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.2023年1月25日；12(3):405.
doi:10.3390/cells12030405。

酪蛋白激酶2磷酸化IGFBP-3阻断其与透明质酸的相互作用，使HA-CD44信号传导导致NSCLC细胞存活率增加和顺铂抵抗

凯玲-科尔曼 1, 迈克尔·奇亚拉蒙蒂 1, 本·哈达德 1, 罗伯特·兰森伯格 1, 希瑟·海宁 1, Hind Al Khashali公司 1, 拉威尔·雷 1, 班达维什 1, 杰弗里·格思里 1, 黛博拉·希尔 1, 赫迪尔·盖·埃文斯 1
附属公司

酪蛋白激酶2磷酸化IGFBP-3阻断其与透明质酸的相互作用，使HA-CD44信号传导导致NSCLC细胞存活率增加和顺铂抵抗

凯林·科尔曼等。 细胞. .

摘要

顺铂是一种用于治疗非小细胞肺癌（NSCLC）的铂类药物。非小细胞肺癌顺铂耐药的基本操作机制尚不清楚。在本研究中，我们发现CK2磷酸化IGFBP-3（P-IGFBP-3）降低了其与透明质酸（HA）的结合，但不降低其与IGF-1的结合，并且在人类NSCLC细胞系A549和H1299中，该蛋白在降低细胞活力或增加凋亡方面的效果不如非磷酸化蛋白加或不加顺铂。我们的数据表明，阻断CD44信号增强了顺铂的作用，IGFBP-3在抑制HA-CD44信号方面比P-IGFBP-3更有效。阻断CK2活性和HA-CD44信号传导可提高顺铂敏感性，更有效地阻断PI3K和AKT活性以及磷酸化/总NFκB比率，并导致A549细胞中p53活化增加。与靶向PI3K、AKT和NFκB的抑制剂联合治疗后，细胞对顺铂的敏感性增加，同时阻断p53活性降低A549细胞对顺丁的敏感性。我们的发现揭示了CK2在磷酸化IGFBP-3和增加非小细胞肺癌顺铂耐药性方面的新机制。CK2阻断IGFBP-3的磷酸化可能是提高NSCLC对顺铂敏感性的有效策略。

