Tomatidine-stimulated maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes for modeling mitochondrial dysfunction

doi:10.1038/s12276-022-00746-8

.2022年4月；54(4):493-502.

doi:10.1038/s12276-022-00746-8。 Epub 2022年4月4日。

番茄红素刺激人胚胎干细胞衍生心肌细胞成熟以模拟线粒体功能障碍

附属公司

¹韩国洋山釜山国立大学医学院生理学系。
²韩国釜山注射大学心血管和代谢疾病中心医学院生理和生物物理系。
^三韩国洋山釜山国立大学牙科学院口腔生理学系。
⁴安全药理学研究小组，韩国毒理学研究所，韩国大田，34114。
⁵约翰霍普金斯大学生物医学工程系，马里兰州巴尔的摩，21205，美国。
⁶韩国洋山釜山国立大学医学院生理学系。jhkimst@pusan.ac.kr。

PMID： 35379934
PMCID公司： PMC9076832型
内政部： 10.1038/s12276-022-00746-8

番茄红素刺激人胚胎干细胞衍生心肌细胞成熟以模拟线粒体功能障碍

叶素金（Ye Seul Kim）等人。实验-分子-药物. 2022年4月.

.2022年4月；54(4):493-502.

doi:10.1038/s12276-022-00746-8。 Epub 2022年4月4日。

附属公司

¹韩国洋山釜山国立大学医学院生理学系。
²韩国釜山注射大学心血管和代谢疾病中心医学院生理和生物物理系。
^三韩国洋山釜山国立大学牙科学院口腔生理学系。
⁴安全药理学研究小组，韩国毒理学研究所，韩国大田，34114。
⁵约翰霍普金斯大学生物医学工程系，马里兰州巴尔的摩，21205，美国。
⁶韩国洋山釜山国立大学医学院生理学系。jhkimst@pusan.ac.kr。

PMID： 35379934
PMCID公司： PMC9076832型
内政部： 10.1038/s12276-022-00746-8

摘要

据报道，人类胚胎干细胞衍生的心肌细胞（hESC-CMs）表现出未成熟的胚胎或胎儿心肌细胞样表型。为了促进hESC-CM的成熟，我们鉴定了一种天然甾体生物碱tomatidine，作为一种新的刺激hESC-CMs成熟的物质。在心肌细胞分化期间，用托马替丁处理人类胚胎干细胞可刺激几种心肌细胞特异性标记物的表达，并增加T小管的密度。此外，番茄红素处理增加了线粒体的数量和大小，并促进了线粒体板层嵴的形成。番茄红素处理刺激了人胚胎干细胞CM中的线粒体功能，包括线粒体膜电位、氧化磷酸化和ATP生成。与对照细胞相比，番茄红素处理的hESC-CM对阿霉素诱导的心脏毒性更敏感。总之，本研究表明，tomatidine通过加速线粒体的生物发生和成熟，促进干细胞向成年心肌细胞的分化，并且Tomatidin处理的成熟hESC-CMs可用于心脏毒性筛选和心脏病建模。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

**图1。托马替丁治疗对人类胚胎干细胞CM分化的刺激作用。**
一H9细胞CM分化期间托马替丁治疗的方案示意图。托马替丁治疗的时间以绿色表示。第20天，通过乳酸代谢选择96个hESC-CM 小时。b条tomatidine对α-SA表达的剂量依赖性影响。显示了α-SA和GAPDH的Western blot图像。c面板中α-SA表达的量化(一). α-SA的带强度归一化为GAPDH的带强度。d日托马替丁治疗对人胚胎干细胞CM分化的时间依赖性影响。在H9细胞的CM分化过程中，1 μM tomatidine，在指定时间用western blotting检测α-SA、cTnT、MLC2a、cTn I和GAPDH的蛋白水平。**e（电子）**托马替丁治疗对大鼠脑组织mRNA表达的影响*TNNI3公司*在第20天和第60天，在对照组CM和Toma-CM中。**（f）**托马替丁治疗对大鼠脑组织mRNA表达的影响*MYL2、MLY7、MYH6*、和*2007年5月*hESC-CM用载体或1 μM tomatidine，并在第60天测定基因的相对mRNA水平。数据显示为平均值 ± S.D.公司(n个 = 5). *第页 < 0.05;^‡第页 < 0.01;^#第页 < 0.001之间。

