材料
氰化物3-O(运行)-阿拉伯糖苷(C3A,#26183)和氰化物3-O(运行)-葡糖苷(C3-glu,#16406)从开曼群岛(美国密歇根州安娜堡)获得。氰化物3-O(运行)-半乳糖苷购自PhytoLab(德国Vestenbergsgreuth,#PHL89463-10MG)。获得了5α-二氢甾酮(DHT)溶液(Cerilliant,Round Rock,TX,USA,#D-073)和5α-安卓烷-17β-OL-3-ONE 3-O-羧甲基肟:BSA(甾体类,Wilton,NH,USA),#A2574-050。MitoTEMPO(#ALX-430-150-M005)购自Enzo life science(美国纽约州法明代尔市)。H2DCFDA(#D399)、MitoSOX(#M36008)、DAPI(#D1306)、牛血清白蛋白(BSA,#15561020)、ER-Tracker Red(#E34250)、Mito Tracker Green FM(#M7514)和Rhod-2 AM(#R1244)均来自Invitrogen(加利福尼亚州卡尔斯巴德)。Apocynin(#178385)、SB203580(#S8307)、Bicalutamide(#PHR1678)和蓖麻油(#259853)购自Sigma-Aldrich(德国斯特恩海姆)。TurboFect(#R0532)购自Themo Scientific(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)。Ki67(#ab16667)、IP3R1(#ab5804)和p16INK4a(#ab108349)抗体从Abcam(英国剑桥)获得。AR(#51135)、p38(#9212S)、phospho-HSP27(#2401L)和MCU(#14997S)抗体购自Cell signaling(美国马萨诸塞州丹弗斯)。从Invitrogen中获得HSP27(#MA3-015)和p21(#MA5-14949)抗体。从Santa Cruz(美国德克萨斯州达拉斯)购买了磷蛋白p38(#SC-166182)、磷蛋白ERK(#SC-7383)、磷化JNK(#SC-6254)、ERK-1(#SC-94)、JNK、Lamin A/C(#SC-20681)、VDAC1(#SC-390996)和β-肌动蛋白(#SC-47778)抗体。α-微管蛋白(#T6074)抗体来自(Sigma-Aldrich)。为了避免化学品氧化,所有材料在使用时都是新鲜制备的。所有试剂均为可用的最高纯度。
细胞培养
DPC在Promocell提供的毛囊毛乳头细胞生长培养基(含补充剂)中培养,该培养基补充有1%的青霉素-链霉素溶液(Gibco,Grand Island,NY,USA)。我们使用表达AR和对DHT反应的DPC。细胞生长在60 mm培养皿、100 mm培养皿或96 well培养皿(美国纽约州科宁市)中的培养箱(37°C,CO)中25%,空气95%)。当细胞达到80%融合时,用无补充培养基代替培养基饥饿24小时。24小时后,将细胞在无补充培养基中与指定的试剂孵育指定的处理时间。本研究中获得并使用了人类毛囊干细胞(HFSCs)(Celprogen,Torrance,CA,USA)。HFSCs用补充的人毛囊维持培养基(HFSC培养基,Celprogen)培养。HFSC在人毛囊扩张细胞外基质包被烧瓶(Celprogen)中培养。当HFSC达到80%的融合时,用DPC条件培养基和HFSC培养基的1:1混合液替换培养基,并培养48小时。用台盼蓝排除试验计数活细胞。
细胞内活性氧、线粒体活性氧和线粒体钙的测定
线粒体超氧化物和钙的水平由Cytoflex(美国佛罗里达州贝克曼·库尔特)测量,如下所示。将胰蛋白酶化的DPC与MitoSOX(5μM)或Rhod-2(2μM)在37°C下孵育20分钟,同时避光。细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次,重悬于PBS中,并通过流式细胞术进行分析。结果是通过比较高荧光强度的细胞百分比得出的。用H2DCFDA染色法测定细胞内ROS水平。用PBS清洗细胞,并在37°C培养基中的1μM H2DCFDA中培养30分钟。用Cytoflex分析胰蛋白酶化细胞。
衰老相关β-半乳糖苷酶活性测定
按照实验设计处理DPC,并用PBS清洗两次。细胞在室温下用4%多聚甲醛(PFA,Lugen Sci,Bucheon,Korea)固定10分钟,然后用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)(Sigma-Aldrich,#CS0030)染色液在37°C无CO的条件下培养12小时2用倒置显微镜(尼康Eclipse TS100;日本东京尼康)观察SA-β-gal阳性细胞呈蓝色,并计算SA-β-gal阳性细胞的平均百分比。
