氰化物3-O（运行）-阿拉伯糖苷通过调节p38依赖性ER-mitochondria接触抑制DHT诱导的毛乳头细胞衰老

摘要

背景

雄激素性脱发（AGA）是一种由二氢睾酮（DHT）引起的遗传性疾病，伴随着位于毛囊底部的雄激素敏感毛乳头细胞（DPCs）的衰老。DHT通过线粒体功能障碍导致AGA中DPC衰老。然而，这种发病机制尚不清楚。在本研究中，我们研究了花青素对DHT诱导的线粒体功能障碍和DPC衰老的保护作用及其调控机制。

方法

采用线粒体SOX和Rhod-2染色法研究DHT对线粒体功能障碍的影响。进行衰老相关β-半乳糖苷酶活性测定，以检测膜AR介导的信号通路在DHT诱导的DPC衰老中的作用。采用AGA小鼠模型研究了花青素对DHT诱导的毛发生长减速的影响。

结果

氰化物3-O（运行）-阿拉伯糖苷（C3A）可有效降低DHT诱导的DPC中mtROS的积累，C3A可逆转DHT诱导DPC的衰老。C3A阻止了线粒体过度钙积累。C3A抑制p38介导的电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）的表达，该通道通过VDAC1–IP3R1相互作用促进线粒体相关内质网膜（MAM）的形成和钙的转移。DHT诱导MAM的形成导致DPC衰老加剧。在AGA小鼠模型中，C3A恢复DHT诱导的毛发生长减速，从而激活毛囊干细胞增殖。

结论

C3A是一种很有前景的天然化合物，可通过减少MAM形成和线粒体功能障碍，用于AGA治疗DHT诱导的DPC衰老。

背景

雄激素性脱发（AGA）是由不规则毛发生长周期引起的最常见的脱发类型。人类毛乳头细胞（DPCs）中5-α-还原酶产生的二氢睾酮（DHT）的过度活性被认为是AGA的主要原因[1]. DHT对雄激素受体（AR）的亲和力最高，约为睾酮的5-10倍。然后，AR结合的DHT上调毛发生长抑制因子如dikkopf相关蛋白1（DKK-1）、白细胞介素-6（IL-6）和转化生长因子β（TGF-β）的表达，从而促进毛囊退化[2,三]. 这些来自衰老DPCs的分泌因子通过抑制毛囊新生、分化和毛囊干细胞的生长，阻断从休止期（静息期）到生长期（生长期）的转变，从而诱导脱发[4]. 减少DHT诱导的DPC衰老对AGA的预防很重要，以前的研究人员强烈同意线粒体功能障碍是高浓度DHT诱导细胞衰老的关键因素[5,6,7]. 由于通过5-α-还原酶抑制调节DHT生成的疗法对减少线粒体功能障碍没有效果，长期使用此类疗法通常会带来诸如性功能障碍或毛发脱落等副作用，值得开发一种新的治疗策略，减少副作用，同时保持DPC线粒体的生理功能[8,9,10]. 因此，了解DHT诱导的线粒体功能障碍的机制为新的AGA治疗提供了一种有希望的策略，可以最大限度地减少暴露于DHT水平升高的DPC的衰老。

当线粒体相关内质网膜（MAM）的形成增加时，就会发生线粒体功能障碍。这种连接通过调节两个结构之间的钙转运影响细胞代谢[11,12]. 先前的研究表明，由于肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP3R）和电压依赖性阴离子选择性通道蛋白（VDAC）之间的相互作用增加，线粒体钙超载会降低线粒体膜电位。这反过来又促进了线粒体活性氧（mtROS）的过度生成，导致线粒体功能障碍[13]. 尽管DPC的早衰与超过其生理抗氧化能力的过量mtROS积累密切相关，但MAM的形成在DPC衰老过程中的作用尚不清楚。以前的研究，包括我们自己的研究表明，MAM形成的失调会导致细胞在钙稳态、ROS生成、自噬和脂质代谢方面的功能改变[14]. 钙通过IP3R–VDAC1偶联流入线粒体基质会影响线粒体膜电位、线粒体呼吸和线粒体通透性转换孔（mPTP）的形成，所有这些都会导致线粒体功能障碍[13,15]. 此外，IP3R–VDAC1介导的MAM依赖性线粒体钙积累是细胞衰老和衰老的关键因素[12,16]. 总之，这说明需要研究诱导MAM依赖的线粒体钙积累的机制，以响应DHT介导的信号转导，从而减少DPC衰老。

花青素是一种主要的黄酮类花青素。它们是各种水果、花和叶子中的主要色素。它们是强大的抗氧化剂，在抗衰老、抗癌、抗炎、神经保护和心脏保护方面具有治疗潜力[17,18]. 由于其清除氧自由基的能力，许多研究人员研究了氰化物在防止衰老过程中的作用。此外，由于花青素的低毒副作用，通过调节信号转导途径清除活性氧的衍生物效应引起了研究人员的兴趣[19,20]. 氰化物的生物活性与线粒体功能的调节有关[21]. 此外，花青素通过调节线粒体拷贝数、线粒体呼吸链、线粒体膜电位和有丝分裂对各种疾病具有保护作用[22,23,24,25]. 然而，花青素对线粒体功能的影响可能因附着的糖残基而异。虽然已经研究了花青素对线粒体功能障碍的保护作用，但花青素调节DHT介导的线粒体功能障碍和DPC衰老的方法尚未研究。因此，寻找有希望的使用氰化物来防止DPC衰老的候选者将有助于AGA治疗。在本研究中，我们研究了花青素对DHT介导的DPC衰老的影响以及与线粒体钙稳态调节相关的详细机制。我们还旨在在AGA小鼠模型中确定氰化物对DPC衰老介导的脱发的保护作用。

