番茄红素刺激人胚胎干细胞衍生心肌细胞成熟以模拟线粒体功能障碍

摘要

心肌：促进干细胞成熟产生更好的模型

介绍

心脏毒性是药物停药的主要原因之一，心脏毒性测试对于药物开发期间的早期毒性筛选至关重要¹传统上，心脏毒性分析要么在过度表达特定离子通道的非心脏细胞中进行，要么在体内动物模型中进行。然而，这些筛选方法的使用受到了阻碍，因为它们无法预测心脏毒性，这主要是由于物种差异和这些系统中缺乏心肌细胞（CM）特异性信号成分所致²缺乏人CM细胞系或难以制备原代人CM也是药物开发和心脏毒性分析的主要障碍。

人类多能干细胞，如胚胎干细胞和诱导的多能干电池，已被用于生产功能性CM，这是疾病建模、药物筛选和心脏毒性测试的良好模型^三暂时应用糖原合成酶激酶3抑制剂和Wnt抑制剂足以产生功能性CM⁴虽然人类多能干细胞衍生CMs（hPSC-CMs）具有与成人CMs相似的结构和功能特性，但据报道，与成人CMs相比，它们表现出不成熟的表型⁵hPSC-CM呈现出较不规则的肉质结构；最大收缩力较低，上冲程速度较慢，静息膜电位较高；不含T型管；线粒体含量和功能降低^6，7这些因素强调了使用成熟的hPSC-CM进行心血管疾病建模和心脏毒性分析的必要性。越来越多的证据表明，包括阿霉素（Dox）、曲妥珠单抗和舒尼替尼在内的几种化疗药物表现出主要与线粒体损伤有关的心脏毒性⁸例如，Dox特异性结合心磷脂，心磷脂通过形成基于心磷脂的脂质蛋白微结构域在线粒体嵴组织中发挥关键作用⁹导致Dox的选择性线粒体积累^10，11线粒体活性氧（ROS）生成增加导致细胞死亡¹²此外，相对成熟的CM比不成熟的CM能更好地模拟Dox诱导的心脏毒性¹³支持成熟CM在心脏毒性研究中的功效。

番茄红素是α-番茄红素的代谢产物，在未成熟的绿色番茄中含量丰富，具有多种活性，包括抗生素、抗炎症和抗癌作用^14，15，在单元格中。番茄红素是一种抑制骨骼肌萎缩的天然化合物通过一种基于系统的发现策略¹⁶在培养的骨骼肌管中，tomatidine治疗刺激了mTORC1信号传导和合成代谢，导致蛋白质和线粒体的积累以及细胞生长。此外，研究发现，托马替丁通过抑制激活转录因子4（ATF4）来减少与年龄相关的骨骼肌无力和萎缩¹⁷，一种bZIP转录因子亚单位，调节氧化和其他应激反应¹⁸此外，据报道，番茄红素治疗可诱导线粒体自噬，并通过SKN-1/Nrf2信号系统对秀丽隐杆线虫¹⁹然而，tomatidine对CM分化、PSC成熟和线粒体功能的影响尚未研究。

在本研究中，我们研究了托马替丁对人类胚胎干细胞（hESCs）CM分化和成熟的影响。此外，我们研究了tomatidine治疗对人胚胎干细胞衍生心肌细胞（hESC-CMs）线粒体表型和功能的影响。本研究首次证明，tomatidine治疗可诱导hESC-CM分化为线粒体质量和功能增加的成熟CMs，这为心脏毒性研究提供了一个非常有用的平台。