生长因子抗体阵列
通过与RayBiotech C系列人生长因子抗体阵列C1试剂盒AAH-GF-1(RayBiotech,Norcross,GA,USA)的膜孵育,分析培养条件培养基中生长因子的含量。将膜在封闭缓冲液中培养30分钟,然后在4°C下用条件培养基培养过夜。然后用洗涤缓冲液洗涤膜五次,并在室温下用生物素结合抗体培养2小时。然后,用洗涤缓冲液洗涤膜五次,并用辣根过氧化物酶结合链霉亲和素培养2小时。洗涤后,使用化学发光成像系统,通过增强化学发光试剂检测人类生长因子。用斑点的相对光密度进行分析,并用阳性对照进行归一化。用于生长因子抗体阵列的抗体列在附加文件中1:表S1。
蛋白质印迹和亚细胞分离
用蛋白酶抑制剂混合物将细胞溶解到RIPA缓冲液中,并在冰上培养30分钟。通过在4°C下以12000 rpm离心20分钟来降低细胞裂解物。降速后,使用Pierce BCA蛋白质分析试剂盒(Thermo scientific,Waltham,MA,USA)在562 nm处测定蛋白质浓度,并用SDS-PAGE(8-12%聚丙烯酰胺)分离等量的蛋白质(10μg)。通过半干式转移细胞(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)在22 V下将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上1小时。在室温下用5%的脱脂非脂牛奶(封闭级封闭剂;Bio-Rad)在1×TBST(10 mM Tris–HCl,150 mM NaCl,0.05%吐温-20)中封闭膜30分钟,并在4°C下与一级抗体孵育过夜。将膜与辣根过氧化物酶(HRP)与抗IgG二级抗体结合培养2 h,并通过ECL检测试剂盒(Bio-Rad)进行可视化。使用ChemiDoc™XRS可视化特定条带 + 系统(Bio-Read)。亚细胞分离用于分离胞浆和核蛋白。细胞在100 mm培养皿中培养,并用指定的试剂处理。为了制备细胞溶质和细胞核分馏样品,使用了EzSubcell亚细胞分馏/提取试剂盒(日本东京Atto,#WSE-7421)。根据制造商的说明制备用于western blot分析的细胞质和核样品。α-微管蛋白和层粘连蛋白A/C分别用作细胞溶质和核蛋白标记物。
AR转录活性测定
DPC生长在96孔黑板中,并根据制造商的说明(荷兰文洛市齐亚根,#CCS-1019L)用TurboFect转染试剂(Thermo-scientific,#R0532)转染Cignal雄激素受体报告剂(200 ng)。细胞生长至80%汇合,并在暴露于DHT(100 nM)之前用C3A(1μM)预处理。按照制造商的指南,使用荧光素酶报告分析系统(美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加,E1910号),对Victor 3多标签板阅读器(美国马萨诸塞州波士顿,PerkinElmer)中的萤火虫/雷尼拉荧光素酶活性进行分析。
实时定量PCR
用DHT或载体处理细胞24小时。然后用PBS洗涤细胞两次,并用含有50×二硫苏糖醇(DTT)溶液的缓冲液RL溶解细胞。根据制造商的说明,使用RNA提取试剂盒(日本塔卡拉,#9767)提取总RNA。使用Maxime RT预混料试剂盒(iNtRON,Sungnam,韩国)对0.5μg总RNA进行逆转录PCR(RT-PCR)。使用Rotor gene Q设备(Corbett Research,Cambridge,UK)和TB Green Premix Ex Taq(TaKaRa,#RR420A)分析靶基因的相对mRNA表达水平。通过对PCR产物的检测和熔融曲线的分析,验证了实时定量PCR引物的特异性、效率和保真度。引物序列列在附加文件中1:表S2。
免疫细胞化学
细胞在直径为35 mm的共聚焦培养皿中培养(SPL,韩国首尔),并用4%PFA固定在PBS中,用0.1%(v/v)的Triton X-100渗透5分钟,并在每个步骤用PBS洗涤3次5分钟。用5%的正常山羊血清(NGS,Vector Lab,Burlingame,CA,USA)在PBS中封闭细胞30分钟。在室温下,将抗-AR抗体在PBS中的5%(v/v)NGS中稀释4 h。用PBS洗涤三次5 min后,在室温下用Alexa Fluor 555次级抗体(Invitrogen)培养细胞1 h,并用DAPI(Invit罗gen)进行复染。用Andor SRRF系统(英国阿宾顿牛津仪器公司)对细胞进行可视化。为了分析ER-Mitochondric接触,用C3A和DHT处理细胞24小时。用PBS洗涤细胞三次后,将细胞与Mito Tracker绿色(200 nM)和ER Tracker(200 nM)在无补充培养基中在37°C下孵育20分钟,并用DAPI对细胞核进行染色。