方法

材料

氰化物3-O（运行）-阿拉伯糖苷（C3A，#26183）和氰化物3-O（运行）-葡糖苷（C3-glu，#16406）从开曼群岛（美国密歇根州安娜堡）获得。氰化物3-O（运行）-半乳糖苷购自PhytoLab（德国Vestenbergsgreuth，#PHL89463-10MG）。获得了5α-二氢甾酮（DHT）溶液（Cerilliant，Round Rock，TX，USA，#D-073）和5α-安卓烷-17β-OL-3-ONE 3-O-羧甲基肟：BSA（甾体类，Wilton，NH，USA），#A2574-050。MitoTEMPO（#ALX-430-150-M005）购自Enzo life science（美国纽约州法明代尔市）。H2DCFDA（#D399）、MitoSOX（#M36008）、DAPI（#D1306）、牛血清白蛋白（BSA，#15561020）、ER-Tracker Red（#E34250）、Mito Tracker Green FM（#M7514）和Rhod-2 AM（#R1244）均来自Invitrogen（加利福尼亚州卡尔斯巴德）。Apocynin（#178385）、SB203580（#S8307）、Bicalutamide（#PHR1678）和蓖麻油（#259853）购自Sigma-Aldrich（德国斯特恩海姆）。TurboFect（#R0532）购自Themo Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。Ki67（#ab16667）、IP3R1（#ab5804）和p16INK4a（#ab108349）抗体从Abcam（英国剑桥）获得。AR（#51135）、p38（#9212S）、phospho-HSP27（#2401L）和MCU（#14997S）抗体购自Cell signaling（美国马萨诸塞州丹弗斯）。从Invitrogen中获得HSP27（#MA3-015）和p21（#MA5-14949）抗体。从Santa Cruz（美国德克萨斯州达拉斯）购买了磷蛋白p38（#SC-166182）、磷蛋白ERK（#SC-7383）、磷化JNK（#SC-6254）、ERK-1（#SC-94）、JNK、Lamin A/C（#SC-20681）、VDAC1（#SC-390996）和β-肌动蛋白（#SC-47778）抗体。α-微管蛋白（#T6074）抗体来自（Sigma-Aldrich）。为了避免化学品氧化，所有材料在使用时都是新鲜制备的。所有试剂均为可用的最高纯度。

细胞培养

DPC在Promocell提供的毛囊毛乳头细胞生长培养基（含补充剂）中培养，该培养基补充有1%的青霉素-链霉素溶液（Gibco，Grand Island，NY，USA）。我们使用表达AR和对DHT反应的DPC。细胞生长在60 mm培养皿、100 mm培养皿或96 well培养皿（美国纽约州科宁市）中的培养箱（37°C，CO）中₂5%，空气95%）。当细胞达到80%融合时，用无补充培养基代替培养基饥饿24小时。24小时后，将细胞在无补充培养基中与指定的试剂孵育指定的处理时间。本研究中获得并使用了人类毛囊干细胞（HFSCs）（Celprogen，Torrance，CA，USA）。HFSCs用补充的人毛囊维持培养基（HFSC培养基，Celprogen）培养。HFSC在人毛囊扩张细胞外基质包被烧瓶（Celprogen）中培养。当HFSC达到80%的融合时，用DPC条件培养基和HFSC培养基的1:1混合液替换培养基，并培养48小时。用台盼蓝排除试验计数活细胞。

细胞内活性氧、线粒体活性氧和线粒体钙的测定

线粒体超氧化物和钙的水平由Cytoflex（美国佛罗里达州贝克曼·库尔特）测量，如下所示。将胰蛋白酶化的DPC与MitoSOX（5μM）或Rhod-2（2μM）在37°C下孵育20分钟，同时避光。细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤一次，重悬于PBS中，并通过流式细胞术进行分析。结果是通过比较高荧光强度的细胞百分比得出的。用H2DCFDA染色法测定细胞内ROS水平。用PBS清洗细胞，并在37°C培养基中的1μM H2DCFDA中培养30分钟。用Cytoflex分析胰蛋白酶化细胞。

衰老相关β-半乳糖苷酶活性测定

按照实验设计处理DPC，并用PBS清洗两次。细胞在室温下用4%多聚甲醛（PFA，Lugen Sci，Bucheon，Korea）固定10分钟，然后用衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）（Sigma-Aldrich，#CS0030）染色液在37°C无CO的条件下培养12小时₂用倒置显微镜（尼康Eclipse TS100；日本东京尼康）观察SA-β-gal阳性细胞呈蓝色，并计算SA-β-gal阳性细胞的平均百分比。

生长因子抗体阵列

通过与RayBiotech C系列人生长因子抗体阵列C1试剂盒AAH-GF-1（RayBiotech，Norcross，GA，USA）的膜孵育，分析培养条件培养基中生长因子的含量。将膜在封闭缓冲液中培养30分钟，然后在4°C下用条件培养基培养过夜。然后用洗涤缓冲液洗涤膜五次，并在室温下用生物素结合抗体培养2小时。然后，用洗涤缓冲液洗涤膜五次，并用辣根过氧化物酶结合链霉亲和素培养2小时。洗涤后，使用化学发光成像系统，通过增强化学发光试剂检测人类生长因子。用斑点的相对光密度进行分析，并用阳性对照进行归一化。用于生长因子抗体阵列的抗体列在附加文件中1：表S1。

蛋白质印迹和亚细胞分离

用蛋白酶抑制剂混合物将细胞溶解到RIPA缓冲液中，并在冰上培养30分钟。通过在4°C下以12000 rpm离心20分钟来降低细胞裂解物。降速后，使用Pierce BCA蛋白质分析试剂盒（Thermo scientific，Waltham，MA，USA）在562 nm处测定蛋白质浓度，并用SDS-PAGE（8-12%聚丙烯酰胺）分离等量的蛋白质（10μg）。通过半干式转移细胞（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）在22 V下将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上1小时。在室温下用5%的脱脂非脂牛奶（封闭级封闭剂；Bio-Rad）在1×TBST（10 mM Tris–HCl，150 mM NaCl，0.05%吐温-20）中封闭膜30分钟，并在4°C下与一级抗体孵育过夜。将膜与辣根过氧化物酶（HRP）与抗IgG二级抗体结合培养2 h，并通过ECL检测试剂盒（Bio-Rad）进行可视化。使用ChemiDoc™XRS可视化特定条带 + 系统（Bio-Read）。亚细胞分离用于分离胞浆和核蛋白。细胞在100 mm培养皿中培养，并用指定的试剂处理。为了制备细胞溶质和细胞核分馏样品，使用了EzSubcell亚细胞分馏/提取试剂盒（日本东京Atto，#WSE-7421）。根据制造商的说明制备用于western blot分析的细胞质和核样品。α-微管蛋白和层粘连蛋白A/C分别用作细胞溶质和核蛋白标记物。

