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高级科学（Weinh）。2023年3月；10(8): 2206212.
2023年1月25日在线发布。 数字对象标识：10.1002/advs.202206212
预防性维修识别码：项目经理1015898
PMID：36698296

重组肿瘤微环境并抑制MAPK通路治疗小鼠脑转移瘤

李森路，1，2 花团子，三 周杰（音译），2 黄晶，1 紫韩灯，1 紫剑堂，1 李丽，1 石秀娟，1 培智罗，4 乔纳森·洛弗尔，5 邓德强，通讯作者1 潮湾，通讯作者2和金洪林通讯作者1
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摘要

脑转移（BRM）在晚期肺癌中很常见。然而，由于血脑屏障（BBB）和免疫抑制肿瘤微环境（ITME），它们的治疗具有挑战性。微粒（MP）是一种细胞外囊泡，可以作为生物相容性药物传递载体，可以通过基因工程技术进行进一步调节。比较了由不同损伤诱导的细胞制备的MP，发现经辐射处理的细胞释放微粒（RMP）实现了最佳靶向性和巨噬细胞活化。发现BRM中表达泛素特异性蛋白酶7（USP7），该酶同时调节肿瘤生长并重新编程M2巨噬细胞（M2Φ）。然后构建工程化RMP，其包括：1）靶向并重组M2Φ的RMP载体；2） 一种基因表达的SR‐B1靶向肽，用于改善BBB通透性；和3）USP7抑制剂，以杀死肿瘤细胞并重新编程M2Φ。这些RMP在小鼠体内外成功跨越BBB并靶向M2Φ，有效地重新编程M2Φ并提高小鼠BRM模型的存活率。当结合免疫检查点阻断时，治疗效果会进一步增强。本研究为使用基因工程MP治疗BRM提供了概念验证。

关键词：血脑屏障、癌症免疫治疗、细胞外囊泡、巨噬细胞极化、USP7

来自经辐射处理的Lewis肺癌细胞的微粒对巨噬细胞具有最强的靶向性和重编程作用。当负载泛素特异性蛋白酶7抑制剂和R4F肽时，这些颗粒可以主动跨越血脑屏障，并在肿瘤微环境中对巨噬细胞进行重组，通过联合免疫治疗有效延长小鼠肺癌脑转移模型的存活率。

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1 介绍

肺癌的发病率仅次于乳腺癌，死亡率居所有癌症之首。[ 1 ]近80%的肺癌患者在晚期发生多发性脑转移。[ 2 ]肺癌脑转移瘤（BRM）的主要临床治疗策略是放疗和化疗。[ 三 ]然而，放射治疗通常会对神经系统造成不可逆的损伤，同时血脑屏障（BBB）会阻止化疗药物有效渗透到靶点。[ 4 ]免疫治疗的迅速发展和脑内淋巴管的发现为BRM提供了一种新的治疗策略。[ 5 ]然而，免疫抑制肿瘤微环境（ITME）限制了BRM患者免疫治疗的效果。[ 6 ]因此，有必要开发新的治疗策略来逆转BRM的ITME。

有效的脑靶向给药系统是促进药物深入中枢神经系统（CNS）和改善脑肿瘤ITME的先决条件。自体肿瘤细胞衍生微粒（MP，包含来自细胞的DNA、RNA、蛋白质和脂质，主要是此处的微泡）因其安全、易于修饰、具有较大的药物载量和特定的靶向特性而备受关注。[ 7 ]因此，议员们非常适合作为个性化癌症治疗的药物载体。MP可以将肿瘤细胞抗原或其他自体细胞相关抗原传递给DC并诱导CD8+体内T细胞依赖性抗肿瘤反应或免疫抑制反应。[ 8，9 ]紫外线照射肿瘤联合甲氨蝶呤产生的MP已在肝外胆管癌或恶性胸腔积液患者中进行测试，显示出良好的治疗效果。[ 10，11，12 ]

MP的功能可能因获得条件而异；例如，肿瘤在生理条件下分泌的MP可以促进肿瘤进展，[ 13 ]而肿瘤暴露于放疗、热疗、紫外线或酸碱刺激后产生的MP具有一定的免疫激活功能。[ 12，13，14，15 ]然而，不同治疗方法产生的MP的抗肿瘤功能的程度仍有待探索。此外，MP在BBB中具有一些固有功能，可能是由于整合素和四spanins的表达以及接收细胞上特定受体的一些配体。这种靶向或穿透效应可以通过使用多种配体（例如转铁蛋白、胰岛素、载脂蛋白E、血管肽-2和抗体）的表面修饰进一步增强。[ 16 ]然而，国会议员不足以有效逆转大脑中的ITME。因此，有必要将合适的MP平台与其他策略相结合，以靶向和治疗BRM。

肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）释放免疫抑制因子，如白细胞介素-10和转化生长因子β，诱导效应T细胞的耗竭，并促进髓源性抑制细胞（MDSCs）的形成。因此，TAM是ITME的主要贡献者之一，约占BRM ITME中浸润免疫细胞的50%。[ 17 ]此外，与异质性肿瘤细胞相比，TAM具有相对保守的基因稳定性，使其成为逆转ITME的关键治疗靶点。减少M2巨噬细胞（M2Ф）的方法包括涉及CSF‐1R siRNA和相关抗体的敲除方法，[ 18 ]纳米材料的自噬干预。[ 19 ]为了重新编程M2Ф，已经构建了几个纳米载体，将编码M1极化转录因子的mRNA传递到表达CD206的M2Ф。[ 20 ]此外，一些研究报告称，可以通过激活NF‐κB信号通路或转移M1Ф相关转录因子。[ 21 ]虽然这些策略可以促进M2Ф的极化，但更吸引人的方法是确定一个可以同时调节肿瘤和M2Ф的双重靶点。之前，我们已经证明，去泛素化酶USP7（皮下Lewis肿瘤模型中的癌基因）在M2Ф中的表达远高于M1Ф。抑制USP7可以有效逆转肺癌皮下肿瘤模型中的ITME。[ 22 ]然而，USP7在BRM中的作用尚未报道。