关键词：CD44；酪蛋白激酶2；IGFBP-3；顺铂；细胞外；透明质酸；肺癌；p53；磷酸化；发送信号。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
与单纯TBB或顺铂治疗相比，TBB和顺铂治疗在降低细胞活力方面更有效。电池（0.2×105)在添加10%FBS的培养基中培养24小时，然后将血清饥饿过夜。然后在无血清培养基中培养细胞单层72小时，不存在或存在不断增加的TBB浓度(A类)或顺铂(B类)然后如方法部分所述测量细胞活力。通过表示与最佳拟合Emax值（设置为100%）相关的每个点，对曲线的光密度（570 nm）进行标准化。然后将数据绘制为TBB或顺铂浓度增加的函数，并使用非线性回归曲线拟合方法进行拟合。当使用A549细胞时，在不使用或使用10µM顺铂的情况下使用TBB（7.5µM）治疗时，也测量了生存能力(C类)和30µM顺铂（使用H1299细胞时）(D类). 星号表示与每个细胞系的相应对照组之间存在统计显著差异，即Mann-Whitney检验**第页< 0.01. 使用GraphPad Prism 9.4.1软件对数据进行处理，并将数据表示为三次独立分析的平均值±S.D.，每次分析一式三次。
图2
图2
CK2对IGFBP-3的磷酸化影响其与HA的结合，但不影响其与IGF-1的结合。IGFBP-3（50 nM）未被CK2磷酸化或磷酸化(A类)与井结合，然后生物素HA浓度增加(B类)或IGF-1(C类)按照“方法”部分中的说明添加和处理。通过表示与IGFBP-3的最佳拟合Emax值（设置为100%）相关的每个点，对曲线的光密度（ODs，450 nm）进行标准化。然后将数据绘制为生物素HA或IGF-1浓度增加的函数，并使用GraphPad Prism 9.4.1软件，采用非线性回归曲线拟合方法进行拟合。在分析之前，通过减去含有相同IGFBP-3浓度但使用水代替生物素-HA或IGF-1的阴性对照的平均背景吸光度，对数据中的OD进行非特异性结合校正。数据表示为三个独立实验的平均值±S.D.，每个实验均进行三次。
图2
图2
CK2对IGFBP-3的磷酸化影响其与HA的结合，但不影响其与IGF-1的结合。IGFBP-3（50 nM）未被CK2磷酸化或磷酸化(A类)与井结合，然后生物素HA浓度增加(B类)或IGF-1(C类)按照“方法”部分中的说明添加和处理。通过表示与IGFBP-3的最佳拟合Emax值（设置为100%）相关的每个点，对曲线的光密度（ODs，450 nm）进行标准化。然后将数据绘制为生物素HA或IGF-1浓度增加的函数，并使用GraphPad Prism 9.4.1软件，采用非线性回归曲线拟合方法进行拟合。在分析之前，通过减去含有相同IGFBP-3浓度但使用水代替生物素-HA或IGF-1的阴性对照的平均背景吸光度，对数据中的OD进行非特异性结合校正。数据表示为三个独立实验的平均值±S.D.，每个实验均进行三次。
图3
图3
无论是否使用顺铂，P-IGFBP-3在降低细胞活力和增加细胞凋亡方面的效果都不如IGFBP-3。电池（0.2×105)在添加了10%FBS的培养基中培养24小时。第二天，在无血清培养基中孵育细胞单层过夜，然后用顺铂（使用A549细胞时为10μM，使用H1299细胞时为30μM）、CD44抗体5F12（5μg/mL）、，单独添加或在添加IGFBP-3和/或顺铂、IGFBP-3或P-IGFBP-2（50 nM）前2小时添加，或与含有各种治疗中特定成分的培养基组合添加，每24小时更换一次A549的活性和凋亡(A类,B类)和H1299(C类,D类)然后按照方法部分中的描述对细胞进行评估。使用GraphPad 9.4.1软件对五次独立分析的数据进行平均、归一化，并表示为相对于未处理细胞（对照）的折叠变化。图表总结了以平均值±标准差表示的结果(n个= 5). Mann-Whitney检验显示，星号表示与每个细胞系的相应对照组之间存在统计显著性差异，而没有星号表示没有显著性差异。采用普通的单因素方差分析（ANOVA）和Tukey的事后多重比较检验分析不同组之间的统计差异**第页<0.0升。
图4
图4