AR转录活性测定

DPC生长在96孔黑板中，并根据制造商的说明（荷兰文洛市齐亚根，#CCS-1019L）用TurboFect转染试剂（Thermo-scientific，#R0532）转染Cignal雄激素受体报告剂（200 ng）。细胞生长至80%汇合，并在暴露于DHT（100 nM）之前用C3A（1μM）预处理。按照制造商的指南，使用荧光素酶报告分析系统（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加，E1910号），对Victor 3多标签板阅读器（美国马萨诸塞州波士顿，PerkinElmer）中的萤火虫/雷尼拉荧光素酶活性进行分析。

实时定量PCR

用DHT或载体处理细胞24小时。然后用PBS洗涤细胞两次，并用含有50×二硫苏糖醇（DTT）溶液的缓冲液RL溶解细胞。根据制造商的说明，使用RNA提取试剂盒（日本塔卡拉，#9767）提取总RNA。使用Maxime RT预混料试剂盒（iNtRON，Sungnam，韩国）对0.5μg总RNA进行逆转录PCR（RT-PCR）。使用Rotor gene Q设备（Corbett Research，Cambridge，UK）和TB Green Premix Ex Taq（TaKaRa，#RR420A）分析靶基因的相对mRNA表达水平。通过对PCR产物的检测和熔融曲线的分析，验证了实时定量PCR引物的特异性、效率和保真度。引物序列列在附加文件中1：表S2。

免疫细胞化学

细胞在直径为35 mm的共聚焦培养皿中培养（SPL，韩国首尔），并用4%PFA固定在PBS中，用0.1%（v/v）的Triton X-100渗透5分钟，并在每个步骤用PBS洗涤3次5分钟。用5%的正常山羊血清（NGS，Vector Lab，Burlingame，CA，USA）在PBS中封闭细胞30分钟。在室温下，将抗-AR抗体在PBS中的5%（v/v）NGS中稀释4 h。用PBS洗涤三次5 min后，在室温下用Alexa Fluor 555次级抗体（Invitrogen）培养细胞1 h，并用DAPI（Invit罗gen）进行复染。用Andor SRRF系统（英国阿宾顿牛津仪器公司）对细胞进行可视化。为了分析ER-Mitochondric接触，用C3A和DHT处理细胞24小时。用PBS洗涤细胞三次后，将细胞与Mito Tracker绿色（200 nM）和ER Tracker（200 nM）在无补充培养基中在37°C下孵育20分钟，并用DAPI对细胞核进行染色。

小干扰RNA（siRNA）转染

将DPC培养至80%的融合率，并用预先设计的靶向siRNA转染细胞24小时应收账或VDAC1型根据制造商的协议，使用TurboFect试剂（Thermo Scientific）从BIONEER（韩国大田）或非靶向（NT）siRNA作为阴性对照（25 nM）获得。本研究中使用的siRNA序列列于附加文件中1：表S2。

酶联免疫吸附试验

根据供应商的协议，使用人类DKK-1量化因子ELISA试剂盒（研发系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国，#DKK100B）对DPC条件培养基中的DKK-1进行定量。DPC培养至80%汇合，然后用DHT处理。在− 80°C。3000离心后克用上清液进行ELISA检测5分钟。使用人类IL-6（LabisKOMA，韩国首尔，#K0331194）和TGF-β1（LabisKOMA，韩国，首尔，#K0332110）ELISA试剂盒测量DPC条件培养基中的IL-6和TGF--β1浓度。

原位近贴结扎试验

使用Duolink原位检测VDAC1/IP3R1相互作用^®根据供应商的协议，现场红色启动试剂盒老鼠/兔子（Sigma-Aldrich，#DUO92101）。固定细胞，应用近端结扎分析（PLA）探针、抗VDAC1和抗IP3R1抗体。然后，添加次级抗体。如果抗体很接近(< 40 nm），它们结扎在一起。补充聚合和放大溶液以放大闭合圆的信号（红色），并通过SRRF显微镜进行观察。用DAPI对细胞核进行复染。

动物研究的实验设计

所有动物实验均按照《国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》进行，并获得首尔国立大学动物护理和利用委员会（SNU-200916-6-1）的许可。对适应1周的7周龄雄性C57BL/6小鼠（ORIENT，Seongnam，Korea）在第1、5和13天腹膜内给予溶于玉米油的DHT（1mg/天）。在第一次注射DHT后的第二天，所有小鼠通过腹腔注射阿法沙龙（40 mg/kg）和木聚嗪（10 mg/kg）进行麻醉。用剪刀给老鼠剃毛，用脱毛膏脱毛。小鼠背部皮肤出现生长期。将小鼠分为五组。制备C3A（500μM）、Apocynin（100 mM）和SB203580（1 mM），并以7:3的比例溶解在蓖麻油（Sigma-Aldrich，#259853）和乙醇的混合物中。每2天对脱毛的皮肤进行一次局部治疗。在第7天、第11天、第15天和第19天，用数码相机在20cm的距离处拍摄小鼠背部皮肤和毛发的生长状态。第21天，处死所有小鼠以获取皮肤组织样本。