在本研究中，我们观察到，与来自其他细胞培养条件（包括正常培养条件、化疗和紫外线（UV）辐射）的MP相比，经辐射处理的细胞释放微粒（RMP）在体外靶向和激活巨噬细胞方面具有更大的作用。此外，我们发现USP7在人类和小鼠BRM以及TAM中均高表达，表明USP7抑制剂在逆转大脑ITME中的潜力。为了进一步提高RMP穿越BBB的能力，我们通过基因工程在RMP的外表面表达了一种清道夫受体B1（SR-B1）靶向肽，据报道SR-B1受体在BBB内皮细胞、M2Ф/小胶质细胞和Lewis肺癌（LLC）细胞中表达。[ 23 ]基于这些原则，我们构建了一个基因工程和载药的P5091@零售价‐R4F，包含RMP载体、SR‐B1靶向肽和USP7抑制剂。与原始RMP相比，设计的RMP处的P5091‐R4F大量渗入BBB，可能专门针对F4/80+CD206型+M2Φ/小胶质细胞，并降低体外M2Φ中CD206的表达。静脉注射后，P5091@零售价‐R4F可通过抑制USP7酶活性激活MAPK信号通路，有效重组M2Φ，改善ITME，延长BRM小鼠的存活率(图  1 ). 当结合免疫检查点阻断免疫治疗时P5091@零售价‐R4F显著增强小鼠效应T细胞浸润和存活率。因此，本研究证明了一种新的脑靶向给药系统和免疫调节靶向治疗BRM。

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这项研究展示了一种静脉注射的基因工程微粒，其中装载了氘蛋白抑制剂，这是一种来源于接受放射治疗的肺癌细胞的物质。微粒穿过血脑屏障，同时靶向并重新编程M2巨噬细胞，促进效应T细胞浸润并释放促炎细胞因子，有效抑制肺癌脑转移的发展。

2 结果

2.1、。质粒的构建和表征P5091@零售价‐4英尺

我们之前报道过，USP7可以在小鼠肺癌皮下肿瘤模型中调节ITME并重新编程M2Ф。[ 22 ]然而，USP7在BRM中的表达水平尚不清楚。因此，对患者的原发性肺腺癌和相关脑转移进行了组织学检查。结果表明，USP7不仅在常用的小鼠Lewis肿瘤模型的脑转移瘤中高表达（图S1（第一阶段），支持信息），但也适用于人类原发性肺腺癌（A07、B09、G01）和脑转移(图  2一个，F03，H09，G11），表明USP7是治疗BRM的潜在靶点。为了有效地在大脑中重新编程ITME并传递USP7抑制剂，需要选择一个具有大载药量、良好生物相容性和固有免疫调节能力的合适药物传递平台。为此，我们比较了DDP、UV、放射治疗和正常培养条件下细胞产生的MP的产量及其靶向和重组M2Ф的能力。放射治疗产生的MP含量与紫外线处理相似，是正常培养条件和DDP的5倍以上。为了测试其靶向和重编程M2Ф的能力，用DiD染料标记获得的MP，并用BMDM衍生的M2ф培养。流式细胞术数据显示，放疗组的荧光信号分别是紫外线组、顺铂组和正常培养条件组的1.5倍、2倍和12倍，表明RMP在受试组中具有最佳M2Ф靶向能力。更重要的是，放射治疗组MФ极化标记CD86的表达分别是紫外线组、顺铂组和正常培养条件组的3.5倍、4倍和4倍，表明RMP在受试组中极化M2Ф的能力最强。综上所述，我们选择放射治疗肿瘤细胞产生的MP用于后续实验，因为它们对靶向和重组M2Ф的效果最好，并且产生了更多的MP（图2B型，表S1（第一阶段），支持信息）。

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P5091@零售价‐R4F结构和特性。A） 采用免疫组织化学方法研究USP7在人肺原位腺癌和脑转移瘤中的表达（图像中的数字表示组织芯片中的位置）。比例尺：200µm。B） 对从不同肿瘤细胞处理中获得的囊泡进行筛选，以确定其靶向巨噬细胞并对其重新编程的能力。使用未配对进行统计分析t吨‐测试(n个 = 3). 数据表示为平均值±SEM(n个 = 3). *第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001. C） 将肽锚定到细胞外膜的策略示意图。D） Lewis或Lewis‐R4F细胞中R4F‐GFP‐GPI mRNA的表达。E） 共焦成像R4F‐GFP‐GPI在细胞中位置的代表性图像，比例尺：20µm。F） 用于获取相应P5091@零售价‐R4F。G） 的尺寸分布P5091@零售价‐R4F通过动态光散射。H）尺寸分析RMP处的P5091‐R4F，透射电子显微镜，比例尺：200 nm。一） RMP、RMPs‐R4F、，P5091@零售价‐R4F。比例尺为400 nm。J） HPLC用于确定P5091@零售价‐R4F。K） CD9和TSG101在RMP、RMP‐R4F和P5091@零售价‐R4F。

为了提高RMP穿越BBB的能力，我们在LLC细胞表面表达肽R4F以模拟高密度脂蛋白。为了将R4F肽定位到细胞膜表面，在肽的上游添加转铁蛋白信号肽序列（MRLTVGALLACAALGLCLA），在R4F后添加EGFP序列，以便追踪R4F多肽的位置。同时，在末端添加GPI膜锚定序列（GGSSLQSTAGLLALSLSLLHLYC），将R4F锚定到细胞膜表面。整体质粒设计如图所示2厘米融合基因序列如表所示S2系列（支持信息）。在表达目标片段后，使用共焦显微镜和RT-PCR来确定EGFP荧光信号在LLC细胞中的表达和定位。研究发现，EGFP在转染的LLC细胞中高度表达，并且主要分布在细胞膜周围（图二维，E). 为了验证放疗后转染LLC产生的RMP中R4F的存在，并估计R4F‐EGFP‐GPI的浓度，我们使用GFP作为R4F‐EGFP‐GPI的指标。图S2A公司（支持信息）显示RMP‐R4F显示GFP信号，反映R4F在RMP中富集。通过使用GFP标准曲线计算Western blotting分析的灰度值，进一步量化R4F‐EGFP‐GPI的浓度。如图所示S2B型（支持信息），R4F‐EGFP‐GPI占总RMP‐R4F蛋白质含量的≈0.1%。为了增强RMP极化M2Ф和杀伤肿瘤细胞的能力，我们还将USP7抑制剂P5091加载到RMP中；收购战略P5091@零售价‐R4F如图所示2楼使用动态光散射和透射电子显微镜来识别放射治疗后的RMP（图2G，高). RMP、RMP‐R4F和P5091@零售价‐R4F基本相同，主要分布在400和600 nm之间，这些结果与扫描电子显微镜分析一致（图第二阶段). 我们计算了一下P5091@零售价‐使用高效液相色谱法，R4F每1 mg蛋白质含量含有近0.1 mg P5091（图S2C公司，支持信息）。

其次，血清稳定性P5091@零售价使用双重染料标记的RMP检测‐R4F，其中CFSE主要用于标记RMP的含量。其基本原理是CFSE可以标记活细胞中的蛋白质，因此从CFSE标记细胞释放的RMP将包含大量CFSE标记的蛋白质。选用DIR染料标记RMP的外表面。当RMP的结构被破坏时，内含物将泄漏，导致内含物和RMP外表面的荧光共定位丢失。在本实验中，我们将RMP与小鼠血清和胎牛血清孵育不同时期，然后使用天然SDS‐PAGE验证RMP的血清稳定性。结果表明，CFSE和DIR的荧光在整个测试的孵育期内高度共定位（图第3章支持信息），表明RMP在结构上保持稳定。我们使用HPLC进一步研究了在小鼠血清存在下RMP‐R4F中装载的P5091的释放。观察到缓释曲线（图2J型)培养72小时后，P5091的浓度约为原始浓度的三分之二，表明RMP‐R4F可以释放疏水性药物，如P5091。此外，MPs的经典分子标记如CD9和TSG101也在RMP、RMP‐R4F和P5091@零售价‐R4F（图2千卡).