材料和方法

RPMI1640（#LM011-01）和D-PBS（#LM-001-01）购自Welgene（韩国庆山岛庆山寺）。mTeSR1（#85850）购自STEMCELL Technologies（加拿大温哥华）。DMEM/F12（#11330-032），B27减去胰岛素（#A18956-01），B27#（#17504-044），无核酸水（#AM9938），无葡萄糖DMEM（#11966-025），0.05%胰蛋白酶-EDTA（#25300-054），0.5 M EDTA（#15575-020）、Accutase（#A11105-01）、dispase（#17105-041）、胎牛血清（#16000-044）、MitoSOX红线粒体超氧化物指示剂(#{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“M36008”，“term_id”：“214108”，”term_text“：”M36008“}}M36008型)、电位敏感性ANEP染料（Di-8-ANEPPS；#D3167）、四甲基罗丹明（TMRM；#T668）和SERCA2 ATP酶（#MA3919）购自Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。Matrigel（#354277）购自康宁（美国纽约州纽约市）。Y27632（#Y0503）、Hank的平衡盐溶液（#4891）、tomatidine（#T2909）、α-肌动蛋白（α-SA；#A7732）、明胶（#G9391）、BSA（#A7946）和二甲基亚砜（DMSO；#D5879）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。L-乳酸（#129-02666）购自日本大阪富士胶片和纯化学公司。GAPDH（#SC-47724）购自Santa Cruz Biotechnology（美国德克萨斯州达拉斯）。心脏肌钙蛋白T（cTnT；#ab45932）、心肌肌钙蛋白I（cTn I；#ab47003）、BIN1（#ab185950）、OPA1（#ab42364）和mic60（#ab110329）购自Abcam PLC（英国剑桥）。MitoTracker Green FM（#9074）购自Cell Signaling Technology，Inc.（美国马萨诸塞州丹弗斯）。肌球蛋白轻链2a（MLC2a；#311 011）购自Synaptic Systems（德国戈廷根）。肌球蛋白轻链2v（MLC2v；#10906-1-AP）购自Proteintech Group，Inc.（美国伊利诺伊州罗斯蒙特）。Junctophilin-2（JPH2；#orb13188）购自Biorbyt，Ltd.（英国剑桥）。CHIR99021（#CT-99021）购自Selleck Chemicals（美国德克萨斯州休斯顿）。IWP2（#3533）购自Tocris Bioscience（英国布里斯托尔）。SR 28292购自Cayman Chemical（#22084）。PGC1-alpha（#NBP1-04676）抗体购自Novus Biological（Centennial，CO，USA）。Tom20（#sc17764）购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.（美国德克萨斯州达拉斯）。熊果酸购自东京化学工业株式会社（TCI，Tokyo，Japan）。补充表中列出了本研究中使用的抗体的相关信息1.

结果

番茄红素处理促进人胚胎干细胞-基质的结构成熟

为了诱导人胚胎干细胞的CM分化，我们采用了一种先前报道的分化方案，该方案基于使用CHIR99021通过GSK3抑制对Wnt通路的顺序激活，然后使用IWP2进行Wnt抑制⁴为了研究托马蒂丁治疗对CM分化的影响，我们在IWP2治疗后用托马蒂定治疗hESCs，但在乳酸代谢选择期间除外（图。​（图1a）。1a个). 我们用增加浓度的托马替丁处理细胞，并在第20天用western blotting分析心肌细胞特异性蛋白α-肌动蛋白（α-SA）的表达。用0.5处理 μM托马替丁显著增加α-SA的表达，在1 μM（图。1b和c). 因此，1 随后的实验中使用了μM托马替丁。hESC-CM与tomatidine的长时间孵育加速了心脏结构蛋白的自发增加，包括心肌肌钙蛋白T（cTnT）和肌球蛋白轻链2亚型（MLC2a）（图。​（图1d）。1天). 尤其是，与对照组hESC-CM（对照CM）相比，在使用tomatidine处理的60天培养中，cTnI的表达显著增加，这是成熟亚型的关键特征（图。​（图1d）。1天). 流式细胞术显示，在托马替丁治疗后的CMs乳酸选择性培养物中，CM标记物的表达情况相似，但在托马替丁治疗2周后，CM标记的表达增加（补充图。1). 接下来，我们测定了其他CM标记的mRNA水平，包括cTnI(TNNI3公司)，肌球蛋白轻链2(MYL2（马来西亚林吉特）或MLC2v型)，肌球蛋白轻链7(2007车型年款或MLC2a公司)，心房异构肌球蛋白重链6(MYH6年或α-MHC)和心室肌凝蛋白重链7亚型(2007年5月或β-MHC)托马替丁治疗后。TNNI3、MYL2和MYH7的表达随着托马替丁治疗的增加而增加（图。1e、f、和补充表2). 此外，托马替丁治疗增加了聚酯2/聚酯7和MYH7/MYH6在hESC-CM中（图。​（图1f）。第1页). 这些结果表明，tomatidine处理提高了hESC-CMs的分化效率和结构成熟度。