苏木精和伊红（HE）染色和免疫组织化学

为了评估皮肤厚度和毛发再生，在脱毛21天后采集皮肤样本。样品在4%PFA中固定24小时，然后在PBS中溶解的30%蔗糖中脱水1天。使用低温恒温器（Leica Biosystems，Nussloch，德国）获得30μm厚的纵向切片，然后用HE染色。用4%PFA孵育组织5分钟，用自来水冲洗5分钟。组织用苏木精染色3分钟，并用自来水冲洗5分钟。接下来，将组织与含有1%HCl的70%酒精孵育5 s，并与曙红溶液孵育30 s。将载玻片分别置于95%、100%乙醇和二甲苯中三次，每次3 s。用薄盖玻片覆盖纸巾（Paul Marienfeld GmbH&Co.KG，Lauda-Konigshofen，德国）。使用Slideviewer软件（3DHISTECH，匈牙利布达佩斯）测量皮肤厚度和毛乳头直径。使用表皮和真皮之间的厚度与整个皮肤厚度的比值来测量真皮比率。用抗Ki67抗体进行免疫组化。细胞核用DAPI染色。免疫荧光图像由共焦显微镜捕获（卡尔蔡司，德国Oberkochen，#LSM 800）。组织学评估以盲法进行。

统计分析

所有定量数据均表示为平均值 ± 平均值标准误差（SEM）。使用SigmaPlot 12软件分析数据。动物研究的样本量由SigmaPlot 12软件确定。使用双尾Student t检验对两个实验组进行比较。使用单向方差分析比较多个实验组的平均值，然后使用Student–Newman–Keuls检验进行多重比较。的p值< 0.05被认为具有统计学意义。

结果

C3A对DHT诱导DPC衰老的影响

众所周知，DHT可诱导DPC衰老。我们进行了反映衰老状态的SA-β-半乳糖活性测定，以研究DHT对DPC衰老的影响。我们证实，DHT以浓度依赖的方式增加了SA-β-gal阳性DPC的比率（图1A） ●●●●。衰老细胞的特征是mtROS水平增加，因此我们检测了DHT处理的DPC中的mtROS含量。我们发现，线粒体靶向抗氧化剂MitoTEMPO可以减少DHT诱导的线粒体ROS积累，这可以通过MitoSOX染色进行评估。MitoTEMPO恢复了DHT诱导的DPC衰老（图1B、 C）。我们假设，在DHT诱导的DPC衰老中，花青素可能影响mtROS水平。在候选花青素中，C3A的mtROS还原作用高于C3葡萄糖苷（C3-Glu）或C3半乳糖苷（C3-Gal）（图1D） ●●●●。事实上，我们观察到C3A预处理降低了随着DHT治疗而增加的SA-β-gal阳性DPC的比率（图1E） ●●●●。一贯地，C3A预处理抑制了DPC中衰老标记物p21和p16的表达，这些标记物随着DHT的增加而增加（图1F） ●●●●。鉴于DPC衰老改变了支持HFSCs增殖的各种生长因子的分泌，我们测定了DHT治疗后生长因子的水平。在检测生长因子的抗体阵列中，在DHT条件培养基中观察到FGF6和FGF4降低（图1G） ●●●●。为了证实C3A处理的DPC条件培养基是否抑制DHT处理的DPC-条件培养基对HFSC增殖的有害影响，将HFSC与经DHT或C3A处理过的DPC条件性培养基培养。我们发现用DHT处理的DPC条件培养基减少了HFSC的增殖，但C3A预处理减少了DHT的有害影响（图1H） ●●●●。衰老DPC分泌因子抑制HFSC增殖。然而，当暴露于DHT处理的条件培养基中时，C3A恢复了HFSC的增殖。我们发现，与暴露于DHT处理的DPC条件培养基的HFSC相比，暴露于C3A预处理的DPC-条件培养基中的HFSC显示出衰老标记表达水平降低（图1一） ●●●●。此外，我们检测了DKK1（丹麦克朗）,TGFB1型、和IL6（IL6）已知可促进毛囊退化。如预期，增加了DKK1（丹麦克朗）,TGFB1型、和IL6（IL6）C3A预处理逆转了mRNA水平（图1J） ●●●●。与这些结果一致，DHT处理的条件培养基中增加的DKK1浓度降低到C3A的控制水平（图1K） ●●●●。此外，DHT处理的条件培养基中增加的IL-6和TGF-β1浓度也恢复到C3A的对照水平（附加文件1：图S1）。总之，我们发现C3A有效地降低了DHT诱导的DPC衰老和相关分泌因子。此外，C3A预处理挽救了接触DHT处理的条件培养基的HFSCs的增殖，从而保持毛囊再生能力。

图1

C3A对DHT诱导的DPC衰老的影响。A类用二氢睾酮（DHT）（0至100 nM）处理皮肤乳头细胞（DPC）72小时。通过衰老相关β-半乳糖苷酶活性（SA-β-gal）测定测定衰老细胞。阳性细胞（蓝色）在五个随机区域手动计数。阳性细胞的比例数由每个治疗组的细胞百分比表示。N个=======================================================================5B类细胞用MitoTEMPO（1μM）预处理30分钟，用DHT（100 nM）处理48小时。细胞用MitoSOX染色并用流式细胞仪分析。N个=======================================================================4C类细胞用MitoTEMPO（1μM）预处理30分钟，用DHT（100 nM）处理72小时。用SA-β-gal法检测衰老细胞。N个=======================================================================5D类用氰化物3预处理细胞-O（运行）-阿拉伯糖苷（C3A）（1μM），氰化物-3-O（运行）-葡萄糖苷（C3-glu，1μM）和氰化物-3-O（运行）-半乳糖苷（C3-gal，1μM）30分钟，用DHT处理48小时。细胞用MitoSOX染色并用流式细胞仪分析。N个=======================================================================4E类用C3A预处理细胞30 min，并暴露于DHT 72 h。进行SA-β-半乳糖测定。N个=======================================================================5如果用C3A预处理细胞30分钟，用DHT处理72小时。western blot分析p16和p21的蛋白表达水平。β-actin作为负荷对照。N个=======================================================================4G公司DPC用溶媒或DHT治疗72小时。DPC条件培养基用于生长因子抗体阵列。结果由化学发光成像系统捕获，并通过斑点的相对光密度进行量化。将FGF-6、FGF-4和FGF-7的表达水平与对照组进行比较。N个=======================================================================三。H（H）,我从经C3A预处理和DHT处理72h的DPC培养基中获得DPC条件培养基。用DPC条件培养基处理人毛囊干细胞48小时。H（H）用台盼蓝排斥试验计数活细胞。N个=======================================================================6.数据以1ml的细胞数表示。我通过western blot分析评估p16和p21的蛋白表达水平。N个=======================================================================4J型在DHT暴露24小时之前，用C3A处理DPC 30分钟。mRNA表达水平DKK1（丹麦克朗）,TGFB1型、和IL6（IL6）用qPCR进行分析。N个=======================================================================5K（K）使用DKK-1 ELISA试剂盒在DPC条件培养基中的DKK-1浓度。从经C3A预处理和DHT处理72h的DPC培养基中提取DPC条件培养基。N个=======================================================================5.数据为平均值 ± 扫描电镜*p < 0.05与对照组。^#第页 < 0.05与DHT