此外，CCK‐8分析证实，RMP‐R4F@P5091对LLC细胞的细胞毒性作用强于RMPs-R4F（图S4系列，支持信息）。为了进一步证明RMP‐R4F对SR‐B1的高特异性靶向能力，我们选择了SR‐）B1阴性细胞系IDIA7和阳性细胞系mSR‐，以确认R4F在RMP表面的表达。首先，用PKH67绿色荧光染料对RMPs‐R4F的膜进行染色，然后与IDIA7和mSR‐B1孵育3小时。共焦成像和流式细胞仪结果表明，mSR-B1细胞的荧光强度是IDIA7细胞的2.5倍，这证实了RMP-R4F对SR-B1受体的特异性靶向（图第5章，支持信息）。上述结果证实，R4F主要表达于RMP的外膜表面，对P5091具有较强的负载能力，可以有效靶向表达SR-B1受体的细胞。

2.2. 肿瘤/TAM靶向性和重组能力P5091@零售价‐4英尺

脑巨噬细胞和小胶质细胞在BRM中起着重要作用。据报道，SR‐B1受体在吞噬细胞和某些类型的肿瘤表面高度表达，[ 22，25 ]因此，我们确定了RMP‐R4F是否能在体外靶向巨噬细胞/小胶质细胞和LLC细胞。为了实现这一点，我们使用BV2小胶质细胞系、从小鼠骨髓细胞分化的M2Φ和M1Φ以及LLC细胞来研究细胞类型特异性靶向性。图S6系列（支持信息）显示，与M1Φ和M2Φ相比，BV2细胞表达更高水平的SR‐B1受体。

为了确定RMP‐R4F是否能特异靶向M2Φ，我们用DiD染色的RMP、RMPs‐R4]或P5091@零售价‐R4F。与M1Φ和LLC细胞相比，共焦成像图  三A–D表明M2Φ和BV2细胞吸收了更多的RMP‐R4F。流式细胞术结果表明，M1Φ占据了相同数量的RMP、RMP‐R4F和RMP处的P5091‐R4F（图3C公司). 然而，R4F肽将M2Φ的RMP摄取量提高了1.5倍以上（图三维)在BV2小胶质细胞中增加了3倍以上（图3A级)，在肿瘤细胞中增加了2倍以上（图3B公司). P5091的包装不影响P5091@零售价‐R4F与RMP‐R4相比。

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P5091@零售价‐R4F瞄准并重新编程M2Φ。A–D）流式细胞术检测BV2小胶质细胞、LLC细胞、M1Φ和M2Φ中RMP‐R4F摄取的代表性图像，以及上述细胞与不同DiD染色微泡孵育后的相对荧光强度。比例尺：50µm。E、 G）与不同RMP孵育后，M2Φ中CD206和CD86的代表性表达。F、 H）流式细胞术检测不同RMP孵育后M2Φ中CD206和CD86的相对荧光强度。使用unparied进行统计分析t吨‐测试(n个 = 3). 数据表示为平均值±SEM*第页 < 0.05, **第页<0.01***第页<0.001，ns：不显著。

确定P5091的加载P5091@零售价‐R4F可以增强RMP的M2Φ极化能力，我们使用CD206和CD86作为MΦ极化的代表性标记物来鉴定测试组的重编程能力。LPS阳性对照组、RMP‐R4F组和单药P5091组中CD206的表达水平分别是P5091@零售价‐R4F组（图3E、F). 此外，P5091@零售价‐R4F能有效促进M2Φ中CD86的表达，达到RMP-R4F组的1.5倍，P5091组的7倍，LPS组的3倍（图3G、H). 这些实验结果表明，R4F可以促进M2Φ、BV2小胶质细胞和LLC细胞对RMP的摄取。同时，与RMP‐R4F和P5091相比，负载在RMPs-R4F中的P5091并不影响其靶向功能，并且可以更有效地重新编程M2Φs。

2.3. 穿越模拟BBBP5091@零售价‐R4R体外和体内

阐明RMP‐R4F和RMP处的P5091‐R4R与BBB交叉，我们使用表达SR‐B1的bEnd.3内皮细胞构建了体外模拟BBB模型。[ 26 ]BEnd.3内皮细胞在Transwell插入物的上腔中培养，而M2Φ/小胶质细胞和LLC细胞同时在下腔中培养以吸收穿过模拟BBB的RMP‐R4F（图S7A系列，支持信息）。PKH67染色RMP、RMP‐R4F或P5091@零售价‐R4F在上部培养箱中培养。24小时后，分离下室细胞进行流式细胞术鉴定。M2Φ/小胶质细胞（BV2）和LLC细胞的荧光强度P5091@零售价‐R4F与用RMP孵育的细胞相似，比用RMP培养的细胞高3倍以上。因此，RMP‐R4F可以有效穿过BBB，P5091负载不会影响其穿过BBB的能力（图S7B–E型，支持信息）。为了确定RMP‐R4F是否通过经胞吞作用穿过BBB，我们用bEnd.3细胞孵育RMP或RMPs-R4F（均用DiO染料染色）6小时，并用溶酶体染料标记溶酶体。共焦成像结果（图S7F、G（支持信息）表明RMP和RMP‐R4F均存在于bEnd.3细胞的细胞质中，可能以完整的RMP形式存在。然而，它们没有与溶酶体共定位，因此证明了RMP在跨越BBB中的作用。此外，我们发现SR‐B1在小鼠BBB处的内皮细胞中也高表达，这意味着RMP‐R4F可以在体内进行跨胞作用（图第7小时，支持信息）。

为了表征RMP‐R4F体内BBB的交叉，我们首先在小鼠中构建了BRM模型。我们对RMP、RMP‐R4F和P5091@零售价‐R4F和DiD染料，然后在C57小鼠尾静脉注射。24小时后，取出小鼠的所有器官体外成像分析。结果表明：P5091@零售价‐R4F分布于所有器官，尤其在肝、脾、肺和脑中富集(图  4一个). 体外图像进一步证实RMP‐R4F和P5091@零售价‐与其他器官相比，R4F在大脑中的聚集效率更高（图4A级). 验证RMP‐R4F和P5091@零售价‐R4F靶向小鼠大脑M2Φ，穿过BBB后，使用F4/80和CD206抗体标记小鼠M2Φ/小胶质细胞。脑组织切片的免疫荧光分析表明，RMPs‐R4F或RMP处的P5091‐R4F可以与F4/80共同本地化+CD206型+M2Φ，证明RMP‐R4F可以有效地穿过BBB并靶向肿瘤浸润的M2Φ/小胶质细胞（图4B类).