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图1

托马替丁治疗对人类胚胎干细胞CM分化的刺激作用。

一H9细胞CM分化期间托马替丁治疗的方案示意图。托马替丁治疗的时间以绿色表示。第20天，通过乳酸代谢选择96个hESC-CM 小时。b条tomatidine对α-SA表达的剂量依赖性影响。显示了α-SA和GAPDH的Western blot图像。c（c）小组中α-SA表达的量化(一). α-SA的带强度归一化为GAPDH的带强度。d日tomatidine治疗对人胚胎干细胞CM分化的时间依赖性影响。在H9细胞的CM分化过程中，1 μM tomatidine，在指定时间用western blotting检测α-SA、cTnT、MLC2a、cTn I和GAPDH的蛋白水平。e（电子）托马替丁治疗对大鼠脑组织mRNA表达的影响TNNI3公司在第20天和第60天，在对照组CM和Toma-CM中。（f）托马替丁治疗对大鼠脑组织mRNA表达的影响MYL2、MLY7、MYH6、和2007年5月hESC-CM用载体或1 μM tomatidine，并在第60天测定基因的相对mRNA水平。数据显示为平均值 ± S.D.公司(n个 = 5). *第页 < 0.05；^‡第页 < 0.01;^#第页 < 0.001.

番茄红素治疗增强心肌肥大和肉质结构的组织

CMs从胎儿到成人表型成熟过程中发生的形态学变化包括细胞大小显著增加和细胞形状从圆形变为杆状²⁰为了探讨托马替丁处理对形态学变化的影响，我们在进一步的实验中分析了人胚胎干细胞培养60天。亮场图像分析显示，托马替丁治疗显著增加了个体CM大小（图。2a和b). 与对照组相比，Toma-CMs在整个细胞中都显示出高度组织化的肉质结构，α-SA和cTnT的表达证实了这一点（图。​（图2c）。2厘米). 此外，Toma-CMs的细胞周长和肌节长度增加，圆形指数减少，重现了成熟CM的特征（图。2d–f). 对照CM和Toma-CMs的肌节长度约为1.5 ± 0.3和1.9 ± 0.2 μm。电子显微镜显示，Toma-CM表现出成熟的超微结构特征，具有更好排列的肌原纤维，能够产生强大的力，并且通过tomatidine治疗，Z盘的长度显著增加（图。2g和h). 这些结果表明，tomatidine刺激生理肥大和肌节成熟。

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图2

tomatidine治疗对人胚胎干细胞衍生心肌细胞形态的影响。

一，b条托马替丁处理对人胚胎干细胞-细胞模型形态的影响。一第30天，控制CM和Toma-CM的亮场图像。比例尺 = 100 μm。b条对照CM和Toma-CM细胞面积的量化。c（c）–（f）免疫细胞化学图像(c（c）)以及周长测量值的量化(d日)，肌节长度(e（电子）)、和圆度(（f）)控制CM和Toma-CM(n个 = 77). 典型TEM图像(克)以及z盘长度测量的量化(小时)在控制CM和Toma-CM中。数据显示为平均值 ± S.D.公司(n个 = 33). *第页 < 0.05;^‡第页 < 0.01;^#第页 < 0.001.

番茄红素促进hESC-CMs中T小管的形成

横小管（T小管）是CM膜的一部分，它携带电脉冲。在CM成熟过程中，T小管的发育对于建立兴奋-压缩耦合至关重要²¹为了检测番茄红素治疗是否能改善T小管的发育，我们分析了桥接整合因子1（BIN1）的表达^22，23和亲连接蛋白-2（JPH2），T小管生物发生和随后二元体形成的关键蛋白²⁴，第60天在hESC-CM中。Western blot分析证实，Toma-CMs中JPH2和BIN1的表达高于对照CM（图。3a和b). 用Di-8-ANEPPS（一种电压敏感的质膜脂质染料）对hESC-CMs进行染色，结果表明，与对照CM相比，Toma-CMs显示出高度组织化和周期性的Di-8-ANEPPS染色模式，间隔规则（图。​（图3c），3立方厘米)进一步表明T小管密度增加（图。​（图3d）。三维). 图​图3e第三版显示了hESC-CM中T小管的透射电子显微镜（TEM）图像，Toma-CM显示出比对照CM更发达的T小管结构。总的来说，这些结果表明，番茄红素治疗促进了hESC CMs的T小管发育。

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图3

tomatidine治疗对人类胚胎干细胞源性心肌细胞T小管形成的影响。

一，b条免疫印迹图像(一)JPH2和BIN1表达的量化(b条)在hESC-CM中。c（c）用Di-8-ANEPPS染料对对照CM和Toma-CMs中的T小管进行免疫荧光染色。d日面板中T形管密度的量化(c（c）).e（电子）TEM图像显示了对照CM和Toma-CM中的T管状结构。数据显示为平均值 ± S.D.公司(n个 = 3–10). *第页 < 0.05;^‡第页 < 0.01;^#第页 < 0.001.

