Altered Calcium Influx Pathways in Cancer-Associated Fibroblasts

doi:10.3390/biomedicines9060680

.2021年6月16日；9(6):680.

doi:10.3390/生物医学9060680。

癌相关成纤维细胞钙内流途径的改变

附属公司

¹澳大利亚昆士兰大学药学院，昆士兰布里斯班，昆士兰州4102。
²澳大利亚昆士兰大学翻译研究所马特研究所，昆士兰布里斯班，邮编4102。
^三昆士兰大学医学院临床研究中心，澳大利亚昆士兰州赫斯顿，邮编4006。
⁴澳大利亚新南威尔士州利物浦市新南威尔斯大学西南悉尼临床学院，邮编：2170。
⁵澳大利亚新南威尔士州班克斯敦市班克斯敦医院外科，邮编：2200。
⁶澳大利亚新南威尔士州2170利物浦英格姆应用医学研究所肿瘤医学组。
⁷昆士兰州病理科，澳大利亚昆士兰州赫斯顿皇家布里斯班女子医院，邮编4029。

PMID： 34208665
预防性维修识别码： PMC8234491号
内政部： 10.3390/生物医学9060680

癌相关成纤维细胞钙内流途径的改变

弗朗西斯科·萨德拉斯等。生物医学. 2021.

.2021年6月16日；9(6):680.

doi:10.3390/生物医学9060680。

附属公司

¹澳大利亚昆士兰大学药学院，昆士兰布里斯班，昆士兰州4102。
²澳大利亚昆士兰大学转化研究所Mater Research，布里斯班，邮编：4102。
^三澳大利亚昆士兰大学医学院临床研究中心，昆士兰赫斯顿4006。
⁴澳大利亚新南威尔士州利物浦市新南威尔斯大学西南悉尼临床学院，邮编：2170。
⁵澳大利亚新南威尔士州班克斯敦市班克斯敦医院外科，邮编：2200。
⁶澳大利亚新南威尔士州2170利物浦英格姆应用医学研究所肿瘤医学组。
⁷昆士兰州病理科，澳大利亚昆士兰州赫斯顿皇家布里斯班女子医院，邮编4029。

PMID： 34208665
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摘要

癌相关成纤维细胞（CAF）是肿瘤微环境的重要组成部分，与疾病进展有关。癌症生物学中两个悬而未决的问题是CAF是如何产生的，以及它们如何成为治疗靶点。钙信号在肿瘤发生中也有重要作用。迄今为止，钙信号通路在CAF表型诱导中的作用尚不清楚。通过外源性转化生长因子β1（TGFβ1）刺激正常人乳腺成纤维细胞系HMF3S（HMF3S-CAF）生成CAF模型，并研究钙信号的变化。使用荧光指示剂、基因表达、基因筛选和药理学方法评估HMF3S-CAF钙信号通路的功能变化。HMF3S-CAF细胞显示钙内流途径发生功能性改变，储存操作的钙内流减少。为了支持钙信号开关，两个电压门控钙通道（VGCC）家族成员Ca_V（V）1.2和Ca_V（V）3.2，在HMF3S-CAF和患者源性乳腺CAF的子集中上调。siRNA介导的沉默和Ca的药理抑制_V（V）1.2或Ca_V（V）3.2 HMF3S细胞中CAF活化显著受损。我们的研究结果表明，VGCCs有助于TGFβ1介导的HMF3S-CAF细胞诱导以及Ca的转录干扰和药理拮抗_V（V）1.2和Ca_V（V）3.2抑制CAF诱导。这表明靶向乳腺CAF中钙信号的潜在治疗作用。