C3A对DHT诱导AR核转位的影响

雄激素与AR结合可诱导AR核移位，进而诱导AR表达并作为雄激素应答基因的转录因子[26,27]. 因此，我们测量了应收账在DPC中mRNA表达和AR蛋白表达，以确定C3A是否影响DHT诱导的AR表达。DHT增加应收账mRNA和AR蛋白表达，但C3A处理后其表达降低至对照水平（图2A和B）。接下来，我们研究了C3A对AR核移位的影响。DHT诱导的AR核移位和C3A预处理抑制AR核移位（图2C） ●●●●。同样，我们观察到，通过DHT处理增加的细胞核AR荧光强度被C3A逆转（图2D） ●●●●。此外，我们通过荧光素酶报告子分析研究了DPC中AR转录活性。DHT使AR转录活性增加了约250%，但C3A预处理显著降低到控制水平（图2E） ●●●●。结合DHT的AR与热休克蛋白27（HSP27）相互作用。当磷酸化的HSP27与AR结合时，它移位到细胞核[28,29]. 因此，我们假设C3A会通过影响AR和HSP27之间的相互作用来抑制AR核转位。我们发现DHT增加了HSP27的磷酸化，而C3A预处理会降低HSP27磷酸化（图2F） ●●●●。由于细胞质AR在基因位点和分子结构方面与膜AR完全不同，因此我们使用应收账siRNA对细胞质AR而非mAR具有特异性，以研究AR的核转位是否参与DPC衰老。有趣的是，沉默AR表达并没有抑制DHT诱导的p16和p21的表达（图2G） ●●●●。总的来说，C3A通过调节HSP27磷酸化在抑制DHT诱导的AR核转位中起关键作用，但AR的核转位并不参与DHT诱导DPC衰老。

图2

C3A对DHT诱导的AR核转位的影响。A类–如果在DHT治疗24小时之前，用C3A治疗DPC 30分钟。A类相对mRNA表达水平应收账通过实时PCR进行分析。通过以下方式实现标准化促肾上腺皮质激素B mRNA表达式级别(B类)western blot分析检测AR蛋白表达水平。N个=======================================================================三。C类通过细胞内分馏分离核蛋白和胞质蛋白。检测AR蛋白表达水平。使用层粘连蛋白A/C作为核标记，使用α-微管蛋白作为胞质溶胶标记。N个=======================================================================三。D类用抗AR抗体（红色）对细胞进行免疫染色。细胞核用DAPI（蓝色）复染。N个=======================================================================3.放大倍数×1000。比例尺为8μm。E类采用Cignal报告基因法分析AR转录活性。N个=======================================================================5如果western blotting分析磷酸化HSP27和HSP27蛋白表达水平。N个=======================================================================三。G公司用非靶向（NT）siRNA（25 nM）转染细胞应收账siRNA（25 nM）并用DHT处理72 h。对p16和p21蛋白进行蛋白质印迹分析。β-actin作为负荷对照。N个=======================================================================3.数据为平均值 ± 扫描电镜*p < 0.05与对照组。^#第页 < 0.05与DHT

C3A对DHT诱导的p38磷酸化的影响

然后，我们研究了DHT是否通过激活膜AR（mAR）触发DPC衰老。众所周知，mAR可激活NADPH氧化酶（NOX）产生活性氧，活性氧随后激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）[30]. 因此，我们通过H2DCFDA染色检测细胞内ROS。DHT处理增加了ROS，C3A逆转了ROS（图三A） ●●●●。然后我们研究了DHT和C3A对MAPK活性的影响。我们发现C3A预处理降低了DHT诱导的p38磷酸化，而它没有显著影响ERK或JNK的磷酸化（图三B） ●●●●。用罗布青素（一种NOX复合物抑制剂）预处理可减少DHT诱导的ROS生成，表明DHT通过激活NOX复合物质增加ROS生成（图三C） ●●●●。DHT诱导的p38磷酸化和DPC衰老被Apocynin预处理抑制（图三D和E）。然后我们研究了DHT是否通过p38介导的信号传导诱导HSP27磷酸化。用p38抑制剂SB203580治疗可降低DHT诱导的HSP27磷酸化（图三F） 表明C3A抑制衰老是通过降低ROS介导的p38活性介导的。此外，SB203580预处理有效地阻止了DHT诱导的DPCs衰老，如SA-β-gal活性降低以及p16和p21的表达所示（图三G和H）。当我们通过同时治疗C3A和SB203580进行实验时，DHT诱导的p16和p21衰老标记物表达减少，与C3A治疗组相似（附加文件1：图S2）。这些结果表明，C3A抑制DPC衰老是通过抑制DHT诱导的p38活性介导的。此外，为了证实mAR介导的信号传导的参与，我们治疗了膜不透性DHT。预测mAR具有跨膜结构域并定位于质膜，DHT启动快速信号激活mAR。我们的结果表明氧气1和SLC39A型已确认，但GPRC6A系列和TRPM8号机组不在DPC中（附加文件1：图S3A）。的确，应收账沉默并没有减少这两者氧气1和SLC39A型mRNA表达水平（附加文件1：图S3B）。由于BSA-共轭DHT（BSA-DHT）激活mAR而不是细胞内AR，因此我们研究了BSA-DHT对NOX依赖性ROS形成和p38磷酸化的影响。BSA-DHT增加了ROS水平，这被Apocynin和C3A预处理所抑制（图第三章和J）。随后，DHT-BSA诱导的p38磷酸化被C3A预处理逆转（图三K） ●●●●。因此，我们的结果表明DHT激活的mAR可诱导DPC衰老。此外，C3A通过调节NOX依赖性ROS的形成来抑制p38介导的HSP27磷酸化。

