NF1肿瘤抑制因子对TSC2和mTOR的调节至关重要

摘要

NF1是一种流行的家族性癌症综合征，在全世界每3500人中就有1人受到影响(1). 该病的特征是良性和米对准剂第页边缘的n个服务器秒健康t吨肿瘤（分别为神经纤维瘤和MPNST）。然而，NF1患者也可能表现出认知缺陷、虹膜错构瘤性病变和骨变形，并容易发展为髓系恶性肿瘤、胶质瘤和嗜铬细胞瘤(1,2).

虽然在NF1型导致Ras放松管制的基因(三——7)，负责疾病发病的具体效应途径尚未明确。有趣的是，NF1属于一组被称为phakomatoses的疾病(8). 这一疾病家族表现出几个共同特征，包括错构瘤的发生，错构瘤不是经典意义上的良性肿瘤，而是其发生部位固有的分化良好的组织的外来肿块(9)]. 最近，许多导致这些疾病的基因，例如PTEN公司（考登病），LKB1号机组（Peutz–Jeghers综合征），以及TSC1类和TSC2型（结节性硬化综合征），已在一个共同的生化途径中联系起来(10,11). 原代细胞中所有这些基因的失活导致TOR（雷帕霉素靶点）信号的放松调节(12——17). 此外，在某些情况下，同源人类肿瘤细胞似乎对TOR抑制剂（雷帕霉素或雷帕霉素衍生物）高度敏感)(12,13). 因此，我们试图确定TOR通路是否也可能在NF1中被严重解除调控，以确定这种毁灭性疾病的潜在治疗靶点。

TOR是一种进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在酵母、苍蝇和哺乳动物中调节细胞生长和增殖(11). 哺乳动物TOR（mTOR）被证明是营养物质、生长因子和细胞能量状态的关键传感器，并整合来自这些途径的信号来控制各种细胞过程(11,18,19). 生长因子通过PI3激酶依赖机制激活mTOR，而营养素（氨基酸）在块茎蛋白和/或mTOR自身水平上进一步下游影响这一途径(11). 由于神经纤维蛋白能负性调节Ras/PI3激酶途径，我们假设mTOR途径也可能在NF1型-缺乏细胞。

在本文中，我们证明mTOR在1号机组-缺乏原代细胞。这种异常激活依赖于Ras和PI3激酶，后者使TSC2型通过AKT的基因产物tubin。来自NF1患者肿瘤的细胞同样表现出tubin的结构性磷酸化和mTOR的异常激活，而患者匹配NF1型^+/-细胞没有。重要的是，NF1型-缺乏的恶性肿瘤细胞系对雷帕霉素极为敏感。我们进一步探讨了Ras在mTOR正常调节中的激活需求，发现Ras对mTOR的激活与生长因子的反应存在差异。具体而言，Ras活性的抑制显著减弱了mTOR的激活我-α-溶血磷脂酸（LPA）和胰岛素，但对血小板衍生生长因子（PDGF）刺激mTOR活性几乎没有影响。因此，这些发现将NF1肿瘤抑制因子确定为mTOR通路以前未经特征化的成分。此外，他们证明Ras GTP的生理水平在正常和致瘤环境中都能严重调节mTOR的激活。此外，他们还表明雷帕霉素衍生物在治疗NF1肿瘤方面的潜在用途。