番茄红素处理增加了人胚胎干细胞培养基中线粒体的生物生成和代谢

最近的研究表明线粒体代谢在CM成熟中起着关键作用²⁵尤其是，线粒体最大摄氧量被用作心肌细胞线粒体成熟的指标²⁶为了验证这一假设，我们进行了Mito应激试验，以确定tomatidine治疗对hESC-CM能量代谢的影响（图。​（图4a）。4a类). 与对照组相比，Toma-CMs的基础呼吸量没有显著变化。然而，最大呼吸量和备用呼吸量（收缩和放松期间可摄入的最大氧气值）显著增加（图。​（图4b）。4b个). 此外，与对照CM相比，Toma-CM中的ATP生成量显著增加（图。​（图4c）。4c类). 为了确定线粒体的数量和结构是否受到tomatidine治疗的影响，我们使用透射电子显微镜分析了人胚胎干细胞癌中的线粒体。在Toma-CMs中，线粒体具有清晰的嵴边缘和较厚的线粒体膜。总的来说，与对照组相比，Toma-CMs中线粒体的长度和大小更长更大（图。4d和e). 与对照CM相比，番茄CM中线粒体DNA与基因组DNA的比率显著增加（图。​（图4f，第4页，补充表三). 此外，与对照CM相比，Toma-CM中的线粒体蛋白质水平（包括OPA1、MIC60和Tom20）增加（图。​（图4g）。4克). 有趣的是，与位于线粒体外膜的TOM复合物亚单位TOM20相比，线粒体内膜复合物蛋白MIC60的表达在tomatidine治疗后显著增加。这一结果与tomatidine诱导线粒体嵴结构发育的结果一致。线粒体膜电位在线粒体ATP合成酶复合体中起着形成ATP的作用。我们进行了TMRM染色，以确定托马替丁治疗是否也会影响人胚胎干细胞CM的线粒体膜电位。与对照组相比，Toma-CMs中TMRM染料的强度显著增强，如免疫染色和流式细胞术所示（图。4h和i)这表明tomatidine诱导的hESC-CMs线粒体膜电位升高。此外，与对照CM相比，Toma-CMs中线粒体ROS的生成显著增强（补充图。2). 这些结果表明，tomatidine处理增强了人胚胎干细胞系细胞线粒体的含量和功能。

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图4

Tomatidine治疗刺激人类胚胎干细胞来源的心肌细胞的代谢成熟。

一在对照CM和Toma-CM中使用安捷伦海马XFp分析仪进行线粒体耗氧率分析的代表性数据(n个 = 3).b条从小组中量化基础呼吸、最大呼吸和剩余呼吸量(一).c（c）使用CellTiter-Glo试剂盒测量控制CM和Toma-CM中的ATP水平(n个 = 30).d日对照CM和Toma-CM线粒体结构的TEM图像。比例尺 = 500 纳米。e（电子）对照CM和Toma-CMs中线粒体面积的量化。从面板上量化线粒体面积(d日) (n个 = 14–33).（f）托马替丁处理对人胚胎干细胞-细胞系中线粒体DNA与nDNA比值的影响。在第30天和第60天用qRT-PCR测量对照CM和Toma-CM中mtDNA和nDNA的数量，并计算mtDNA与nDNA的比值。(n个 = 3).克用针对对照CM和Toma-CM中线粒体（OPA1、MIC60、TOM20）和细胞溶质（GAPDH）蛋白的抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。小时TMRM染料对线粒体膜电位活性的免疫荧光分析(n个 = 120).我代表性流式细胞仪图（左面板）和TMRM强度的量化(n个 = 3） （平均荧光强度，MFI，右侧面板）。数据显示为平均值 ± S.D.公司*第页 < 0.05;^‡第页 < 0.01;^#第页 < 0.001.