图3

C3A对DHT诱导的p38磷酸化的影响。A类,B类用C3A处理DPC 30 min，用DHT处理2 h。A类细胞用H2DCFDA（1μM）染色并用流式细胞仪分析。N个=======================================================================三。B类通过western blot分析测定p-p38、p-ERK和p-JNK的水平。数据通过每个抗p38、-ERK和-JNK抗体进行标准化。N个=======================================================================三。C类,D类用Apocynin（100μM）处理细胞30 min，并暴露于DHT 2 h。C类细胞用H2DCFDA染色并用流式细胞仪分析。N个=======================================================================三。D类western blot分析磷酸化p38的表达水平。N个=======================================================================4E类用Apocynin处理细胞30分钟，并暴露于DHT 72小时。进行SA-β-gal活性测定，计数总细胞中的蓝染细胞。N个=======================================================================5如果用SB203580（1μM）处理细胞30 min，并暴露于DHT 24 h。通过蛋白质印迹分析分析磷酸化p38和HSP27的表达水平。N个=======================================================================三。G公司,H（H）用SB203580（1μM）处理细胞30 min，并暴露于DHT 72 h。G公司进行SA-β-gal活性测定，计数总细胞中的蓝染细胞。N个=======================================================================5H（H）Western blotting用于分析p16和p21蛋白表达水平。N个=======================================================================三。我用C3A处理细胞30分钟，并将其暴露于BSA结合的DHT中2小时。细胞用H2DCFDA（1μM）染色，流式细胞仪分析H2DCFDA-阳性细胞。N个=======================================================================6J型细胞用罗布麻素处理30分钟，暴露于BSA缀合的DHT 2小时，并用H2DCFDA（1μM）染色。流式细胞仪检测H2DCFDA阳性细胞。N个=======================================================================三。K（K）western blot分析磷酸化p38的表达水平。N个=======================================================================4.数据为平均值 ± 扫描电镜*p < 0.05与对照组。^#第页 < 0.05与DHT或BSA-DHT

C3A对DHT诱发的ER-mitochondria接触的影响

MAM增强线粒体和内质网之间的通讯，在钙向线粒体的转移和衰老过程中发挥作用。在此，我们研究了C3A对DHT诱导的MAM形成的影响。DHT增加了DPC中ER-Tracker和Mito-Tracker的共定位，这被C3A预处理所抑制（图4A） ●●●●。然后，我们研究了DHT对线粒体钙内流调节蛋白如VDAC1、线粒体钙单转运蛋白（MCU）、线粒体钙摄取1（MICU1）、MCU调节蛋白1（MCUR1）和MCU显性负β亚基（MCUB）mRNA表达的影响。我们发现VDAC1型表达上调，而在单片机,MICU1系列,MCUR1公司，或MCUB公司DPC在DHT处理下（图4B） ●●●●。相反，C3A预处理降低了DHT诱导的VDAC1表达（图4C） ●●●●。为了确认MAM形成是否因DHT上调VDAC1而增加，我们执行PLA检测IP3R1和VDAC1之间的连接。我们发现，DHT处理促进了VDAC1和IR3R1之间相互作用的增加，而C3A预处理则使其减少（图4D） ●●●●。MCU抑制剂RU360抑制DHT诱导的线粒体钙积累，降低SA-β-gal阳性细胞数量和衰老标记物p16和p21蛋白表达（图4E和F）。基于这些结果，我们的数据表明，通过下调VDAC1减少DPC衰老，C3A通过抑制VDAC1–IP3R1相互作用减少ER-线粒体接触。

图4

C3A对DHT诱导的ER-线粒体接触的影响。A类用C3A处理DPC并暴露于DHT 24 h。通过ER-Tracker（200 nM）和Mito-Tracker染色观察细胞。用Image J软件分析ER-Tracker和Mito Tracker的彩色化。N个=======================================================================5.放大倍数×1000。比例尺为8μm。B类用DHT处理细胞24小时。mRNA表达水平VDAC1、MCU1、MICU1、MCUR1、和MCUB公司通过qPCR分析进行定量。N个=======================================================================5C类细胞用C3A处理30分钟，并暴露于DHT 24小时。western blotting分析MCU1和VDAC1的蛋白表达水平。N个=======================================================================4D类通过PLA分析评估DPC细胞中VDAC1和IP3R1（VDAC1–IP3R1-红色）之间的相互作用。N个=======================================================================4.放大倍数×1000。比例尺为8μm。E类,如果用RU360（1μM）预处理细胞30 min，并暴露于DHT 72 h。E类进行SA-β-gal活性测定，计数总细胞中的蓝染细胞。N个=======================================================================5如果通过western blot分析定量p16和p21的蛋白表达水平。N个=======================================================================4.*页 < 0.05与对照组。^#第页 < 0.05与DHT

C3A对DHT诱导线粒体钙积累的影响

线粒体钙积累导致线粒体功能障碍，导致细胞衰老[31]. 因此，我们通过对Rhod-2进行染色来测量线粒体钙内流。流式细胞仪检测Rhod-2荧光的结果表明，C3A预处理抑制了DHT刺激的DPC线粒体钙内流（图5A） ●●●●。我们进一步证实，抑制p38可以逆转DHT诱导的VDAC1表达和线粒体钙积累（图5B和C）。AR沉默并没有抑制DHT诱导的VDAC1表达（附加文件1：图S4）。然后，我们研究了抑制线粒体钙积累是否通过抑制DPC中VDAC1的表达而诱导抗衰老作用。沉默VDAC1减少了DHT刺激的Rhod-2阳性细胞群（图5D） ●●●●。转基因VDAC1型siRNA降低了DHT治疗下SA-β-gal阳性细胞的数量以及p21和p16的表达（图5E和F）。这些发现表明，C3A通过调节p38介导的VDAC1表达抑制DHT诱导的线粒体钙积累，过量的线粒体钙参与诱导DPC衰老。