用CD44抗体5F12孵育，可消除IGF-1和IGFBP-3或P-IGFBP-3联合或不联合顺铂处理的细胞诱导的细胞活力或凋亡差异。电池（0.2×105)在补充10%FBS的培养基中生长24小时。第二天，将细胞单层在无血清培养基中孵育过夜，然后用顺铂（使用A549细胞时为10μM，使用H1299细胞时为30μM）、IGF-1（100 ng/mL）、IGFBP-3或P-IGFBP-3（50 nM）、CD44抗体5F12（5μg/mL）处理72小时，单独添加或在添加指定的其他处理前2小时添加，或组合添加。每24小时更换一次含有不同处理中特定成分的培养基。A549的活性和凋亡(A类,B类)和H1299(C类,D类)然后按照方法部分中的描述对细胞进行评估。将来自五次独立分析的数据平均化、标准化，并表示为相对于未处理细胞（对照）的倍数变化。图表总结了以平均值±SD表示的结果(n个= 5). 星号表示与每个细胞系组的对照组或单一治疗组相比具有统计显著性差异，而没有星号表示使用GraphPad 9.4.1软件Mann-Whitney测试没有显著性差异。通过普通的单因素方差分析（ANOVA）和Tukey的事后多重比较检验来分析不同组之间的统计差异*第页< 0.05, **第页<0.0升。没有星号表示没有意义（ns）。
图5
图5
TBB和5F12联合治疗提高了细胞对顺铂的敏感性.电池（0.2×105)在添加10%FBS的培养基中培养24小时，然后将血清饥饿过夜。细胞单层随后在无血清培养基中孵育72小时，在不存在或存在TBB（7.5µM）的情况下，添加5F12（5μg/mL）2小时后再添加其他处理剂、顺铂，然后组合使用细胞活力(A、 B类)按照方法一节中的描述进行测量。通过表示与最佳拟合Emax值（设置为100%）相关的每个点，对曲线的光密度（570 nm）进行标准化。然后将数据绘制为顺铂浓度增加的函数，并使用GraphPad Prism 9.4.1软件和非线性回归曲线拟合方法进行拟合。数据表示为三个独立实验的平均值±S.D.，每个实验均进行三次。还使用抗裂解caspase-3抗体进行了蛋白质印迹分析(C类,D类)以及切割caspase-3水平的定量(电子,F类)使用图像J 1.47 v软件。数据(电子,F类)表示为平均值±SD，n个= 3, **第页<0.005与对照组相比，Mann-Whitney检验。
图6
图6
5F12和TBB联合处理对降低两种细胞系中的PI3K和AKT活性以及磷酸化/总NFκB比率最为有效，仅对增加A549细胞中的p53活性最为有效。电池（0.2×105)在添加了10%FBS的培养基中培养24小时。第二天，将细胞单层在无血清培养基中孵育24小时，然后按照指示使用抑制剂TBB（7.5µM）和/或5F12（5μg/mL）处理72小时。PI3K活性由总细胞内ELISA试剂盒测定，AKT、NFκB和p53活性由相同数量的细胞裂解液蛋白（总蛋白600µg/mL，3µL）测定，如方法部分所述。将来自五次独立分析的数据平均化、标准化，并表示为相对于未经抑制剂处理的细胞（对照组、，A类–C类)或至A549控制(D类,电子). 图表总结了以平均值±标准差表示的结果(n个= 5). 星号表示与使用GraphPad 9.4.1软件进行的Mann–Whitney测试的对照组相比存在统计显著性差异。通过普通的单因素方差分析（ANOVA）和Tukey的事后多重比较测试分析不同组之间的统计差异*第页< 0.05, **第页<0.0升。
图7
图7
细胞与PI3K、AKT和NFκB抑制剂联合治疗后，细胞对顺铂的敏感性增加，但在用p53抑制剂治疗的A549细胞中，顺铂敏感性降低。电池（0.2×105)在补充10%FBS的培养基中生长24小时。第二天，将细胞单层在无血清培养基中孵育24小时，然后按指示用靶向PI3K（LY294002，14.5μM）、AKT（AKT抑制剂，1.75μM）、NFκB（NFκB抑制剂，18μM）、p53（pifithrin-α，10μM）的抑制剂处理72小时，不含或含顺铂（使用A549细胞时为10μM，使用H1299细胞时为30μM）。然后按照方法部分所述测定A549（A）和H1299（B）细胞的活性。使用GraphPad 9.4.1软件对五次独立分析的数据进行平均、归一化，并表示为相对于未处理细胞（对照）的折叠变化。图表总结了以平均值±SD表示的结果(n个= 5). 星号表示每个细胞系与未经顺铂治疗的相应样本之间存在统计显著差异，即Mann-Whitney检验**第页<0.0升。
图8
图8
陈述本研究的主要假设和发现。CK2对IGFBP-3的磷酸化阻断了其与HA的相互作用，使HA-CD44信号转导，进而激活PI3K/AKT/NFκB信号转导并抑制p53。这导致细胞凋亡受到抑制，细胞存活率和化疗耐药性增加。在这个模型中，CK2通过激活AKT和NFκB进一步增加化疗耐药性。
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