材料和方法

细胞培养和免疫印迹。MEF和NIH 3T3细胞分别在添加FCS或小牛血清的DMEM中生长。Littermate匹配的MEF或NIH 3T3细胞以1.0×10的密度接种在无血清DMEM中⁶每10厘米板的细胞数。18小时后，添加200 nM胰岛素、6μM LPA或20 ng/ml PDGF。如有指示，用DMSO、20nM雷帕霉素（Calbiochem）和200nM Wortmannin（Sigma-Aldrich）预处理细胞30分钟。对于氨基酸提取研究，洗涤细胞，并用Dulbecco的PBS替换培养基指定时间。刺激后，细胞在1%SDS沸腾裂解缓冲液中进行裂解。神经纤维瘤衍生患者匹配NF1型^+/-和NF1型^-/-如前所述，在补充10%FCS、0.5μM forskolin的DMEM中分离和培养雪旺细胞(NF1型^+/-仅细胞）、2.5μg/ml胰岛素、0.5 mM IBMX和10 nM heregulinβ1(20,21). 施万细胞以2.5×10的浓度接种⁵含0.1%血清的DMEM中每6厘米板的细胞，不含福斯克林、胰岛素或红细胞蛋白，并按上述方法进行裂解。在施万细胞实验中获得了相同的结果，这些实验是在存在或不存在福斯科林的情况下进行的。如参考文献所述，从NF1患者中产生人MPNST细胞系。22将澄清的裂解物归一化为蛋白质水平，并用以下抗体进行蛋白质印迹分析：磷酸化p70S6K（T-389）、磷酸化-结核杆菌素（S-939）、磷结核菌素（T-1462）、磷酸-Akt（S-473）、来自圣克鲁斯生物技术的结核菌蛋白（C-20），以及来自Sigma-Aldrich的蛋白激酶Bα/AKT1、肌动蛋白和β-微管蛋白。

逆转录病毒、慢病毒和转染。原代MEF或NIH3T3细胞感染表达空载体的逆转录病毒、人NF1 GAP-相关结构域（GRD）（MSCV-GRD-pac）、显性阴性p53（pBabe-hygro-p53DD）或pLPC-E1A12S，并用适当的抗生素进行筛选。为了生产慢病毒，用Δ8.2慢病毒构建物转染HEK293T细胞（编码塞子、波尔、转速)、VSVG和空pKO载体或包含以下序列转录NF1特异性短发夹RNA的pKO向量：5′-TTATAAAAGCCTGGAAAAGG-3′。然后使用含病毒培养基感染HEK293细胞。大约8–10小时后，用0.5μg pCDNA3-Flag载体或0.5μg编码C末端标记野生型块茎蛋白的pCDNA-Flag，即AKT磷酸化位点突变体块茎蛋白S939A/T1462A（均由波士顿哈佛公共卫生学院的Brendan Manning慷慨捐赠）瞬时转染感染细胞（FuGENE，Roche），或pCDNA-Flag-NF1-GRD(7). 用0.5μg大鼠pRK7-HA-p70S6K（同样来自Brendan Manning）共同转染所有感染细胞。

Ras激活分析。将NIH3T3细胞置于含3%血清的DMEM中，密度为1.0×10⁶每10厘米板的细胞数。18小时后，将细胞裂解物归一化，并根据制造商的方案（Upstate Biotechnology）使用Ras活化试验检测Ras-GTP。

免疫沉淀。在1.0 ml裂解缓冲液中制备HEK293裂解产物[20 mM Tris，pH 7.5/150 mM NaCl/1 mM MgCl₂/1%诺奈德P-40/10%甘油/50 mM氟化钠/30 mM钠₄O（运行）₇P（P）₂/完整蛋白酶抑制剂混合物（Roche）/1μM微囊藻毒素-LR（Calbiochem）/100 nM Calyculin-A（Calbiochem）]。通过SDS/PAGE将免疫沉淀蛋白与总细胞提取物（免疫沉淀体积的10%）一起溶解，并用指示的抗体进行免疫印迹。

MPNST增殖研究。MPNST以6.5×10接种⁴在含有雷帕霉素（0.01、0.1、1.0、10或100 nM）或等量载体（DMSO）的正常生长培养基中，每6 cm孔的细胞数。7天后，对细胞进行胰蛋白酶化，并使用台盼蓝排除法在三倍板上对活细胞进行计数。

软琼脂分析。 1号机组^-/-和1号机组^+/+MEF感染pLPC-E1A12S-puro和pBabe-p53DD-Hygro。然后，1.0×10⁴将选定的MEF悬浮在含有0.34%琼脂糖的DMEM中，琼脂糖含有雷帕霉素（0.1、1.0、10、20或50nM）或等量的二甲基亚砜。细胞接种在0.5%的琼脂基上。在最初播种后4至6周，通过拍摄和计数每个样品的10个随机视野，在三个板或孔中分析菌落生长。菌落大小通过使用图像j v.1.32j软件(http://rsb.info.nih.gov/ij).