番茄红素诱导hESC-CM电生理特性成熟

为了证实托马替丁治疗对hESC-CM成熟的刺激作用，我们使用微电极阵列测量了电生理特性。与对照组相比，Toma-CMs表现出类似成熟心脏动作电位的局部细胞外动作电位（LEAP）信号（图。​（图5a）。5a级). Toma-CM的动作电位持续时间（APD30、APD50和APD90）比对照CM长（图。​（图5b）。第5页). 与对照组相比，Toma-CMs的自发搏动频率降低，峰电位增加（图。​（图5c）。5厘米). 一致地，Toma-CM的场电位轨迹显示出更长的自发搏动周期，增加了峰振幅和传导速度，降低了峰斜率平均值（图。5天–小时). 钙处理在调节慢性粒细胞收缩和舒张中起着关键作用²⁷Toma-CM的峰值振幅、Vmax衰减和Ca衰减时间增加²⁺尖峰（补充图。三). 心脏离子通道的mRNA水平与成熟CMs动作电位和钙内流的产生有关，如SCN5A型，CACNA1C公司，KCNJ2公司、和KCNJ12号机组，在用番茄定处理的hESC CM中增加（补充图。4). 内向整流K⁺通道Kir2.1(KCNJ2公司)和Kir2.2(KCNJ12号机组)主要维持成人静息膜电位²⁸.探讨托马替丁治疗是否影响内向整流钾⁺我们测量了hESC-CM中的全细胞膜电流和Ba²⁺-使用补丁灯分析的敏感电流和观察到的较高Ba²⁺-灵敏内向整流K⁺-Toma-CM中的电流比控制CM中的电流（图。​（图5i，5英寸，补充图。5). 电压-电流关系显示出明显更大的内向调节钾⁺-电流，I_千1，在Toma-CM中比在控制CM中（图。​（图5j）。5焦耳). 这些结果表明，tomatidine可诱导成人CMs中hESC-CMs电生理特征的成熟。

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图5

托马汀处理的心肌细胞的电生理特性。

一轴突-心脏LEAP分析期间动作电位持续时间变化的代表性痕迹。b条对照CM和Toma-CM中APD30、50和90的定量。c（c）控制CM和Toma-CM的典型拍频轨迹。d日轴突心脏场电位分析期间场电位持续时间变化的代表性痕迹。节拍周期变化的量化(e（电子）)，尖峰振幅(（f）)，尖峰斜率(克)和传导速度(小时)在第60天控制CM和Toma-CM。数据显示为平均值 ± S.D.公司(n个 = 3).我向内修正K⁺控制CM和Toma-CM中的电流。通过施加500 ms测试脉冲介于−120和50之间 mV，保持电位为-40 mV（见插图）。英国广播公司²⁺-全细胞膜电流的敏感成分。j个Ba的电流-电压关系²⁺-控制CM和Toma-CM中的敏感电流。代表性膜电流(我)和电流电压关系(j个)都是通过对七个不同细胞的结果进行平均得到的。数据显示为平均值 ± S.D.公司*第页 < 0.05;^‡第页 < 0.01;^#第页 < 0.001.

Toma-CM对Dox诱导的心脏毒性表现出更高的敏感性

多克斯是一种著名的抗癌药物^29，30然而，据报道，高达11%的患者会出现急性心脏毒性^31–34为了评估Toma-CMs在心脏毒性测试中的疗效，我们使用多电极阵列分析测量了Dox治疗对Toma-CM和对照CM的电生理特性的影响（图。​（图6a）。第6页). Toma-CM开始出现心跳周期缩短，这与心律失常现象相对应，12 Dox治疗后h。Toma-CMs的Dox诱发心律失常发生早于对照CM（图。​（图6b）。6b条). 此外，与对照组相比，Toma-CM表现出增加的峰值斜率和降低的峰值振幅，以响应Dox治疗（图。6c和d). 用于hESCs光学标测的电子地图记录了窦性心律期间的激活扩散（图。​（图6e）。第六版). 该图标记了两组患者对Dox治疗的相不连续性。我们发现，与对照CM相比，Toma-CMs对Dox诱导的细胞死亡表现出更高的敏感性（图。​（图6f），第6页)，表明Toma-CMs对Dox诱导的心脏毒性分析的有效性。

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图6

阿霉素对托马汀处理的心肌细胞的心脏毒性。

一对照CM和Toma-CM单层中心脏电活动的代表性多电极阵列迹线。代表性节拍间隔(b条)，尖峰斜率(c（c）)和尖峰振幅(d日)控制CM和Toma-CM的踪迹(n个 = 6，提出了独立的生物复制）。e（电子）来自对照CM和Toma-CM的激活图和示例电信号显示了场电位在含有/不含阿霉素的细胞单层中扩散的方向。（f）细胞活力测定检测到阿霉素诱导线粒体功能障碍12天后ATP水平下降 小时(n个 = 3–10）。数据显示为平均值 ± S.D.公司*第页 < 0.05;^‡第页 < 0.01;^#第页 < 0.001.