小干扰RNA(siRNA)转染
将DPC培养至80%的融合率,并用预先设计的靶向siRNA转染细胞24小时应收账或VDAC1型根据制造商的协议,使用TurboFect试剂(Thermo Scientific)从BIONEER(韩国大田)或非靶向(NT)siRNA作为阴性对照(25 nM)获得。本研究中使用的siRNA序列列于附加文件中1:表S2。
酶联免疫吸附试验
根据供应商的协议,使用人类DKK-1量化因子ELISA试剂盒(研发系统,明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国,#DKK100B)对DPC条件培养基中的DKK-1进行定量。DPC培养至80%汇合,然后用DHT处理。在− 80°C。3000离心后克用上清液进行ELISA检测5分钟。使用人类IL-6(LabisKOMA,韩国首尔,#K0331194)和TGF-β1(LabisKOMA,韩国,首尔,#K0332110)ELISA试剂盒测量DPC条件培养基中的IL-6和TGF--β1浓度。
原位近贴结扎试验
使用Duolink原位检测VDAC1/IP3R1相互作用®根据供应商的协议,现场红色启动试剂盒老鼠/兔子(Sigma-Aldrich,#DUO92101)。固定细胞,应用近端结扎分析(PLA)探针、抗VDAC1和抗IP3R1抗体。然后,添加次级抗体。如果抗体很接近(< 40 nm),它们结扎在一起。补充聚合和放大溶液以放大闭合圆的信号(红色),并通过SRRF显微镜进行观察。用DAPI对细胞核进行复染。
动物研究的实验设计
所有动物实验均按照《国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》进行,并获得首尔国立大学动物护理和利用委员会(SNU-200916-6-1)的许可。对适应1周的7周龄雄性C57BL/6小鼠(ORIENT,Seongnam,Korea)在第1、5和13天腹膜内给予溶于玉米油的DHT(1mg/天)。在第一次注射DHT后的第二天,所有小鼠通过腹腔注射阿法沙龙(40 mg/kg)和木聚嗪(10 mg/kg)进行麻醉。用剪刀给老鼠剃毛,用脱毛膏脱毛。小鼠背部皮肤出现生长期。将小鼠分为五组。制备C3A(500μM)、Apocynin(100 mM)和SB203580(1 mM),并以7:3的比例溶解在蓖麻油(Sigma-Aldrich,#259853)和乙醇的混合物中。每2天对脱毛的皮肤进行一次局部治疗。在第7天、第11天、第15天和第19天,用数码相机在20cm的距离处拍摄小鼠背部皮肤和毛发的生长状态。第21天,处死所有小鼠以获取皮肤组织样本。
苏木精和伊红(HE)染色和免疫组织化学
为了评估皮肤厚度和毛发再生,在脱毛21天后采集皮肤样本。样品在4%PFA中固定24小时,然后在PBS中溶解的30%蔗糖中脱水1天。使用低温恒温器(Leica Biosystems,Nussloch,德国)获得30μm厚的纵向切片,然后用HE染色。用4%PFA孵育组织5分钟,用自来水冲洗5分钟。组织用苏木精染色3分钟,并用自来水冲洗5分钟。接下来,将组织与含有1%HCl的70%酒精孵育5 s,并与曙红溶液孵育30 s。将载玻片分别置于95%、100%乙醇和二甲苯中三次,每次3 s。用薄盖玻片覆盖纸巾(Paul Marienfeld GmbH&Co.KG,Lauda-Konigshofen,德国)。使用Slideviewer软件(3DHISTECH,匈牙利布达佩斯)测量皮肤厚度和毛乳头直径。使用表皮和真皮之间的厚度与整个皮肤厚度的比值来测量真皮比率。用抗Ki67抗体进行免疫组化。细胞核用DAPI染色。免疫荧光图像由共焦显微镜捕获(卡尔蔡司,德国Oberkochen,#LSM 800)。组织学评估以盲法进行。
统计分析
所有定量数据均表示为平均值 ± 平均值标准误差(SEM)。使用SigmaPlot 12软件分析数据。动物研究的样本量由SigmaPlot 12软件确定。使用双尾Student t检验对两个实验组进行比较。使用单向方差分析比较多个实验组的平均值,然后使用Student–Newman–Keuls检验进行多重比较。的p值< 0.05被认为具有统计学意义。