结果

由于神经纤维蛋白能负性调节Ras/PI3激酶途径，我们假设mTOR途径也可能在NF1型-缺乏细胞。

最常用的体内mTOR激活的读数是一种特征良好的底物S6激酶（S6K1）在T-389的磷酸化。该位点的磷酸化取决于mTOR，并且是S6K1最大活化所必需的。血清饥饿的野生型小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）几乎没有AKT或S6K1激活(图1A类). 然而，AKT在缺乏血清的患者中异常激活1号机组-无MEF。值得注意的是，在没有任何生长因子的情况下，S6K1也在这些细胞中过度磷酸化。雷帕霉素抑制S6K1的异常激活，表明其依赖于mTOR。我们还研究了氨基酸剥夺是否会抑制mTOR在1号机组-缺乏细胞。与营养素整合到PI3激酶激活下游mTOR通路的观察结果一致，氨基酸的退出导致野生型和野生型mTOR信号的适当终止1号机组-缺陷细胞(图1B类). 因此，神经纤维蛋白缺乏特别导致mTOR通路对生长因子剥夺的反应放松。

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图1。

mTOR通路在1号机组^-/-MEF公司。(A类)血清缺乏原代细胞的Western blot分析1号机组^+/+和Nf1型^-/-MEF公司。缩写如下：NF1，神经纤维蛋白；pS6K、p70S6K在T389磷酸化；pAKT，Akt在S473磷酸化；RAPA、雷帕霉素。对细胞进行血清饥饿处理，并用雷帕霉素（20 nM）处理30分钟。(B类)初级蛋白质印迹分析1号机组^+/+和1号机组^-/-氨基酸（AA）缺失的MEF。

由于神经纤维蛋白是一种RasGAP，我们研究了mTOR通路的异常激活是否在1号机组-缺乏的细胞依赖于Ras的不适当激活。值得注意的是，我们和其他人之前已经证明，Ras-GTP水平在1号机组-缺陷细胞(5——7,23). 因此，我们试图确定仅表达神经纤维蛋白的催化GRD是否足以抑制S6K1激活中观察到的缺陷。此前有报道称，该碎片用于修复与1号机组-缺乏并显著抑制Ras激活(图2A左边) (23). 此外，它还恢复了1号机组-缺陷细胞的水平相当于在相同条件下野生型细胞中观察到的水平(图2A类 赖特). 这些结果表明，该通路的过度激活1号机组-缺乏的细胞依赖于其RasGAP活性的缺失，而不是神经纤维蛋白的额外无特征功能。

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图2。

正常和1号机组^-/-成纤维细胞需要活性Ras。(A类)通过使用下拉测定法在表达NF1-GRD或空载体的细胞中定量Ras GTP水平(左侧). 显示了从下拉分析（PD）中分离出的GTP-结合Ras和总细胞提取物（TCE）中存在的总Ras蛋白。蛋白质印迹分析1号机组^+/+和1号机组^-/-表示NF1-GRD或空向量的MEF(赖特). (B类)表达NF1-GRD或空载体的血清饥饿3T3成纤维细胞对200nM胰岛素的反应的Western分析(顶部)，6μM LPA(中间)，或20 ng/ml PDGF(底部)在指定的时间内。

尽管致癌Ras等位基因的过度表达可以诱导S6K1激活(24)Ras在生长因子信号传导背景下正常参与调节mTOR的程度一直存在争议。值得注意的是，生长因子受体可以通过Ras依赖性和独立机制激活PI3激酶，其冗余性一直是该领域的一个难题。然而，Ras非依赖性PI3激酶途径被认为是主要的mTOR激活信号，并且Ras通常被完全排除在该途径的讨论之外(10,11). 这种排除可能部分归因于早期研究表明Ras对PDGF的mTOR激活不需要(25). 然而，似乎不同的生长因子可能优先参与一种途径而不是另一种。此外，体内在生长因子可能受到限制的情况下，可能需要这两条途径来激发最大的mTOR激活和随后的生物反应。在任何情况下，Ras在调节mTOR通路中激活的生理水平的要求尚未完全阐明。