关键词：乳腺癌；钙；钙信号；癌相关成纤维细胞；商店操作的钙入口；电压门控钙通道。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
转化生长因子β1（TGFβ1）处理的HMF3S细胞中癌相关成纤维细胞（CAF）标记物的表达。在评估标记物之前，用TGFβ1（0.01、0.1、1或10 ng/mL）或溶媒对照（0 ng/mL）刺激血清饥饿的HMF3S细胞48小时。(一)与所示浓度的载体相比，TGFβ1治疗增加了CAF相关基因成纤维细胞活化蛋白-α（FAPα）、血小板衍生生长因子受体-β（PDGFRβ）、纤维连接蛋白和tenascin-C的mRNA水平。(b条)代表性免疫印迹和密度测定显示，与1和10 ng/mL TGFβ1的载体相比，α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）蛋白的诱导显著。(**c（c）**)与溶媒对照组相比，具有代表性的免疫荧光图像显示αSMA蛋白（红色）上调。细胞核（DAPI）染色也显示出来（蓝色）。(一,b条)数据表示为三个独立实验的平均值±SD；*第页<单因素方差分析后的事后Dunnett多重比较试验显示，治疗效果显著。

图2
胞浆钙的评估²⁺TGFβ1处理的HMF3S细胞中存储操作钙进入（SOCE）反应期间的水平。(一)在成像之前，用TGFβ1（0.01、0.1、1或10 ng/mL）或溶媒对照（0 ng/mL）处理血清饥饿的HMF3S细胞48小时。为了评估SOCE的潜在重塑，用1,2-双（邻氨基苯氧基）乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸（BAPTA，100μM）依次处理细胞，以螯合细胞外钙²⁺，环己酸（CPA，10μM）耗尽细胞内钙²⁺门店和Ca²⁺（0.6 mM），以评估存储操作的钙内流。钙示踪代表相对胞浆钙水平（[Ca²⁺]_中青旅)作为相对于基线的平均荧光。定量(b条)曲线下面积（AUC；峰值1）(**c（c）**)AUC（峰值2），以及(天)AUC比率（峰值2/峰值1）。在(b条–天)数据表示为三个独立实验的平均值±SD。*第页<单因素方差分析后的事后Dunnett多重比较试验显示，治疗效果显著。

图3
钙通道和通道调节因子在CAF中有差异表达。(一,b条)在分离RNA之前，用TGFβ1（0.01、0.1、1或10 ng/mL）或载体对照物（0 ng/mL）刺激血清饥饿的HMF3S细胞48小时。SOCE通道和通道调节因子的mRNA水平；(一)Orai1、基质相互作用分子1和2（STIM1和STIM2）以及(b条)电压门控钙通道（VGCC）；钙_V（V）1.2，钙_V（V）2.1，钙_V（V）3.2，使用定量RT-PCR进行评估。数值表示为相对于车辆控制的折叠变化。数据表示为三个独立实验的平均值±SD；*对<单因素方差分析后的事后Dunnett多重比较试验显示，治疗效果显著。(**c（c）**)配对患者CAF和正常乳腺成纤维细胞（NFs）中选定钙通道和通道调节器的mRNA比率。值±2表示在CAF或NF样本中均未检测到mRNA。

图4
钙的作用_V（V）1.2和Ca_V（V）3.2沉默TGFβ1诱导的HMF3S细胞CAF标记表达。(一)具有代表性的免疫印迹和密度测定数据显示，在siCa存在下αSMA蛋白表达显著下调_V（V）1.2和siCa_V（V）3.2. (b条)与载体相比，TGFβ1治疗增加了CAF相关基因FAPα、PDGFRβ、纤维连接蛋白和tenascin-C的mRNA水平。硅钙石_V（V）1.2和siCa_V（V）3.2减少FAPα、纤连蛋白和tenascin-C的诱导，而siCa抑制PDGFR-β的诱导_V（V）1.2但不是siCa_V（V）3.2. 数据表示为三个独立实验的平均值±SD；*第页<单因素方差分析后的事后Dunnett多重比较试验显示，治疗效果显著。

图5
药物抑制TGFβ1诱导HMF3S细胞中αSMA表达。使用(一)尼莫地平，以及(b条)ML218。典型的免疫印迹和密度测定数据显示，3 nM和10 nM尼莫地平以及10 nM ML218显著下调αSMA蛋白。数据表示为四个独立实验的平均值±SD*第页单因素方差分析后的事后Dunnett多重比较试验显示，治疗效果显著。

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