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.2022年3月7日；29(1):17.
doi:10.1186/s12929-022-00800-7。

氰胺3-O-阿拉伯糖苷通过调节p38依赖性ER-mitochondria接触抑制DHT诱导的毛乳头细胞衰老

年轻的玄贞 # 1, 张玉泽 # 1, 吉恩·崔 # 1, 他Cha Shin 2, Jae Ryong Lim先生 1, 韩升昌（Han Seung Chang） 1, Joonmo公园 1, 赵智贤（Ji Hyeon Cho） 1, 莫然公园 1, 李贤治 三 4, 何在翰 5
附属机构

花青素3-O-阿拉伯糖苷通过调节p38依赖性内质网线粒体接触抑制DHT诱导的毛乳头细胞衰老

年轻的玄贞等。 生物科学杂志. .

摘要

背景：雄激素性脱发（AGA）是一种由二氢睾酮（DHT）引起的遗传性疾病，伴随着位于毛囊底部的雄激素敏感毛乳头细胞（DPCs）的衰老。DHT通过线粒体功能障碍导致AGA中DPC衰老。然而，这种发病机制尚不清楚。在本研究中，我们研究了花青素对DHT诱导的线粒体功能障碍和DPC衰老的保护作用及其调控机制。

方法：采用线粒体SOX和Rhod-2染色法研究DHT对线粒体功能障碍的影响。进行衰老相关的β-半乳糖苷酶活性测定，以检测膜AR介导的信号传导在DHT诱导的DPC衰老中的作用。采用AGA小鼠模型研究了花青素对DHT诱导的毛发生长减速的影响。

结果：氰胺3-O-阿拉伯糖苷（C3A）有效地降低了DHT诱导的DPC中mtROS的积累，C3A逆转了DHT导致的DPC衰老。C3A阻止了线粒体过度钙积累。C3A抑制p38介导的电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）的表达，该通道通过VDAC1-IP3R1相互作用促进线粒体相关内质网膜（MAM）的形成和钙的转移。DHT诱导MAM的形成导致DPC衰老加剧。在AGA小鼠模型中，C3A恢复DHT诱导的毛发生长减速，从而激活毛囊干细胞增殖。