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P5091@零售价‐R4F在体内穿过血脑屏障。A） 使用全身成像系统分析DiD染色RMP、RMP‐R4F或P5091@零售价‐24小时后不同器官中的R4F静脉注射.注入。B） 免疫荧光检测CD206阳性巨噬细胞，作为RMP、RMP‐R4F和P5091@零售价‐R4F注入尾静脉。通过共焦显微镜获得图像。红色‐DiD、黄色‐CD206、绿色‐F4/80、蓝色‐DAPI。比例尺：100µm。数据表示为平均值±SEM(n个 = 3). C） 区分不同免疫细胞类型的门控策略。D、 E）流式细胞术检测不同免疫细胞类型的荧光强度。使用单向方差分析和Tukey多重比较测试进行统计分析(n个 = 3). 数据表示为平均值±SEM*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001.

为了进一步量化脑内浸润免疫细胞的吞噬能力，我们用流式细胞术计算了脑内不同浸润免疫细胞荧光强度。选通策略如图所示3C公司与非M2细胞、M2Φ和中性粒细胞相比，我们发现F4/80+CD206型+M2Φ强度最强静脉注射注入RMP‐R4F和P5091@零售价‐R4F（图4D、E)，而RMP在不同的免疫细胞中没有显示出差异（图第8节，支持信息），从而证实了RMPs‐R4F和P5091@零售价‐R4F。

2.4。的治疗效果P5091@零售价‐BRM模型中的R4F

验证P5091@零售价‐R4F，我们使用LUC细胞构建BRM模型。由于不表达R4F的RMP不定位于中枢神经系统，我们没有使用RMP治疗小鼠。在第5、7、9和13天，RMP‐R4F，P5091@零售价‐通过尾静脉给予R4F(图  5一个)同时腹腔注射等量P5091作为对照组。治疗后第二天，通过腹腔注射荧光素酶底物观察小鼠脑内肺癌细胞的生长。与其他治疗方法相比P5091@零售价‐R4F组的BRM增长最慢（图第5页). 小鼠大脑中的发光强度P5091@零售价与其他组相比，R4F治疗组显著降低（图第9部分，支持信息）。为了进一步证实P5091@零售价‐R4F，我们用LLC细胞构建BRM。同样处理后，用TUNEL染色和HE染色观察肺癌在大脑中的生长。TUNEL染色显示P5091@零售价‐R4F可以促进肿瘤区域大多数肿瘤细胞的凋亡（图5摄氏度)HE染色显示P5091@零售价‐R4F在最大程度上延缓了脑内肺癌细胞的生长（图第五天). 总之，与P5091和RMP‐R4F单独相比，P5091@零售价‐R4F对BRM具有有效的治疗作用。

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的治疗效果RMP处的P5091‐R4F在肺癌脑转移模型中的作用。A） 模型建立时间和药物注射时间示意图。B） 全身图像显示了不同药物治疗后大脑中表达荧光素酶的LLC细胞的生长。C） TUNEL染色的代表性图像，观察指定治疗后肿瘤细胞的死亡。比例尺：100µm。D） HE染色的代表性图像，用于观察指定治疗后大脑中的肿瘤区域。比例尺：1 mm。

由于PD-1抗体治疗已显示出治疗肺转移的潜力，我们发现P5091治疗可以增强PD-L1的表达，[ 22 ]我们假设P5091@零售价‐R4F联合PD-1抗体治疗可获得更大疗效。为了研究P5091@零售价‐R4F联合PD‐1抗体治疗抑制BRM，我们对所示治疗后小鼠的存活率进行了统计分析(图  6一个). 值得注意的是，P5091@零售价‐R4F与PD‐1抗体联合使用可显著延长小鼠存活率P5091@零售价‐R4F和其他组（图6亿).

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不同治疗后肿瘤环境中的免疫细胞侵袭。A） 模型建立时间和药物注射时间示意图。B） 不同治疗组的生存率统计(n个=10只小鼠）。C） 免疫细胞流式细胞术的门控策略和指示治疗的代表性结果。D–F）CD8+CD3中的T细胞百分比+细胞，CD8+干扰素‐γ +CD8中的T细胞百分比+T细胞和M2Φ在F4/80中的百分比+来自指定治疗的巨噬细胞。数据表示为平均值±SEM(n个=6只小鼠）。G） 所示治疗的代表性免疫荧光图像。蓝色‐DAPI、红色‐F4/80、绿色‐CD206。比例尺：50µm。H） 来自指定治疗的代表性免疫荧光图像。蓝色‐DAPI、绿色‐CD8、黄色‐IFN‐γ.比例尺：50µm。使用对数秩Mantel–Cox检验对（B）进行统计分析，使用单向方差分析对（D，E，F）进行多重比较检验。数据表示为平均值±SEM*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页<0.001，ns：不显著。

2.5。联合治疗的机制P5091@零售价BRM中的R4F和PD‐1抗体

我们之前的实验表明P5091@零售价‐R4F可以重新编程M2Φ并穿过BBB，以专门针对M2Φ。基于此，我们推测P5091@零售价‐R4F结合PD-1抗体可逆转ITME并增强效应CD8的浸润+T细胞靶向BRM。为了验证这一假设，从不同治疗后的小鼠大脑中分离出免疫细胞，并用流式细胞术分析不同治疗组的免疫细胞浸润情况（图6摄氏度). 结果表明：P5091@零售价单独的R4F可以促进效应T细胞的浸润，其数量是对照组和RMP-R4F组的1.5倍，是P5091组的两倍（图第6天). 干扰素的比例γ阳性T细胞P5091@零售价‐R4F组明显高于其他治疗组（图第六版). 通过以下途径促进效应器T细胞浸润P5091@零售价‐通过免疫荧光分析进一步验证了R4F，如图所示6小时当与PD-1抗体结合时，效应T细胞的浸润更高，这表明P5091@零售价‐R4F可以促进PD-1抗体介导的免疫反应。此外，用P5091@零售价带有或不带有PD-1抗体的R4F约为PBS、PD-1抗体和P5091组的40-60%。给药小鼠的M2Φ比例没有显著差异P5091@零售价‐R4F与给药小鼠的比较RMP处的P5091R4F与PD-1抗体结合（图第6页). 然而，两组中的M2Φ比例均低于RMP‐R4F组，间接表明P5091@零售价‐R4F有一定的能力重新编程M2Φ（图第6页). 为了进一步确认P5091@零售价‐R4F可以重新编程M2Φ，我们对不同治疗组的BRM切片进行免疫荧光检测。CD206和F4/80染色显示，给药小鼠M2Φ浸润比例最低P5091@零售价‐R4F有或没有PD‐1抗体治疗（图6克). 上述实验结果证实了P5091@零售价‐R4F可以通过重新编程M2Φ来改善ITME，从而促进效应T细胞的浸润，发挥抗肿瘤免疫作用。此外，当与PD-1抗体结合时，P5091@零售价‐R4F对ITME进行重新编程的能力更强。

