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.2023年3月；10（8）：e2206212。
doi:10.1002/advs.202206212。 Epub 2023年1月25日。

重组肿瘤微环境并抑制MAPK通路治疗小鼠脑转移瘤

李森路 1 2, 花团子 三, 周杰（音译） 2, Jing Huang（黄晶） 1, 紫韩灯 1, 紫剑堂 1, 李丽 1, 石秀娟 1, Pui-Chi Lo公司 4, 乔纳森·洛弗尔 5, 邓德强 1, 赵湾 2, 金洪林 1
附属公司

重组肿瘤微环境并抑制MAPK通路治疗小鼠脑转移瘤

李森路等。 高级科学（Weinh）. 2023年3月.

摘要

脑转移（BRM）在晚期肺癌中很常见。然而，由于血脑屏障（BBB）和免疫抑制肿瘤微环境（ITME），它们的治疗具有挑战性。微粒（MP）是一种细胞外囊泡，可以作为生物相容性药物传递载体，可以通过基因工程技术进行进一步调节。比较了由不同损伤诱导的细胞制备的MP，发现经辐射处理的细胞释放微粒（RMP）实现了最佳靶向性和巨噬细胞活化。发现BRM中表达泛素特异性蛋白酶7（USP7），该酶同时调节肿瘤生长并对M2巨噬细胞（M2Φ）进行重组。然后构建工程化RMP，其包括：1）靶向并重组M2Φ的RMP载体；2） 一种改进BBB通透性的基因表达SR-B1靶向肽；和3）USP7抑制剂，以杀死肿瘤细胞并重新编程M2Φ。这些RMP在小鼠体内外成功跨越BBB并靶向M2Φ，有效地重新编程M2Φ并提高小鼠BRM模型的存活率。当结合免疫检查点阻断时，治疗效果会进一步增强。本研究为使用基因工程MP治疗BRM提供了概念证明。

关键词：USP7；血脑屏障；肿瘤免疫治疗；细胞外小泡；巨噬细胞极化。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
这项研究展示了一种静脉注射的基因工程微粒，其中装载了氘蛋白抑制剂，这是一种来源于接受放射治疗的肺癌细胞的物质。微粒穿过血脑屏障，同时靶向并重新编程M2巨噬细胞，促进效应T细胞浸润并释放促炎细胞因子，有效抑制肺癌脑转移的发展。
图2
图2
P5091@零售价‐R4F结构和特性。A） 采用免疫组织化学方法研究USP7在人肺原位腺癌和脑转移瘤中的表达（图像中的数字表示组织芯片中的位置）。比例尺：200µm。B） 从肿瘤细胞的不同处理中获得的囊泡被筛选其靶向巨噬细胞和重新编程巨噬细胞的能力。使用unparied进行统计分析t吨‐测试(n个 = 3). 数据表示为平均值±SEM(n个 = 3). *第页 < 0.05, **第页<0.01***第页 < 0.001. C） 将肽锚定到细胞外膜的策略示意图。D） Lewis或Lewis‐R4F细胞中R4F‐GFP‐GPI mRNA的表达。E） 共焦成像R4F‐GFP‐GPI在细胞中位置的代表性图像，比例尺：20µm。F） 用于获取相应P5091@零售价‐R4F。G） 的尺寸分布P5091@零售价‐R4F通过动态光散射。H）尺寸分析P5091@零售价‐R4F通过透射电子显微镜，比例尺：200 nm。一） RMP、RMPs‐R4F、，P5091@零售价‐R4F。比例尺为400纳米。J） HPLC用于确定P5091@零售价‐R4F。K） CD9和TSG101在RMP、RMP‐R4F和P5091@零售价‐R4F。
图3
图3
P5091@零售价‐R4F瞄准并重新编程M2Φ。A–D）流式细胞术检测BV2小胶质细胞、LLC细胞、M1Φ和M2Φ中RMP‐R4F摄取的代表性图像，以及上述细胞与不同DiD染色微泡孵育后的相对荧光强度。比例尺：50µm。E、 G）与不同RMP孵育后，M2Φ中CD206和CD86的代表性表达。F、 H）流式细胞术检测不同RMP孵育后M2Φ中CD206和CD86的相对荧光强度。使用unparied进行统计分析t吨‐测试(n个 = 3). 数据表示为平均值±SEM*第页<0.05时**第页 < 0.01,***第页<0.001，ns：不显著。
图4
图4
P5091@零售价‐R4F在体内穿过血脑屏障。A） 使用全身成像系统分析DiD染色RMP、RMP‐R4F或P5091@零售价‐24小时后不同器官中的R4F静脉注射.注入。B） 免疫荧光检测CD206阳性巨噬细胞，作为RMP、RMP‐R4F和RMP处的P5091‐R4F注入尾静脉。通过共焦显微镜获得图像。红色‐DiD、黄色‐CD206、绿色‐F4/80、蓝色‐DAPI。比例尺：100µm。数据表示为平均值±SEM(n个 = 3). C） 区分不同免疫细胞类型的门控策略。D、 E）流式细胞术检测不同免疫细胞类型的荧光强度。使用单向方差分析和Tukey多重比较测试进行统计分析(n个 = 3). 数据表示为平均值±SEM*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001.
图5
图5
治疗效果P5091@零售价‐肺癌脑转移模型中的R4F。A） 模型建立时间和药物注射时间示意图。B） 全身图像显示了不同药物治疗后大脑中表达荧光素酶的LLC细胞的生长。C） TUNEL染色的代表性图像，观察指定治疗后肿瘤细胞的死亡。比例尺：100µm。D） HE染色的代表性图像，用于观察指定治疗后大脑中的肿瘤区域。比例尺：1 mm。
图6
图6
不同治疗后肿瘤环境中的免疫细胞侵袭。A） 模型建立时间和药物注射时间示意图。B） 不同治疗组的生存率统计(n个=10只小鼠）。C） 免疫细胞流式细胞术的门控策略和指示治疗的代表性结果。D–F）CD8+CD3中的T细胞百分比+细胞，CD8+干扰素‐γ +CD8中的T细胞百分比+T细胞和M2Φ在F4/80中的百分比+来自指定治疗的巨噬细胞。数据表示为平均值±SEM(n个=6只小鼠）。G） 所示治疗的代表性免疫荧光图像。蓝色‐DAPI、红色‐F4/80、绿色‐CD206。比例尺：50µm。H） 所示治疗的典型免疫荧光图像。蓝色‐DAPI、绿色‐CD8、黄色‐IFN‐γ。比例尺：50µm。使用对数秩Mantel–Cox检验对（B）进行统计分析，使用单向方差分析对（D，E，F）进行多重比较检验。数据表示为平均值±SEM*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页<0.001，ns：不显著。
图7
图7
治疗后细胞因子检测及诱导巨噬细胞重编程的分子机制P5091@零售价‐R4F。A） 流式细胞术测定指定治疗组血清中的细胞因子浓度(n个=6只小鼠）。B） 热图显示了在TAM中差异表达的M1和M2相关基因P5091@零售价‐R4F组和对照组基于RNA测序结果。C） KEGG分析根据两组差异表达基因确定17条最丰富的途径。D） 差异表达基因的火山图。红点显示显著上调的基因，绿点显示显著下调的基因。E） IL-4/13‐BMDM M2细胞中pJNK、pERK、p38和GAPDH的Western blottingP5091@零售价指示时间点的R4F。使用单向方差分析和Tukey的多重比较检验（A）进行统计分析。数据表示为平均值±SEM*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页<0.001，ns：不显著。
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