结论：C3A是一种很有前景的天然化合物，可通过减少MAM形成和线粒体功能障碍，用于AGA治疗DHT诱导的DPC衰老。

关键词：雄激素受体；氰化物3-O-阿拉伯糖苷；DHT；线粒体钙；衰老。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
C3A对DHT诱导的DPC衰老的影响。A类用二氢睾酮（DHT）（0至100 nM）处理皮肤乳头细胞（DPC）72小时。通过衰老相关β-半乳糖苷酶活性（SA-β-gal）测定测定衰老细胞。阳性细胞（蓝色）在五个随机区域手动计数。阳性细胞的比例数由每个治疗组的细胞百分比表示。N个 = 5B类细胞用MitoTEMPO（1μM）预处理30分钟，用DHT（100 nM）处理48小时。细胞用MitoSOX染色并用流式细胞仪分析。N个 = 4C类细胞用MitoTEMPO（1μM）预处理30分钟，用DHT（100 nM）处理72小时。用SA-β-gal法检测衰老细胞。N个 = 5D类用氰化物3预处理细胞-O（运行）-阿拉伯糖苷（C3A）（1μM），氰化物-3-O（运行）-葡萄糖苷（C3-glu，1μM）和氰化物-3-O（运行）-半乳糖苷（C3-gal，1μM）30分钟，用DHT处理48小时。细胞用MitoSOX染色并用流式细胞仪分析。N个 = 4E类用C3A预处理细胞30 min，并暴露于DHT 72 h。进行SA-β-gal测定。N个 = 5F类用C3A预处理细胞30分钟，用DHT处理72小时。western blot分析p16和p21的蛋白表达水平。β-actin作为负荷对照。N个 = 4G公司DPC用溶媒或DHT治疗72小时。生长因子抗体阵列采用DPC条件培养基。结果由化学发光成像系统捕获，并通过斑点的相对光密度进行量化。将FGF-6、FGF-4和FGF-7的表达水平与对照组进行比较。N个 = 三。H（H）,我从用C3A预处理并用DHT处理72小时的DPC的培养基中获得DPC条件培养基。用DPC条件培养基处理人毛囊干细胞48小时。H（H）用台盼蓝排斥试验计数活细胞。N个 = 6.数据以1 ml的单元格编号显示。我通过western blot分析评估p16和p21的蛋白表达水平。N个 = 4J型在DHT暴露24小时之前，用C3A处理DPC 30分钟。mRNA表达水平DKK1（丹麦克朗）,TGFB1型、和IL6（IL6）用qPCR进行分析。N个 = 5K（K）使用DKK-1 ELISA试剂盒在DPC条件培养基中的DKK-1浓度。从经C3A预处理和DHT处理72h的DPC培养基中提取DPC条件培养基。N个 = 5.数据是平均值 ± 扫描电镜*p < 0.05与对照组。#第页 < 0.05与DHT
图2
图2
C3A对DHT诱导的AR核转位的影响。A类–F类在DHT治疗24小时之前，用C3A治疗DPC 30分钟。A类相对mRNA表达水平应收账通过实时PCR进行分析。通过以下方式实现标准化促肾上腺皮质激素B mRNA表达式级别(B类)western blot分析检测AR蛋白表达水平。N个 = 三。C类通过细胞内分馏分离核蛋白和胞质蛋白。检测AR蛋白表达水平。层蛋白A/C作为核标记物，α-微管蛋白作为胞浆标记物。N个 = 三。D类用抗AR抗体（红色）对细胞进行免疫染色。细胞核用DAPI（蓝色）复染。N个 = 3.放大倍数×1000。比例尺为8μm。E类采用Cignal报告基因法分析AR转录活性。N个 = 5F类western blotting分析磷酸化HSP27和HSP27蛋白表达水平。N个 = 三。G公司用非靶向（NT）siRNA（25 nM）转染细胞应收账siRNA（25 nM）并用DHT处理72 h。对p16和p21蛋白进行蛋白质印迹分析。β-actin作为负荷对照。N个 = 3.数据为平均值 ± 扫描电镜*p < 0.05与对照组。#第页 < 0.05与DHT
图3
图3
C3A对DHT诱导的p38磷酸化的影响。A类,B类用C3A处理DPC 30 min，用DHT处理2 h。A类细胞用H2DCFDA（1μM）染色并用流式细胞仪分析。N个 = 三。B类通过western blot分析测定p-p38、p-ERK和p-JNK的水平。数据通过每种抗p38、-ERK和-JNK抗体进行标准化。N个 = 三。C类,D类用Apocynin（100μM）处理细胞30 min，并暴露于DHT 2 h。C类细胞用H2DCFDA染色并用流式细胞仪分析。N个 = 三。D类western blot分析磷酸化p38的表达水平。N个 = 4E类用Apocynin处理细胞30分钟，并暴露于DHT 72小时。进行SA-β-gal活性测定，计数总细胞中的蓝染细胞。N个 = 5F类用SB203580（1μM）处理细胞30 min，并暴露于DHT 24 h。western blot分析磷酸化p38和HSP27的表达水平。N个 = 三。