接下来，我们测量了Dox处理对线粒体膜电位和ROS的影响，分别通过TMRM和MitoSOX染色进行检测。虽然Dox处理略微增加了对照CM的线粒体膜电位和ROS生成，但Toma-CMs的线粒体膜电势和ROS水平显著增加（补充图。6). 综上所述，这些结果表明线粒体膜电位和ROS的增加可能与Toma-CMs对Dox诱导的心脏毒性的敏感性有关。

讨论

在本研究中，我们证明了托马替丁刺激人胚胎干细胞分化为成熟的类CM-表型。此前，托马替丁通过SKN-1/Nrf2途径被证明可以通过有丝分裂来延长寿命秀丽线虫¹⁹此外，据报道，托马替丁通过激活mTORC1通路和降低ATF4活性来抑制骨骼肌萎缩^16，17.mTORC1激活用于构建肌肉的蛋白质的翻译，并在出生后早期CMs的肥大生长中发挥重要作用³⁵此外，熊果酸，一种天然三萜，已被证明可以减少肌肉萎缩³⁶通过激活骨骼肌中的AMPK和PGC-1通路增加线粒体质量和ATP生成³⁷我们发现，托马替丁和熊果酸均刺激α-SA表达、线粒体膜电位和ROS（补充图。7). 此外，用PGC1α受体阻滞剂SR18292治疗可消除托马汀诱导的人胚胎干细胞癌中CM-特异性标记物cTnT和MLC2v的表达（补充图。8). 这些结果表明，天然化合物tomatidine和熊果酸通过刺激肌肉肥大和线粒体生物生成来加速CM成熟通过PGC1α依赖机制。

番茄碱处理增加了CM-特异性收缩蛋白（如cTnT和MLC2a）的表达水平。此外，成熟CM标记物的表达水平，包括cTnI、MYL7、MYH6和T小管成分，通过托马替丁治疗而增强。Toma-CMs的细胞大小、肌节长度和T小管密度增加。长期培养和生物物理刺激（包括底物硬度、细胞模式和电刺激）可以刺激分化的CMs的成熟²⁰此外，据报道，多种细胞外刺激，如三碘甲状腺原氨酸（T3）、地塞米松、胰岛素样生长因子-1和小RNA，包括let-7，可促进分化型CM的成熟^38–41此外，CMs与非心肌细胞共培养可促进CMs体外成熟^42，43以及在脂肪酸作为能量来源的情况下培养分化的CMs可以促进CMs的成熟⁴⁴我们发现，托马提丁治疗能像脂肪酸治疗一样有效地增加cTnI和cTnT的表达，而三碘甲状腺原氨酸的作用不如托马提定（补充图。9). 此外，地塞米松和脂肪酸增加了连接蛋白43的表达，而不是tomatidine。与hESC CM相比，成熟CM表现出结构变化以及尺寸和长度的增加，尽管它们仍然比成年CM小⁴⁵据报道，未成熟hESC-CM的肌节为1.6 长度为μm，而成熟CMs的长度为2~2.3 微米。用T3、地塞米松和胰岛素样生长因子1处理的工程心脏组织显示成熟的肌节Z线宽度、排列和肌节长度增加，尽管M线不可见⁴⁶此外，通过机电训练培养的工程化心脏组织在生理肌节长度方面表现出成熟的CM-like表型（2.2 μm）和m线⁴⁷在本研究中，我们证明托马替丁治疗使肌节长度从1.5增加到1.9 尽管Toma-CMs中的肌节长度仍短于先前报道的工程化心脏组织中的肌节球长度，但hESC-CMs的μm支持tomatidine刺激的hESC-CM成熟。这些结果表明，与成年CM相比，Toma-CM尚不成熟。为了进一步增强hESC-CM的成熟，采用机电刺激，与其他成熟刺激剂（如T3和地塞米松）共同处理，用脂肪酸进行代谢成熟，除了用托马替丁治疗外，可能还需要将hESC-CM与内皮细胞和心脏成纤维细胞共培养，以提高hESC-CMs的成熟度。