神经纤维蛋白缺乏导致构成性mTOR激活的观察表明，内源性Ras的激活可以刺激这一途径。由于神经纤维蛋白GRD的表达显著抑制了野生型细胞中的Ras-GTP水平，因此该试剂还用于确定Ras激活是否是对各种生长因子响应的mTOR通路的最大激活所必需的。重要的是，在野生型细胞中，GRD显著减弱了AKT激活，钝化了S6K1激活，以响应LPA(图2B类). 它还抑制S6K1的磷酸化反应胰岛素。最后，GRD对PDGF诱导的mTOR激活没有影响，这与以前的报告一致(25). 有趣的是，作为对LPA和胰岛素的反应，GRD似乎在以后的时间点对AKT和S6K1的影响最为显著，而不是在生长因子治疗后立即。这一发现可能表明PI3激酶激活的Ras依赖机制对该途径的初始激活很重要，而Ras是更持续激活所必需的。该模型符合这样一个事实，即在受体酪氨酸激酶和G蛋白偶联受体信号中，PI3激酶的Ras依赖性激活发生在受体激活比其效应器的Ras-依赖性激活更接近于受体激活。无论如何，这些数据表明，Ras激活对生长因子响应的mTOR通路的最大激活是不同的。

确定mTOR在1号机组-缺陷细胞依赖于Ras/PI3激酶效应通路，我们检测了1号机组-PI3激酶抑制剂沃特曼存在的细胞缺陷。我们发现，沃特曼素显著降低了血清缺乏患者的AKT活化和S6K1磷酸化1号机组-缺陷细胞(图3A类). AKT在该途径中的主要靶点被认为是块茎蛋白，它对胰岛素的反应是通过这种激酶在两个不同的位点T-1462和S-939磷酸化(26——28). 已证明，块茎蛋白的AKT磷酸化可通过未知机制使TSC1/TSC2复合物失活，从而导致Rheb和mTOR随后活化(29——32). 重要的是，在Nf1型-缺乏血清的细胞块茎蛋白在T-1462和S-939处被组成性磷酸化，而野生型细胞在这些条件下磷酸化最小(图3A类). 在这些位点的磷酸化也在沃特曼的存在下受到抑制(图3A类). 最后，一个突变体TSC2型编码T-1462和S-939丙氨酸替换的基因抑制了mTOR在1号机组-缺陷细胞(图3B类).

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图3。

PI3激酶途径的过度激活1号机组^-/-初级MEF导致块茎蛋白失活。(A左边)血清饥饿的Western blot分析Nf1型^+/+和1号机组^-/-MEF公司。缩写如下：pS6K，p70S6K在T389磷酸化；pAKT，AKT在S473磷酸化；pTub-T1462，块茎蛋白在T1462磷酸化；pTub-S939，块茎蛋白在S939磷酸化。(A正确)血清饥饿状态下块茎蛋白磷酸化的Western blot分析1号机组^-/-二甲基亚砜、雷帕霉素或沃特曼治疗后的MEF。(B左侧)用血凝素标记的p70S6K报告基因转染表达pLKO慢病毒载体或针对NF1的短发夹RNA（shRNA）的HEK293细胞。(B右侧)表达针对NF1的shRNA的HEK293细胞转染了所示的块茎蛋白或NF1-GRD构建物以及血凝素标记的p70S6K报告子。缩写如下：Tub-WT，野生型块茎；Tub-SATA，AKT磷酸化位点S939/T1462处丙氨酸突变的块茎蛋白。用所示抗体对血凝素免疫沉淀物（HA-IP）和总细胞提取物（TCE）进行免疫印迹。