G公司,H（H）用SB203580（1μM）处理细胞30 min，并暴露于DHT 72 h。G公司进行SA-β-gal活性测定，计数总细胞中的蓝染细胞。N个 = 5H（H）Western blotting用于分析p16和p21蛋白表达水平。N个 = 三。我用C3A处理细胞30分钟，并将其暴露于BSA结合的DHT中2小时。细胞用H2DCFDA（1μM）染色，流式细胞仪分析H2DCFDA-阳性细胞。N个 = 6J型用Apocynin处理细胞30分钟，暴露于BSA结合的DHT 2小时，并用H2DCFDA（1μM）染色。流式细胞仪检测H2DCFDA阳性细胞。N个 = 三。K（K）western blot分析磷酸化p38的表达水平。N个 = 4.数据为平均值 ± 扫描电镜*p < 0.05与对照组。#第页 < 0.05与DHT或BSA-DHT
图4
图4
C3A对DHT诱导的ER-线粒体接触的影响。A类用C3A处理DPC并暴露于DHT 24 h。通过ER-Tracker（200 nM）和Mito-Tracker染色观察细胞。用Image J软件分析ER-Tracker和Mito Tracker的彩色化。N个 = 5.放大倍数×1000。比例尺为8μm。B类用DHT处理细胞24小时。mRNA表达水平VDAC1、MCU1、MICU1、MCUR1、和MCUB公司通过qPCR分析进行定量。N个 = 5C类用C3A处理细胞30分钟，并暴露于DHT 24小时。western blotting分析MCU1和VDAC1的蛋白表达水平。N个 = 4D类通过PLA分析评估DPC细胞中VDAC1和IP3R1（VDAC1–IP3R1-红色）之间的相互作用。N个 = 4.放大倍数×1000。比例尺为8μm。E类,F类用RU360（1μM）预处理细胞30 min，并暴露于DHT 72 h。E类进行SA-β-gal活性测定，计数总细胞中的蓝染细胞。N个 = 5F类通过western blot分析定量p16和p21的蛋白表达水平。N个 = 4.*页 < 0.05与对照组。#第页 < 0.05与DHT
图5
图5
C3A对DHT诱导的线粒体钙积累的影响。A类用C3A处理DPC 30 min并暴露于DHT 48 h。细胞用Rhod-2（2μM）染色，阳性细胞用流式细胞仪分析。N个 = 6B类用SB203580（1μM）预处理细胞30 min，并暴露于DHT 24 h。western blotting分析VDAC1表达水平。C类用SB203580预处理细胞30 min，并暴露于DHT 48 h。采用Rhod-2（2μM）染色进行流式细胞术分析，并对藻红蛋白（PE）阳性细胞进行定量。D类用NT siRNA（25 nM）转染细胞VDAC1型siRNA（25 nM）并暴露于DHT 48小时。采用Rhod-2染色进行流式细胞术分析，并对PE阳性细胞进行定量。N个 = 4E类,F类沉默VDAC1型完成siRNA（25 nM）或NT siRNA（25nM），并将细胞暴露于DHT 72 h。E类进行SA-β-gal活性测定，计数总细胞中的蓝染细胞。N个 = 5F类通过western blot分析定量p16、p21和VDAC1的蛋白表达水平。N个 = 4.*页 < 0.05与对照组。#第页 < 0.05相对于DHT或NT siRNA + DHT公司
图6
图6
C3A对AGA小鼠模型毛发生长周期的影响。A类诱导雄激素性脱发小鼠模型的动物实验时间表。腹腔注射DHT（1 mg/100μl），每2天局部注射C3A（500μM）、SB203580（1 mM）和Apocynin（100 mM）。B类在脱毛后第7、11、15和19天拍摄照片。C类将脱毛的小鼠皮肤组织冷冻切片，用HE染色进行组织学检查。图像由数字幻灯扫描仪采集。N个 = 6.比例尺为400μm。D类在相同的随机区域（1 mm）计算毛囊数2).E类测量毛球直径。F类评估皮肤厚度。G公司通过测量皮肤组织切片的表皮和真皮长度来评估真皮比率。H（H）用抗Ki67抗体和DAPI对背部皮肤Ki67进行免疫荧光染色，进行细胞核染色。放大倍数× 200.比例尺为40μm*第页 < 0.05与对照组。#第页 < 0.05与DHT + 车辆
图7
图7
C3A对DHT诱导的线粒体钙内流和DPC衰老影响的示意模型。C3A有效降低DHT诱导的mtROS积累和DPC衰老。HSP27磷酸化受p38介导的信号调节，参与AR核转位。反过来，HSP27磷酸化受膜AR介导的信号调节，而C3A则对其进行抑制。值得注意的是，C3A抑制了p38介导的VDAC1表达，该表达通过VDAC1–IP3R1相互作用促进MAM的形成和钙的转移。最后，通过MAM形成过量线粒体钙进入导致DPC衰老增加，但C3A减少了DHT暴露条件下线粒体钙内流
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