在成年CM中，静息膜电位维持在约85 mV通过内向整流电流I_千1⁴⁸由基因编码的内向激活钾通道Kir2.1和Kir2.2发挥作用KCNJ2公司和KCNJ12号机组分别是。我_千1稳定静息膜电位，并在形成动作电位的初始去极化和最终复极中起作用⁴⁹我们发现，托马替丁治疗增加了内向整流电流I_千1和mRNA水平KCNJ2公司和KCNJ12号机组在hESC-CM中。此外，托马替丁治疗增加了人胚胎干细胞癌的APD。据报道，成熟CMs的传导速度为60 cm/s，而未成熟CMs的cm/s为10–20 厘米/秒⁵⁰番茄红素处理使传导速度从约20增加到约30 cm/s，显著增加了场电位的峰幅和节拍周期。此外，托马替丁治疗可增强钙²⁺hESC-CM中的瞬态，并降低了钙瞬态的频率，如Vmax衰减和衰减时间的增加所证明的。这些结果支持托马汀诱导的hESC-CM电生理表型成熟。

线粒体的形态和功能是CM成熟的关键因素。成熟心肌细胞的线粒体显示出组织致密的嵴，内含电子传递链和ATP合成酶⁵¹T3治疗增加最大耗氧量，促进肌肉对胰岛素的适当反应，并通过增加线粒体生物生成刺激氧化途径⁵²在本研究中，我们证明，随着线粒体数量和大小的增加，tomatidine治疗增加了hESC-CM的呼吸能力、ATP生成和线粒体膜电位。此外，线粒体蛋白的表达水平，如OPA1和MIC60，并且在Toma CMs中mtDNA/nDNA的比率增加。对照CM的线粒体表现出小而圆的形态，而番茄CM的线粒体具有长而密的组织嵴结构，类似于心脏线粒体表型。从未成熟CMs到成熟CMs的代谢转变是由几个转录因子的激活驱动的，包括PPARGC1A/B公司，PPARA公司，尼泊尔卢比1/2、和ESRRA/B/G公司⁵³。PPAR和ERR都直接执行由PPARGC1A公司和PPARGC1B公司是氧化呼吸和线粒体生物生成的主要调节器⁵³此外，T3、地塞米松和熊果酸已被证明通过激活PGC1α诱导线粒体生物发生^37，54，55，在高耗能组织中起着关键作用，包括肌肉、心脏和肝脏⁵⁶因此，番茄红素刺激的PGC1α通路可能促进线粒体生物发生，线粒体生物发生在心脏分化中起着关键作用。

hESC-CM在心肌修复细胞移植、药物开发期间的心脏毒性测试和患者特异性疾病建模中非常有用。据报道，多西他滨会引起心脏毒性，导致部分患者出现心力衰竭。Dox导致细胞死亡、线粒体功能障碍、活性氧和细胞内钙浓度增加⁵⁷先前的一项研究报告称，培养60天的hiPSC-CM产生的ROS水平高于培养30天的hiPSC-CM¹³第60天的hiPSC-CM在基因表达、肌丝结构、缝隙连接和钙瞬变方面具有更成熟的表型，能够更准确地模拟DNA损伤的病理生理过程中Dox诱导的心脏毒性。在本研究中，我们证明Toma-CMs比对照CM对Dox诱导的细胞死亡更敏感。与对照组相比，Dox处理显著降低了Toma-CMs的搏动周期和棘波振幅，并增加了棘波斜率。这些结果表明，tomatidine诱导的hESC-CM成熟为评估心脏毒性提供了一个有用的模型。为了评估这些益处，研究人员需要研究心脏毒性药物在Toma-CMs中的作用。

总之，本研究首次证明，tomatidine可诱导人胚胎干细胞-CM成熟为成熟的类CM-细胞类型。Toma-CM表现出成熟的类CM-结构表型、电生理特征和增强的线粒体功能。成熟的CM为心脏毒性测试和患者特定疾病建模（包括线粒体疾病）提供了一个宝贵的平台。

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相互竞争的利益

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脚注

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