**图2。tomatidine治疗对人胚胎干细胞衍生心肌细胞形态的影响。**
一,b条托马替丁处理对人胚胎干细胞-细胞模型形态的影响。一第30天，控制CM和Toma-CM的亮场图像。比例尺 = 100 微米。b条对照CM和Toma-CM细胞面积的量化。c——**（f）**免疫细胞化学图像(c)以及周长测量值的量化(d日)，肌节长度(**e（电子）**)、和圆度(**（f）**)控制CM和Toma CM的(n个 = 77). 典型TEM图像(克)以及z盘长度测量的量化(小时)在控制CM和Toma-CM中。数据显示为平均值 ± 标准偏差(n个 = 33). *第页 < 0.05;^‡第页 < 0.01;^#第页 < 0.001之间。

**图3。tomatidine治疗对人类胚胎干细胞源性心肌细胞T小管形成的影响。**
一,b条免疫印迹图像(一)JPH2和BIN1表达的量化(b条)在hESC-CM中。c用Di-8-ANEPPS染料对对照CM和Toma-CMs中的T小管进行免疫荧光染色。d日面板中T形管密度的量化(c).e（电子）TEM图像显示了对照CM和Toma-CM中的T管状结构。数据显示为平均值 ± S.D.公司(n个 = 3–10). *第页 < 0.05;^‡第页 < 0.01;^#第页 < 0.001之间。

**图4。番茄红素治疗刺激人类胚胎干细胞衍生心肌细胞的代谢成熟。**
一在对照CM和Toma-CM中使用安捷伦海马XFp分析仪进行线粒体耗氧率分析的代表性数据(n个 = 3).b条从小组中量化基础呼吸、最大呼吸和剩余呼吸量(一).c使用CellTiter-Glo试剂盒测量控制CM和Toma-CM中的ATP水平(n个 = 30).d日对照CM和Toma-CM线粒体结构的TEM图像。比例尺 = 500 纳米。**e（电子）**对照CM和Toma-CMs中线粒体面积的量化。从面板上量化线粒体面积(d日) (n个 = 14–33).（f）托马替丁处理对人胚胎干细胞-细胞系中线粒体DNA与nDNA比值的影响。在第30天和第60天用qRT-PCR测量对照CM和Toma-CM中mtDNA和nDNA的数量，并计算mtDNA与nDNA的比值。(n个 = 3）。克用针对对照CM和Toma-CM中线粒体（OPA1、MIC60、TOM20）和细胞溶质（GAPDH）蛋白的抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。小时TMRM染料对线粒体膜电位活性的免疫荧光分析(n个 = 120).我代表性流式细胞仪图（左面板）和TMRM强度的量化(n个 = 3）（平均荧光强度，MFI，右图）。数据显示为平均值 ± S.D.公司*第页 < 0.05;^‡第页 < 0.01;^#第页 < 0.001之间。

**图5。托马汀处理的心肌细胞的电生理特性。**
一轴突-心脏LEAP分析期间动作电位持续时间变化的代表性痕迹。b条对照CM和Toma-CM中APD30、50和90的定量。c控制CM和Toma-CM的典型拍频轨迹。d日轴突心脏场电位分析期间场电位持续时间变化的代表性痕迹。节拍周期变化的量化(**e（电子）**)，尖峰振幅(**（f）**)，尖峰斜率(克)和传导速度(小时)在第60天控制CM和Toma-CM。数据显示为平均值 ± S.D.公司(n个 = 3).我向内修正K⁺控制CM和Toma-CM中的电流。通过施加500 ms测试脉冲介于−120和50之间 mV，保持电位为-40 mV（见插图）。巴人²⁺-全细胞膜电流的敏感成分。j个Ba的电流-电压关系²⁺-控制CM和Toma-CM中的敏感电流。代表性膜电流(我)和电流电压关系(j个)都是通过对七个不同细胞的结果进行平均得到的。数据显示为平均值 ± S.D.公司*第页 < 0.05;^‡第页 < 0.01;^#第页 < 0.001之间。

**图6。阿霉素对托马汀处理的心肌细胞的心脏毒性。**
一对照CM和Toma-CM单层中心脏电活动的代表性多电极阵列迹线。代表性节拍间隔(b条)，尖峰斜率(c)和尖峰振幅(d日)控制CM和Toma-CM的踪迹(n个 = 6，提出了独立的生物复制）。**e（电子）**来自对照CM和Toma-CM的激活图和示例电信号显示了场电位在含有/不含阿霉素的细胞单层中扩散的方向。**（f）**细胞活力测定检测到阿霉素诱导线粒体功能障碍12天后ATP水平下降小时(n个 = 3–10). 数据显示为平均值 ± S.D.公司*第页 < 0.05;^‡第页 < 0.01;^#第页 < 0.001之间。

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