为了进一步探索P5091@零售价‐R4F在全身抗肿瘤免疫治疗中，我们测量了与抗肿瘤免疫相关的血清细胞因子水平，如图  7一个与其他组相比，RMP处的P5091带有或不带有PD‐1抗体的R4F表现出较高的IFN‐γ这与干扰素的高渗透性相一致γ表达CD8+T细胞和PD-1抗体增强了P5091@零售价‐IFN上的R4F‐γ分泌。此外，M2Φ的IL‐10分泌显著减少，T细胞趋化因子CXCL9/CXCL10显著增加P5091@零售价‐带有或不带有PD‐1抗体的R4F组。同时，CCL2、IL‐6和MIP‐1等促炎细胞因子的血清水平β也显著升高，表明术后全身抗肿瘤免疫反应增强P5091@零售价‐R4F处理。

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治疗后细胞因子检测及诱导巨噬细胞重编程的分子机制RMP处的P5091‐R4F。A） 流式细胞术测定指定治疗组血清中的细胞因子浓度(n个=6只小鼠）。B） 热图显示了在TAM中差异表达的M1和M2相关基因P5091@零售价‐R4F组和对照组基于RNA测序结果。C） KEGG分析根据两组差异表达基因确定17条最丰富的途径。D） 差异表达基因的火山图。红点显示显著上调的基因，绿点显示显著下调的基因。E） IL-4/13‐BMDM M2细胞中pJNK、pERK、p38和GAPDH的Western blottingP5091@零售价‐在指定时间点的R4F。使用单向方差分析和Tukey的多重比较检验（A）进行统计分析。数据表示为平均值±SEM*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页<0.001，ns：不显著。

2.6。的机制P5091@零售价‐重新编程TAM中的R4F

为了研究P5091@零售价‐R4F‐诱导BRM中M2Φ、TAM的体内重编程P5091@零售价通过流式细胞术对R4F和对照组进行分类，并通过随后的RNA测序（RNA-seq）分析其mRNA变化。如图的热图所示7亿图中的火山图第7天与M2Φ相关的抗炎细胞因子（IL-10）高度下调，而与M1巨噬细胞相关的促炎细胞因子（IL-1α/β)在年被上调P5091@零售价‐R4F处理的样品与对照组相比，这与图中的结果一致第7章这些数据进一步证实了P5091@零售价‐R4F可以对巨噬细胞进行重新编程，以释放更多的促炎细胞因子，并逆转大脑的ITME。为了进一步评估P5091加载在P5091@零售价‐关于TAM重编程的R4F，我们还使用了《京都基因和基因组百科全书》（KEGG）来确定TAM中丰富的典型信号通路。如图所示7摄氏度，M1相关的MAPK信号通路在P5091@零售价‐R4F治疗组与对照组相比，这与之前的研究一致。[ 22 ]图中的蛋白质印迹第七版证实MAPK途径蛋白（JNK、ERK和p38）的磷酸化水平在P5091@零售价‐R4F‐BMDM诱导的经处理M2Φ。共同地，P5091@零售价‐R4F保留其特异性抑制USP7激活的p38 MAPK通路的能力，导致TAM重编程。

三。 讨论

此前已有研究表明，放射治疗可以与含有PD-L1‐siRNA的RGD肽修饰的神经元源性小泡相结合，以在动物模型中治疗脑肿瘤。[ 27 ]然而，放射治疗有可能损害癌旁的正常脑组织。我们之前曾报道，肿瘤细胞产生的RMP可以表现出旁观者效应，主要通过铁下垂促进邻近肿瘤细胞的死亡，[ 15 ]而放射治疗肿瘤细胞产生的上清液也能有效逆转ITME。[ 28 ]据此，我们提出了间接放射治疗的概念，为无法接受传统放射治疗的患者，如晚期胸腔积液、腹水和多发性脑转移瘤患者提供了希望。

宿主正常细胞或肿瘤细胞产生的MP调节多种生理和病理生理过程，如组织修复和促进肿瘤组织增殖。[ 29 ]据报道，某些类型的肿瘤在放射治疗后产生的RMP可促进邻近未受辐射肿瘤细胞的侵袭特性，[ 30 ]但并非所有放射治疗后产生的RMP都会导致这种现象。Kang等人。发现当细胞接受放疗和化疗时，RAB22A蛋白可以灭活RAB7和其他蛋白，促进ER衍生的一种典型自噬体的形成，该自噬小体被活化的STING蛋白包裹并分泌外囊泡，从而促进抗肿瘤免疫。[ 31 ]我们之前的研究发现，来源于LLC细胞的放射治疗囊泡可以诱导肿瘤细胞脱铁，促进巨噬细胞重编程和中性粒细胞活化，但不会引起邻近肿瘤细胞的增殖。[ 15，32 ]因此，放射治疗产生的RMP可以用作靶向ITME的药物载体。

辐射肿瘤细胞产生的MP携带肿瘤抗原和免疫原蛋白，如热休克蛋白（HSP）家族蛋白，可通过免疫接种作为预防和治疗疫苗，治疗已确诊的肿瘤。[ 33，34 ]Baharom等人。据报道，含有佐剂和抗原的自形成纳米疫苗通过尾静脉注射比皮下注射更有效，因为静脉注射疫苗可以到达脾脏和淋巴结，激活更多的次级淋巴器官，并通过抗原特异性CD8促进肿瘤消退+T细胞和I型干扰素对时间的依赖性调节。[ 35 ]在本研究中静脉注射注射携带药物的放疗MP治疗肺癌BRM可以通过将肿瘤抗原携带到脾脏在一定程度上实现疫苗疗效（图4A级). 此外，经尾静脉注射的放射治疗囊泡也可直接作用于局部肿瘤杀死，或起到一石二鸟的作用。