确定是否NF1型-NF1患者的缺陷肿瘤同样表现出mTOR通路的异常激活，我们在NF1型^+/-和NF1型^-/-来源于人类神经纤维瘤的雪旺细胞。众所周知，神经纤维瘤是一种极为异质性的病变(1). 根据人类肿瘤的遗传学研究以及小鼠模型数据，人们认为NF1患者中神经纤维瘤的发生是由于施万细胞或施万细胞前体的“二次命中”突变所致，然后施万细胞作为种子群体招募其他细胞(NF1型^+/-雪旺细胞、成纤维细胞、肥大细胞和神经周细胞）转化为发展中的病变(20,33——37). 分离雪旺细胞然后进一步分离的方法NF1型^+/-雪旺细胞来自NF1型^-/-雪旺细胞已被很好地描述(20,21). 我们获得了匹配的NF1型^+/-和NF1型^-/-来自一个皮肤和一个丛状神经纤维瘤的雪旺细胞。在这两种情况下，S6K1、AKT和块茎蛋白磷酸化在NF1型-空单元格与匹配的NF1型^+/-单元格(图4A类). 此外，沃特曼素阻断了S6K1磷酸化，表明PI3激酶途径的异常激活是这些肿瘤细胞中mTOR激活的基础(图4B类).

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图4。

NF1型^-/-肿瘤细胞表现出mTOR过度激活，对雷帕霉素高度敏感。(A类)两个独立来源的匹配患者的蛋白质印迹分析NF1型^+/-和NF1型^-/-施万细胞生长在不含外源性生长因子的0.1%血清中。(B类)免疫印迹分析NF1型^-/-用以下浓度的抑制剂处理肿瘤细胞株30分钟：DMSO，0.1%；雷帕霉素，20 nM；沃特曼，200 nM。(C类)NF1型^-/-肿瘤细胞系在指定浓度的雷帕霉素存在下生长7天，并计数为三份。

通常认为肿瘤依赖于特定信号通路的失调，因此对其下调非常敏感(38,39). 为了确定NF1相关的外周神经鞘肿瘤是否依赖于mTOR通路的过度激活，我们测试了雷帕霉素对NF1患者肿瘤的影响。在这个实验中，我们使用了恶性肿瘤（MPNSTs），它来自良性神经纤维瘤。我们发现，低浓度雷帕霉素显著抑制了来自两名NF1患者的两个独立来源的MPNST细胞系的增殖(图4C类，两条线）。IC₅₀对于这些实验而言，为1至10nM。值得注意的是，这些IC₅₀值与IC相当或低于IC₅₀雷帕霉素衍生物对PTEN公司-mTOR通路激活的缺陷性肿瘤(12,13). 此外，在两种细胞系中的一种中，雷帕霉素在较高的指示浓度下诱导细胞死亡(图4C类和数据未显示）。

作为评估雷帕霉素对NF1缺陷细胞致瘤特性影响的独立手段，我们建立了一个基因工程细胞系统。众所周知，细胞转化需要多种影响Rb、p53和Ras通路的遗传事件(40). 在MEF中，显性负性p53基因和E1A癌基因的联合表达不足以促进Rb家族成员的生长。然而，我们发现在没有1号机组，表达这些基因的细胞确实在软琼脂中形成了菌落(图5A类). 重要的是，雷帕霉素也显著抑制了该系统中低浓度的菌落生长(图5B类). 综上所述，这些结果表明NF1型-缺乏的肿瘤细胞系对雷帕霉素极为敏感，提示雷帕霉素或其衍生物在NF1患者PNS肿瘤治疗中具有潜在的疗效。

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图5。

雷帕霉素抑制软琼脂中菌落生长1号机组-缺陷转化细胞。(A类)1号机组^+/+和1号机组^-/-选择用显性阴性p53（pBabe-hygro-p53DD）和腺病毒E1A（pLPC-E1A12S）逆转录的MEF，并将其置于软琼脂中。(B类)1号机组^-/-MEFs（在A类)在软琼脂中以指定浓度的雷帕霉素培养。