图5

C3A对DHT诱导的线粒体钙积累的影响。A类用C3A处理DPC 30 min并暴露于DHT 48 h。细胞用Rhod-2（2μM）染色，阳性细胞用流式细胞仪分析。N个=======================================================================6B类用SB203580（1μM）预处理细胞30 min，并暴露于DHT 24 h。western blotting分析VDAC1表达水平。C类用SB203580预处理细胞30 min，并暴露于DHT 48 h。采用Rhod-2（2μM）染色进行流式细胞术分析，并对藻红蛋白（PE）阳性细胞进行定量。D类用NT siRNA（25 nM）转染细胞VDAC1型siRNA（25 nM）并暴露于DHT 48小时。采用Rhod-2染色进行流式细胞术分析，并对PE阳性细胞进行定量。N个=======================================================================4E类,如果用沉默VDAC1型完成siRNA（25 nM）或NT siRNA（25nM），并将细胞暴露于DHT 72 h。E类进行SA-β-gal活性测定，计数总细胞中的蓝染细胞。N个=======================================================================5如果通过western blot分析定量p16、p21和VDAC1的蛋白表达水平。N个=======================================================================4.*页 < 0.05与对照组。^#第页 < 0.05与DHT或NT siRNA比较 + DHT公司

C3A对AGA小鼠毛发生长周期的影响

DHT诱导的DPC衰老与毛发生长减速和HFSCs的变化有关，这些都被C3A诱导的p38磷酸化和MAM形成所抑制。我们在DHT诱导的脱发小鼠模型中研究了C3A对毛发再生诱导的影响。为了检测C3A介导的p38磷酸化通过NOX依赖性ROS的形成对DHT诱导的毛发再生减少的影响，通过腹膜内注射用DHT治疗小鼠。如图所示，C3A、SB203580和Apocynin局部施用于无毛皮肤6A.脱毛后第7、11、15和19天拍摄的照片的大体检查结果显示，C3A挽救了DHT引起的毛发生长减速（图6B） ●●●●。此外，SB203580和Apocynin结果显示，与车用给药小鼠组相比，毛发生长速度加快。治疗后第21天，采集皮肤组织样本，并用HE对组织切片进行染色（图6C） ●●●●。DPC位于HF的毛球内，与毛发生长的进程和HF的周期有关。由于AGA发病机制可以调节毛囊数量和毛球大小，因此我们观察了DHT对其的影响。DHT治疗小鼠的毛囊数量没有减少，但DHT和C3A、SB203580显著减小了毛球大小，而Apocynin可以逆转DHT的作用（图6D和E）。这表明C3A和C3A介导的p38磷酸化抑制参与维持DPC的增殖和功能，尽管暴露于DHT。DHT也会改变皮肤层的厚度。我们检查了皮肤厚度和真皮与表皮的比率。注射DHT的小鼠皮肤厚度也减少，但C3A可以逆转这种皮肤变薄（图6F和G）。小鼠皮肤组织切片用抗Ki67抗体染色，并在第21天评估毛囊区域的免疫荧光信号。从DHT诱导的小鼠获得的组织切片中Ki67阳性细胞数量减少，但C3A处理增加了Ki67阳性信号的数量。这表明C3A可以从休止期诱导生长期（图6H） ●●●●。总之，DHT诱导的毛囊周期延迟和毛发生长减速受C3A、p38和NOX介导的信号调节。此外，C3A恢复毛发生长速度与抑制DPC衰老有关。

图6

C3A对AGA小鼠模型毛发生长周期的影响。A类诱导雄激素性脱发小鼠模型的动物实验时间表。腹腔注射DHT（1 mg/100μl），每2天局部注射C3A（500μM）、SB203580（1 mM）和Apocynin（100 mM）。B类在脱毛后第7、11、15和19天拍摄照片。C类将脱毛的小鼠皮肤组织冷冻切片，用HE染色进行组织学检查。图像由数字幻灯扫描仪采集。N个=======================================================================6.比例尺为400μm。D类在相同的随机区域（1 mm）计算毛囊数²).E类测量毛球直径。如果评估皮肤厚度。G公司通过测量皮肤组织切片的表皮和真皮长度来评估真皮比率。H（H）用抗Ki67抗体和DAPI对背部皮肤Ki67进行免疫荧光染色，进行细胞核染色。放大倍数× 200.比例尺为40μm*第页 < 0.05与对照组。^#第页 < 0.05与DHT + 车辆

讨论

在这项研究中，我们展示了C3A对p38介导的MAM形成和线粒体钙内流的影响，这可以缓解DHT诱导的DPC衰老。衰老细胞是可以存活的，但由于基因组和蛋白质组完整性的破坏而受损的非增殖细胞主要归因于线粒体功能障碍和线粒体活性氧累积[32]. 它们表现出DNA完整性、氧化还原信号、与分泌表型相关的衰老和代谢谱的变化[33]. 在化学分析中黑果Aronia melanocarpa与其他形式的氰化物相比，C3A提取物对氧化应激具有更高的自由基清除活性。这表明，花青素的清除能力取决于连接糖单元在缓解氧化应激中的残留[34]. 根据之前的结果，包括我们的结果，C3A，一种在碳3位与阿拉伯糖苷糖偶联的花青素，比其他花青素具有更高的抗氧化效率[35]. 以前有报道称，其他氰化物通过维持线粒体膜电位和线粒体功能，对氧化应激诱导的衰老具有保护作用[23,24,36]. 但是，我们的结果显示C3A逆转了DHT诱导的DPC中mtROS水平和衰老标记物的表达。因此，我们发现C3A在减少DHT诱导的DPC衰老和调节线粒体功能方面发挥作用。