相关研究报道，放射治疗可以刺激肿瘤细胞中PD-L1的表达，肿瘤细胞释放的大量RMP也含有该分子，这可能会抑制细胞毒性T细胞的杀伤作用。[ 36 ]因此，我们合并了静脉注射.注入P5091@零售价‐R4F带i.p公司通过屏蔽外周或淋巴结中的PD-L1/PD-1信号轴注射PD-1抗体，从而进一步促进RMP的抗肿瘤免疫。据报道，单独或与其他疗法联合使用PD-1抗体可以提高肺癌脑转移患者的生存率。[ 37 ]此外，PD-1抗体主要用于激活表达PD-1分子的细胞毒性T细胞，PD-1抗体可以部分结合表达PD-1的CD8+细胞浸润大脑前的T细胞。因此，PD‐1抗体在不渗透大脑的情况下对脑肿瘤起到一定的作用。Ye at al最近的研究也报告了PD-1抗体可以作用于肿瘤记忆TCF-1+PD‐1低的T细胞在肿瘤引流淋巴结中，促进这些细胞的增殖和肿瘤侵袭，而不是作用于肿瘤原位。[ 38 ]PD-1抗体与P5091@零售价‐R4F能有效增强BRM小鼠的抗肿瘤免疫效果，显著延长BRM小鼠存活时间P5091@零售价‐R4F为未来针对BRM患者的临床免疫治疗提供了一种潜在的新策略。

虽然USP7抑制剂与RMP联合使用可以在体外有效杀死肿瘤细胞，但该系统产生的RMP数量有限，无法到达CNS。因此，在本研究中，我们没有研究装载USP7抑制剂的囊泡系统对BRM的直接杀伤作用P5091@零售价‐R4F，我们发现M2Φ的重编程可以有效逆转BRM的ITME，从而抑制肿瘤的发展。本文的结果表明，RMP具有一定的重新编程M2Φ的能力，这一效果通过与USP7抑制结合而进一步巩固。综上所述，这些结果证明了RMP载体与USP7抑制剂相结合的优势。

为了解决穿越BBB的问题，除传统方法外，[ 39 ]最新报道的策略包括胆固醇修饰药物，[ 40 ]人血清白蛋白，[ 41 ]和单链DNA纳米管，[ 42 ]为脑内输送治疗药物提供了多种选择。在这里，我们选择用R4F肽作为靶向配体来修饰RMP。Ruhland等人。发现肿瘤细胞释放的MP可以以完整囊泡的形式内吞入迁移的DC，然后将MP转移到CD8α +引流淋巴结中的树突状细胞，证明MPs在某些细胞中可以以完整的形式经历跨核过程。[ 43 ]此外，据报道，SR‐B1是BBB经内吞作用向脑巨噬细胞转运LDL的一种策略，这需要内皮细胞自身表达的DOCK4蛋白的帮助。[ 44 ]因此，MP与SR‐B1配体R4F的结合可以促进MP穿过BBB的更强能力。此外，该方法还具有几个假定的优点：1）R4F肽可以同时靶向肿瘤细胞和高SR‐B1受体表达的M2Φ，从而一举两得。2） R4F肽可以靶向BBB内皮细胞上的SR‐B1受体，并通过经胞作用促进RMP在CNS中的积累（图第7页，支持信息）。3） 通过基因工程，可以在RMP表面显示大量R4F肽，以实现多价靶向作用。与其他BBB交叉策略相比，R4F的使用是一个简单的过程，具有良好的生物相容性，是促进临床翻译的理想方法。

尽管我们的结果表明，放疗产生的MP内容与正常情况和化疗相比具有优势，但仍需要其他方法来帮助生成RMP用于临床翻译。一种选择是使用细胞纳米穿孔，这是一种促进外部MP临床转化的手段，据报道，这种方法将小型MP的生产规模扩大了50倍以上。[ 45 ]我们将在未来的研究中考虑结合细胞纳米穿孔的策略，以提高RMP的产量。

总之，RMP处的P5091‐R4F可以有效穿越血脑屏障，靶向TAMs和LLC细胞，促进BRM部位肿瘤细胞的大规模死亡，有效改善ITME，增强巨噬细胞极化药物在BRM治疗中的应用。

4 实验部分

老鼠

C57BL/6雌性小鼠取自湖南斯莱克精达实验动物有限公司（中国湖南，实验动物质量证书编号430727210103000762）。CX3CR1系列GFP公司/+转基因小鼠购自Jackson实验室（菌株编号：005582）。所有小鼠均在特定的无病原体（SPF）屏障设施中繁殖和饲养。所有动物研究均获得湖北省动物保护和使用委员会的批准，并遵循华中科技大学动物实验伦理委员会的实验指南。

细胞

小鼠bEnd.3，LLC和BV2细胞来自中国类型培养收集中心（中国武汉）。在实验室中建立荧光素酶路易斯肿瘤细胞系、RFP‐LLC细胞和R4F‐GFP‐LL细胞。所有细胞系用25µg mL−1血浆霉素（InvivoGene，法国图卢兹）持续至少两周，根据MycoProbe支原体检测试剂盒（R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）的检测结果为支原体阴性。细胞生长在含有10%胎牛血清（FBS）（美国纽约州格兰德岛Gibco）和1%青霉素/链霉素溶液的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）中。ldlA7和ldlA（mSR-B1）细胞系是Monty Krieger博士（马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院）赠送的礼物。ldlA7细胞的细胞培养基为Ham’s F‐12培养基米L-谷氨酰胺，100 U mL−1青霉素-链霉素和5%FBS。对于ldlA（mSR-B1）细胞的培养，除了300µg mL−1还添加了基因抑素。

慢病毒构建与LLC细胞转染

支持信息中列出了R4F‐GFP‐GPI表达的DNA序列，主要包括信号肽（MRLTVGALLACAALGLA）、一个R4F肽、一个EGFP和一个GPI锚的序列。含嘌呤霉素抗性基因的慢病毒由上海吉凯生物科技有限公司构建，用于转染LLC细胞的病毒滴度为1×107.