讨论

在这篇文章中，我们已经证明mTOR通路在NF1型-缺乏原代细胞和人类肿瘤。重要的是，来自NF1患者的PNS肿瘤对mTOR抑制剂雷帕霉素高度敏感，表明其或其衍生物可能在治疗上有用。迄今为止，还没有有效的治疗或治愈NF1的方法。这些标志性的神经纤维瘤，即使是良性的，也会引起疼痛，使人衰弱，并且可以长到足以覆盖整个身体区域(1). 除了一些患者承受着较高的肿瘤负担外，许多患者由于潜在的神经受累而无法进行手术切除。此外，手术切除的病灶通常会再生。因此，mTOR放松调控参与NF1相关肿瘤发生的证据可能代表了该疾病的治疗突破。值得注意的是，NF1的发病率相当高，是大多数其他有声分裂症的10倍以上，甚至比TSC更常见，目前正在临床试验中评估雷帕霉素的疗效。

我们还发现，块茎蛋白介导NF1型-mTOR不足。尽管AKT在1号机组-缺乏细胞，这种激酶在NF1相关肿瘤中的关键致病靶点尚不清楚(41). 我们已经证明，在NF1患者的人类肿瘤中，块茎蛋白是AKT的靶点。此外，AKT对块茎蛋白的灭活是mTOR激活的绝对必要条件1号机组-缺乏细胞。这些数据确定NF1是参与mTOR激活的肿瘤抑制因子和癌基因级联中的一个新参与者。我们之前已经证明，神经纤维蛋白在生长因子的作用下迅速降解，并且需要其重新出现才能适当终止野生型细胞中的Ras信号(7). 因此，神经纤维蛋白可能在适当调节这种信号以响应生长因子方面发挥积极作用。无论如何，这些数据表明，在缺乏促有丝分裂刺激的情况下，神经纤维蛋白对于适当抑制mTOR信号是必不可少的。

此外，尽管已知mTOR对生长因子的激活是PI3激酶依赖性的，但Ras参与这一过程的程度尚不清楚。通过使用1号机组-我们能够唯一地确定，内源性Ras的激活，通过神经纤维蛋白的丢失，导致mTOR激活的致病水平。此外，我们还表明，在野生型细胞中，Ras激活是响应LPA和胰岛素的最大mTOR激活所必需的。尽管这可能是一个微妙的点，但Ras效应器通路的振幅和持续时间已被证明对明确生物反应至关重要(42). 因此，在缺乏Ras信号的情况下，可能无法达到mTOR激活的阈值水平，这在某些情况下可能会产生重要的生物学后果。有趣的是，对PDGF的反应似乎不需要激活Ras，这表明该途径在对不同生长因子的反应中起着不同的作用。

最后，雷帕霉素衍生物被认为是治疗多种癌症的潜在药物(43,44). 特别是，有人认为这些药物与其他小分子抑制剂联合使用可能有用(43). 这一建议的基础是肿瘤中有多个基因发生突变；因此，可能需要抑制多条通路才能达到治疗效果。在此基础上，I型神经纤维瘤病可能是一种独特的可治疗疾病。值得注意的是，良性症状，如神经纤维瘤，可能相当严重。然而，它们很可能发生于单个基因的突变：NF1型因此，雷帕霉素衍生物可能通过阻止肿瘤的发展和/或促进肿瘤的消退，为这些病变提供一次性治疗。因此，这些药物可能是这种无法治疗且具有破坏性的肿瘤类型的首批可行治疗方法之一。然而，这种益处可能会延伸到外周神经鞘肿瘤之外，包括其他NF1症状。最近，mTOR通路在高百分比的急性髓细胞白血病中被激活（在没有NF1的患者中）(45). 此外，这些患者似乎对雷帕霉素有反应，这表明mTOR的异常激活对该肿瘤类型的发展也至关重要。这些观察结果，再加上我们证明NF1和mTOR之间存在直接联系的数据，支持这些药物也有可能用于治疗NF1相关的髓系恶性肿瘤。

致谢

笔记

作者贡献：C.M.J.、E.E.R.和K.C.设计的研究；C.M.J.和E.E.R.进行了研究；M.F.J.、H.B.和E.L.贡献了新的试剂/分析工具；C.M.J.、E.E.R.和K.C.分析数据；K.C.写了这篇论文。

缩写：GRD，GAP相关领域；LPA、，我-α-溶血磷脂酸；血小板衍生生长因子。

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