我们的研究表明，抑制AR核转位不足以抑制DHT诱导的DPC衰老。虽然DHT刺激DKK-1、TGF-β和IL-6等抑制因子的分泌，但它并不参与DPC衰老过程。以前的一份报告显示，DHT诱导刺激DPC衰老的信号转导，无论AR的核转位如何，DPC衰老都受到调控[37]. 因此，mAR信号介导的DPC衰老可能是AGA发病机制的靶点。在我们的研究中，我们发现了一种强大的花青素化合物C3A，它在DPC衰老过程中对细胞内和mAR信号都有影响。先前的一份报告表明，雄激素通过激活缺乏调节性N-末端结构域变体的mAR来诱导氧化应激，从而诱导NOX依赖性ROS的产生[30]. 此外，DHT通过激活假定的mAR（如SLC39A、GPRC6A和瞬时受体电位美拉司他丁8（TRPM8））促进信号转导[38]. 与我们的研究结果一致，其他研究人员已经表明，雄激素具有依赖于氧化应激水平的独特作用，但拮抗剂抑制AR并不能挽救氧化应激诱导的神经元细胞活力[30]. 相反，AR的核转位诱导了一种适应机制，雄激素缺乏会随着NOX（NOX1，gp91）的增加而引发氧化损伤^福兹和NOX4），活性氧还原酶减少。这表明AR的核转位调节ROS平衡以对抗氧化应激[39,40,41]. 因此，DHT诱导的衰老并不依赖于AR的核转位。但这表明C3A的抗氧化作用对通过清除mAR介导的信号产生的ROS恢复DPC衰老至关重要。

我们的研究最初证明了DHT诱导的DPC衰老是由p38磷酸化促进的，C3A抑制mAR信号介导的p38磷酸。在我们的结果中，DPC衰老是由p38介导的线粒体功能障碍引起的，而VDAC1的表达是由DHT增加的。与我们的结果一致，在硅片分析中表明VDAC1型预计启动子序列与CREB、SP1和ETSF结合[42]. 这些转录因子受p38激酶激活调节[43]. 据推测，VDAC1的表达受p38介导的致病转录因子与VDAC1型启动子序列。虽然VDAC1的表达调控机制尚不清楚，但这些发现表明VDAC1可能通过组装VDAC1–IP3R1复合物在ER-mitochondria接触中发挥关键作用。众所周知，线粒体钙吸收可通过MAM的形成加速，通过IP3R1–VDAC1偶联将钙从内质网转移到线粒体。过量钙内流导致柠檬酸循环酶和ATP合成酶过度激活，导致线粒体活性氧累积和细胞衰老[15]. 以前的报道表明，在HFSC分化过程中，细胞内钙水平通过线粒体ATP合成酶的激活而增加，而角质形成细胞的分化受胞浆钙水平的调节[44,45]. 据我们所知，还没有研究MAM形成和线粒体钙积累对DPC衰老的影响。值得注意的是，mAR介导的信号通过线粒体钙积累诱导DPC衰老。此外，本研究首次报道C3A通过p38介导的VDAC1表达作为VDAC1–IP3R1复合物的调节因子。我们的结果还表明，DHT不会改变MCU的表达，但MCU的抑制可以逆转DHT诱导的DPC衰老。这些结果表明，MCU的表达并不决定线粒体钙进入水平，而是作为钙进入线粒体基质的被动转运蛋白。先前的研究支持这些结果，即MCU介导的线粒体钙超载参与衰老相关的表观遗传修饰，MCU抑制抑制高葡萄糖诱导的线粒体功能障碍和神经细胞老化[13,46,47,48]. 由于C3A以p38依赖性的方式抑制DHT诱导的ER线粒体接触，因此它可能是AGA药物调节线粒体钙内流以减少DPC衰老的一个很有希望的候选药物。

由于DPC衰老是AGA分泌毛囊抑制因子的标志，因此我们利用DHT诱导的AGA小鼠模型来检测C3A是否能够恢复DHT引起的毛发周期滞留。体内注射DHT不会直接影响HFSC的增殖，但DHT诱导毛乳头中DPC的衰老会抑制毛囊再生[49]. 随着DHT与睾酮比值的增加，毛囊缩小参与AGA过程。在组织学检查中，我们的结果表明，使用溶媒治疗的DHT小鼠的灯泡尺寸缩小，但使用C3A治疗的DHT-小鼠的灯泡大小与未使用DHT治疗的对照小鼠相似。通过使用Apocynin或SB203580抑制NOX和p38介导的信号传导，DHT诱导的毛发生长周期减速也得以恢复。这些结果表明，C3A介导的抗氧化剂作用和p38信号抑制与减缓AGA发病机制有关。以前的一份报告表明，在mtDNA缺乏小鼠模型中，随着衰老相关基因表达的改变，毛囊周期调控与线粒体功能障碍相关[49]. 此外，我们的结果表明，C3A降低了衰老DPC产生的抑制因子，如DKK-1、TGF-β1和IL-6。这些抑制因子阻碍了休止期向生长期的转变，从而导致毛囊周期减慢[50]. 已经有许多开发副作用较少的AGA药物的试验，如前列腺素及其拮抗剂、Wnt信号激活剂和干细胞治疗[51]. 然而，我们的研究证实了线粒体钙参与DHT诱导的DPC衰老和mAR介导的信号转导，这将是开发新药物预防AGA的靶点。因此，C3A介导的抗衰老作用将改善DHT诱导的由DPC线粒体功能障碍引起的毛囊周期延迟，并增加衰老相关毛囊周期抑制因子的表达。

结论

C3A的清除作用阻止NOX复合物引起的ROS信号传导，p38介导的信号传导是DHT通过MAM形成和线粒体功能障碍诱导DPC衰老的关键启动子（图7). 因此，我们的研究表明，C3A是一种很有前途的天然有机化合物，在AGA治疗或支持性药物治疗DHT诱导的DPC衰老方面具有令人难以置信的潜力。

图7

C3A对DHT诱导的线粒体钙内流和DPC衰老影响的示意模型。C3A有效降低DHT诱导的mtROS积累和DPC衰老。HSP27磷酸化受p38介导的信号调节，参与AR核转位。反过来，HSP27磷酸化受膜AR介导的信号调节，而C3A则对其进行抑制。值得注意的是，C3A抑制了p38介导的VDAC1表达，该表达通过VDAC1–IP3R1相互作用促进MAM的形成和钙的转移。最后，通过MAM形成过量线粒体钙进入导致DPC衰老增加，但C3A减少了DHT暴露条件下线粒体钙内流