人肺癌组织的免疫组织化学

组织微阵列由上海威碧生物科技有限公司（威碧生技有限公司，中国上海）构建。病理学家对来自测试和验证队列的患者样本进行石蜡包埋、切片和苏木精-伊红（HE）染色，以确认诊断。在显微镜下标记出最典型组织学特征的固定点。将每个供体块直径为1.0 mm的细胞核转移到受体块微阵列中，每个点阵列包含的点少于220个。从受体块上切下四微米厚的切片，并使用胶带转移系统将其转移到玻璃载玻片上，以实现UV交叉连接。

不同加工方式的微粒（MP）的制备

使用传统的BCA蛋白质定量分析来测量蛋白质浓度。制备顺铂（DDP）‐MP，6×106用40µmol L−1DDP（Sigma，美国）72小时。收集培养基，离心，并通过超滤进行处理。所得蛋白质浓度为0.26 mg mL−1准备RMP，6×106用6‐MV X射线单次照射20 Gy的mL LLC细胞（600 MU min−1、Trilogy System线性加速器、瓦里安医疗系统）。培养72小时后，收集培养基，离心并通过超滤进行处理，蛋白质浓度为1.12 mg mL−1.制备UV‐MP，6×106mL LLC细胞暴露于紫外线（UVB，300 Jm−2)照射20分钟。培养72小时后，收集上清液，离心，并通过超滤处理，蛋白质浓度为1.13 mg/mL−1.

LLC和LLC-R4F细胞的RT-PCR

根据制造商的协议，使用Trizol试剂提取LLC细胞的RNA。根据制造商的协议，使用来自Vazyme的HiScript III RT SuperMix进行qPCR（+gDNA擦拭器）的反转录。正向引物为CGCTAAGTTCTGGGACGGTG，反向引物为CTCGATGTTGGCGGATCT。

RMP、RMP‐R4F和P5091@零售价‐4英尺

总计5×106将细胞置于10 cm细胞培养皿中，用6‐MV X射线单次照射20 Gy（600 MU min）−1、Trilogy System线性加速器、瓦里安医疗系统）。然后，根据每个细胞系的需要，将培养基替换为20 mL完整培养基（DMEM或RPMI 1640，含或不含P5091（从Selleck购买））。72小时后，收集培养基并在1000克持续10分钟，然后14000 g持续2分钟，以去除肿瘤细胞和碎片。然后，在14000℃下离心上清液克在4°C下保持1小时，以隔离RMP、RMP‐R4F，或P5091@零售价‐R4F。颗粒（含有RMP、RMP‐R4F或P5091@零售价‐R4F）用无菌1×PBS洗涤两次，然后再悬浮在无菌1×PBS中用于动物实验，或再悬浮在完整培养基中用于细胞实验。

制冷剂管理计划、制冷剂管理计划-R4F和P5091@零售价‐4英尺

RMP、RMP‐R4F和P5091@零售价测量了R4F。清洗后，RMP、RMP‐R4F和P5091@零售价‐R4F在4°C下用放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液溶解30分钟，然后在12 000下离心30分钟克温度为4°C。将含有总蛋白的上清液转移到新的离心管中。根据制造商的方案，使用BCA蛋白质检测试剂盒（赛默飞世尔科学公司）对蛋白质进行定量。

透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）

P5091@零售价‐通过TEM观察到R4F。P5091@零售价悬浮液中的R4F用2%磷钨酸溶液染色5分钟，然后沉积在铜网上。通过TEM（HT7700‐SS/FEI Tecnai G20 TWIN）观察尺寸和形态。在扫描电镜之前，用戊二醛固定样品，并使用HT7700型扫描电子显微镜（日立高科技公司）在10 kV的加速电压下进行扫描电镜成像。

P5091加载分析P5091@零售价‐R4F体外高效液相色谱法

的超声波P5091@零售价‐离心后在甲醇溶液中进行R4F（14000克，10分钟）。然后，将上清液过滤（0.2µm过滤器）用于HPLC（LC‐2030C Plus，由日本岛津公司设计）。使用C18（250×4.6 mm，5µm粒径）HPLC填充柱作为色谱柱。流动相为CH三OH 0.5%TFA/H2O 0.5%TFA（1:1，v/v），流速为1.0 mL min−1检测波长为254nm。

细胞活力

为了测量细胞活力，将细胞置于96孔板中（每孔5000个细胞），并在治疗前生长24小时。然后用不同浓度的P5091@零售价‐R4F或其他化学试剂。培养24小时后，使用CCK‐8检测试剂盒（BS350B，Biosharp）评估细胞活力。

小鼠骨髓基质干细胞的生成和激活

小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）如前所述产生。[ 22 ]用20 ng mL培养BMDM−1IL‐4或20 ng mL−1IL‐13极化为IL‐4诱导的M2Φ。所有细胞因子均购自PeproTech（美国新泽西州洛基山）。

体外细胞摄取试验

确定P5091@零售价‐将R4F、M1Φ、M2Φ、LLC细胞或BV2细胞接种在玻璃底细胞培养皿（NEST，目录号801001；1×105并与DiD标记的RMP孵育3小时。随后，将这些细胞在PBS中清洗三次，然后用阴茎肽（10µ米)持续10分钟。然后，用PBS清洗细胞，并在4%多聚甲醛中固定30分钟，然后再次在PBS中清洗。细胞通过共焦激光扫描显微镜（LSM 710）成像。为了定量评估细胞摄取，将细胞接种在六孔细胞培养皿中并如上处理，然后在PBS中清洗三次，收集、固定并重新悬浮在PBS（150µ五十） 用于流式细胞术检测。

本机SDS‐PAGE验证RMP处的P5091R4F稳定性

操作与传统SDS‐PAGE相似，只是凝胶和电泳缓冲液不含SDS。P5091@零售价‐R4F与小鼠血清或胎牛血清孵育不同时间，然后添加一定量的甘油以方便取样。CFSE的荧光强度（5（6）‐CFDAN个使用超灵敏曝光仪器（BIO‐RAD、ChemiDoc MP成像系统）获得琥珀酰酯）和DIR，并使用图像J处理图像。

西方印迹法

用RIPA裂解缓冲液处理细胞或RMP，在8%SDS‐PAGE凝胶上进行蛋白质分离，然后进行膜转移（0.2µm PVDF膜，Millipore）和抗体培养。SR‐B1抗体（目录号：21277‐1‐AP）、TSG101抗体（目录编号：67381‐1−Ig）、CD9抗体（目录号码：20597‐1­AP，和磷‐p38 MAPK（Thr180/Tyr182）多克隆抗体（目录号：28796‐1‐AP）购自Proteintech。所有图像均使用ChemiDoc成像系统（Bio‐Rad）采集。

细胞因子检测

从眼眶静脉丛采集血液，在室温下凝血4h后采集血清进行细胞因子检测。使用带有VBotom板（从Biolegend购买）的LEGENDplex小鼠细胞因子释放综合征面板（13‐plex）进行细胞因子检测。

