径，其他病毒编码或诱导的基因可能会干扰该途径。

对其他病毒的研究已经很好地证明了宿主PKR和2-5A合成酶途径的病毒调节器在确定动物模型感染发病机制中的重要性。例如，与野生型VV相比，E3L基因的缺失使小鼠经鼻或颅内接种后的50%致死剂量增加了1000倍以上(6). HSV-1γ34.5基因似乎作为蛋白磷酸酶1α的调节亚单位，将酶重定向到去磷酸化eIF2α。缺乏该基因的HSV-1突变体在野生型小鼠中毒性显著降低，但在PKR-null小鼠中毒性很高，这提供了强有力的遗传证据，证明γ34.5基因在体内的主要作用是抵消PKR通路(21). 分离出HSV-1γ34.5缺失突变体的第二个位点抑制突变体，发现该突变体在感染早期异常表达了一种dsRNA-结合蛋白，即Us11的产物(9,15,27). 因此，PKR通路的抑制可能依赖于感染期间不同时间表达的多种病毒因子。有趣的是，这种HSV-1第二位点抑制突变体和含有E3L羧基末端部分的VV突变体在动物中都显示出降低的毒力，E3L羧基末端部分足以在细胞培养中复制和干扰素耐药性(6,23)这表明体内阻断抗病毒反应途径比细胞培养系统中更为复杂。

我们的研究表明，CMV感染显然能够阻断PKR和2-5A合成酶途径介导的翻译关闭，至少在这些途径激活的条件下，如VVΔE3L感染。在未来的研究确定和测试灭活CMV基因或阻断这些通路的基因的效果之前，我们无法确定阻止PKR和2-5A合成酶通路的激活对CMV复制是必要的。然而，CMV具有对抗宿主抗病毒反应途径的机制这一事实表明，与其他病毒系统一样，病毒与宿主之间控制细胞内蛋白质合成活性的斗争结果是病毒复制和发病的主要决定因素。

致谢

参考文献