Transwell实验

将Transwell（直径3µm，Invitrogen，Eugene，OR，USA）插入物注入0.3%明胶（w/v）（Sigma‐Aldrich）24 h，然后转移5×10三bEnd.3电池（从美国弗吉尼亚州马纳萨斯市ATCC购买）。同时，在Transwell的下部插入物中培养M2 BMDM、BV2和LLC细胞。在插入物中培养3天后，RMP、RMP‐R4F或P5091@零售价‐将PKH26染色的R4F添加到上部插入物中，并在5%CO中培养2在37°C下24小时，然后通过流式细胞术定量评估下部插图中的细胞摄取。

动物模型实验及疗效评价

为了建立BRM模型，在所有手术前用1%戊巴比妥钠麻醉小鼠。将LLC‐荧光素酶（LUC）细胞（50万细胞悬浮在25µL PBS中）立体定向注射到右心室的纹状体。接种LLC‐LUC细胞四天后，通过生物发光成像观察每只小鼠，以确保成功且均匀地建立LLC脑转移。然后将小鼠随机分为四组，包括对照组、P5091组、RMP‐R4F组和P5091@零售价‐R4F，并给予相应的治疗。用静脉注射.每隔2天注射100µL液体四次，或通过腹腔注射P5091（相当于P5091@零售价‐R4F），每隔2天进行四次。为了评估LLC脑转移，在1%戊巴比妥钠麻醉下完成所有治疗的当天，使用Bruker体内MS FX PRO成像仪对每组6只小鼠进行成像。为了计算不同治疗组小鼠的存活率，在建立BRM模型后，在第5、7、9、13和15天给药，并给药PD-1抗体（BioXell，猫编号：BE0146‐100 mg，20 mg kg−1)分别于第8、11和14天腹腔注射。

荧光和生物发光成像

Lewis脑转移小鼠用1%戊巴比妥钠麻醉后，腹膜内注射萤火虫荧光素（150 mg/kg−1; 西格玛-奥尔德里奇；CAS:103404‐75‐7）。15分钟后，使用Bruker体内MS FX PRO成像仪对小鼠进行成像。用3分钟曝光时间拍摄发光图像，用30秒曝光时间拍摄X射线照片。想象RMP、RMP‐R4F或P5091@零售价使用DiD（从Beyotime购买）对R4F进行染色，使用540/20 nm激发滤光片和620/20 nm发射滤光片，曝光时间为15 s。

组织多色免疫荧光染色

使用OpalTM 7‐彩色手动IHC试剂盒（NEL811001KT，Perkinelmer）进行组织多色免疫荧光染色。肿瘤组织固定，石蜡包埋，切片机切片。定期对切片进行脱蜡和水合处理。Tris‐EDTA缓冲液用于抗原回收，3%H2O（运行）2用于淬灭内源性过氧化物酶，并将样品封闭在正常山羊血清中。然后将载玻片与Brilliant Violet 421抗小鼠CD206（MMR）抗体（Biolegend，cat#141717）和Alexa Fluor 488抗小鼠F4/80抗体（Bioregend，cat#123119）孵育过夜。接下来，在室温下用DAPI培养1小时。最后，使用PE-Vectra（Perkinelmer）进行组织免疫荧光分析。

肿瘤浸润免疫细胞的收集

如前所述，从BRM组织中获得肿瘤浸润免疫细胞。[ 24 ]

TAM排序和RNA测序

TAM是从用载体或RMP处的P5091‐流式细胞术检测R4F。用PBS将分选好的TAM洗涤两次，在1000℃下离心10分钟克上清液被丢弃。细胞颗粒在−80°C下快速冷冻。然后，将TAM送往北京新基因科技有限公司进行RNA测序。

组织病理学和TUNEL分析

为了进行CNS组织病理学评估和肿瘤细胞凋亡检测，用PBS经心灌注小鼠，然后用4%多聚甲醛进行灌注。每个组织样本的一部分用乙醇和二甲苯处理，并进行石蜡包埋。用卢克索坚牢蓝（LFB）对厚度为5µm的切片进行染色。每个组织样本的另一部分用TUNEL探针染色。使用尼康Ni-E显微镜（日本东京尼康）采集图像。

流式细胞术

为了进行细胞表面分析，用抗鼠僵尸NIR Fixable Viability Kit（423106）对细胞进行染色，并用CD45（103114）、CD11b（101205）、F4/80（123121）、CDM3（100212）、CD4（100408）和CD8a（100752）的抗体在4°C的推荐浓度下孵育30分钟。对于T细胞内IFN‐γ（505808）细胞因子染色，细胞被固定并在用福尔波12-肉豆蔻酸酯13-醋酸盐（PMA）（ab120297，Abcam，100 ng mL）刺激后渗透−1)，莫能新钠盐（ab120499，Abcam，1 ug mL−1)和离子霉素钙盐（5608212，PeproTech，100 ng mL−1)持续6小时。对于CD206（141706）染色，细胞也被固定并透化。所有流式细胞仪抗体均购自Biolegend（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。

统计分析

未配对的双尾学生t吨采用比较两组间差异的检验，同时使用Graphpad Prism 7软件通过对数秩Mantel-Cox检验评估生存率。使用单向方差分析（ANOVA）比较肿瘤体积增长的重复测量值。使用FlowJo.10分析流式细胞术数据。各组之间的显著差异如下所示*第页 < 0.05, **第页<0.01，以及***第页 < 0.001.

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据声明

根据之前使用至少三组小鼠的经验，预先确定了样本量，所有实验都至少重复两次以确认发现。使用双尾非配对数据进行统计分析t吨测试或单向方差分析，如下所述。小鼠被随机分配到治疗组，在可能的情况下，对治疗组进行盲法处理，直到进行统计分析。本研究的数据集中没有排除任何动物或潜在的异常值。在本研究中使用和分析的数据可根据合理要求从相应作者处获得。

支持信息

支持信息

致谢

L.L.、H.Z.和J.Z.为这项工作做出了同样的贡献。作者感谢实验室所有成员的善意和帮助。本研究得到了国家自然科学基金（No.82102900，82022040，82272851）、湖北省技术创新专项基金（No.2020BHB021）、湖北洪山实验室和中国博士后基金（2021M691161）的资助。作者感谢WNLO‐HUST的光学生物成像核心设施对数据采集的支持。

笔记

陆磊、子宏、周杰、黄杰、邓中、唐中、李磊、石霞、罗培忠、。，Lovell J.F.、Deng D.、Wan C.、Jin H.、。，重组肿瘤微环境并抑制MAPK通路治疗小鼠脑转移瘤.高级科学。2023中，10, 2206212. 10.1002/advs.202206212[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

参与者信息

邓德强，nc.ude.tsuh@gnaiqedgned公司.

赵婉，nc.ude.tsuh@cnaw.

金洪林，nc.ude.tsuh@nij.

数据可用性声明

根据合理要求，可从相应作者处获得支持本研究结果的数据。

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