摘要
癌细胞向局部和远处的扩散取决于恶性细胞及其周围的细胞和非细胞成分(统称为肿瘤微环境)之间复杂而难以理解的相互作用。肿瘤微环境中最丰富的细胞类型之一是成纤维细胞,它被局部来源的线索(如TGF-β1)破坏,并获得支持肿瘤细胞侵袭和转移的改变的异质表型(癌相关成纤维细胞(CAF))。针对肿瘤间质的新治疗方法的开发因对CAF发生的机制了解不足而受到阻碍。在这里,我们研究了微RNA对实验性衍生CAF形成的贡献,并将其与从肿瘤衍生的CAF中观察到的变化相关联。将原代正常人成纤维细胞暴露于TGF-β1导致获得肌纤维母细胞CAF-样表型。这与miR-145的表达增加有关,miRNA预测生物信息学以TGF-β信号通路的多个成分为靶点。miR-145在口腔癌CAF中也过表达。miR-145的过度表达阻断了TGF-β1诱导的肌纤维母细胞分化,并将CAF恢复为正常的成纤维细胞表型。我们得出结论,miR-145是CAF表型的关键调节因子,在负反馈回路中起作用,抑制肌纤维母细胞性状的获得,这是CAF的一个关键特征,与不良疾病结局相关。
介绍
越来越明显的是,恶性细胞与肿瘤微环境中的细胞和其他成分之间的相互作用在疾病转归中起着关键作用(1). 成纤维细胞是肿瘤微环境中数量最多的细胞之一,通过重塑细胞外基质(ECM)和分泌一系列可溶性因子来调节癌细胞行为和宿主免疫反应,这些可溶性因子能够通过细胞自主和从属机制与邻近的细胞受体相互作用(2). 肿瘤周围成纤维细胞(统称为癌相关成纤维细胞;CAF)的表型复杂多样,但某些CAF特征与癌细胞播散和预后不良密切相关(三). 其中最具特征的是存在“肌纤维母细胞”CAF;表达α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)的细胞,至少在表面上类似于愈合伤口中暂时发现的肌成纤维细胞(4). 肌纤维母细胞CAF是一种可收缩的分泌细胞,可产生改变的ECM,通常被认为有助于支持癌细胞侵袭和转移的细胞外环境(2). αSMA-富含CAF的存在与许多癌症的不良预后相关,提示在疾病进展中起着关键作用(三,5–7). 肌纤维母细胞CAF的来源存在争议,但至少有一些可能是由肿瘤细胞和肿瘤微环境中的炎症细胞释放的TGF-β1等信号引起的静止成纤维细胞的分化(或“激活”)引起的(8).
尽管有大量数据支持CAF在促进肿瘤转移中的作用,但对常驻基质成纤维细胞产生CAF的机制知之甚少。在这里,我们应用了生物信息学鉴定主要在间充质细胞中发现的microRNA miR-145的方法(9),被认为能够靶向TGF-β1信号通路的成分,并检测了这种微小RNA对正常成纤维细胞、肌成纤维细胞和CAF表型的影响。miR-145的表达是由正常成纤维细胞暴露于TGF-β1诱导的,并且在CAF中也升高。miR-145的过度表达抑制了肌纤维母细胞特性和基质-上皮相互作用的发展,表明肌成纤维细胞和CAF中存在miR-145/TGF-β负反馈环。这表明有可能利用这种疗法来降低基质成纤维细胞的促肿瘤特性。
材料和方法
常规组织培养
所有细胞常规培养在Dulbecco改良的Eagle's培养基(DMEM)中,补充10%(vol/vol)胎牛血清(FBS)和2 mM我-谷氨酰胺,37°C时不含抗生素,CO含量为5%(vol/vol)2原代成纤维细胞在3–9代内使用。对于TGF-β1治疗,将口腔成纤维细胞接种在6孔板中,每孔25万个细胞,让其在血清饥饿24小时之前沉淀,然后在补充有2 mM的无血清DMEM中用5 ng/ml TGF-我-谷氨酰胺。
初级正常口腔成纤维细胞(NOF)是从查尔斯·克利福德牙科医院接受智齿拔除术的知情同意患者中分离出来的(谢菲尔德研究委员会伦理许可09/H1308/66)(10). 在引入当前道德要求(CAF1-10)之前,从坎皮纳斯大学(CAFC)和格拉斯哥大学(University of Glasgow)的同意患者的口腔鳞状细胞癌(OSCC)中分离出CAF。CAF2、CAF4、CAF8、CAF9和CAF10是从已知含有肿瘤源性SCC角质形成细胞的GU-SCC(遗传不稳定SCC)活检中获得的,而GS-SCC CAF(遗传稳定SCC)、CAF1、CAF3、CAF5、CAF6和CAF7是从GS-SCC活检中获得的(11–13). 除NOF培养物外,正常人口腔成纤维细胞培养物NHOF-1和NHOF-5来自斯里兰卡坎迪佩里丹亚大学(12). 人类初级皮肤成纤维细胞HDF1(Promocell)和HDF2(09/H1308/66)分别是西蒙·沃尔博士和希拉·麦克尼尔教授赠送的礼物。H357,一种从舌鳞状细胞癌分离的细胞系(14)从ATTCC获得,并通过10代内细胞的卫星串联重复序列分析确认细胞身份。
成纤维细胞分离
如前所述,从口腔活检中分离出原代成纤维细胞(10)在4°C下用0.1%(wt/vol)Difco胰蛋白酶(BD Biosciences)培养过夜,去除角质形成细胞,然后用手术刀刮取上皮。将剩余组织细碎,并在37°C下用胶原酶[0.5%(vol/vol)]在5%(vol/vol)CO下酶消化2一夜之间。胶原酶悬浮液以2000 rpm离心10分钟,以回收NOF。NOF最初用含有0.625µg/ml两性霉素B、100 IU/ml青霉素和100µg/ml链霉素的常规培养基培养,然后去除抗生素用于实验。
或者,对于由E.Ken Parkinson教授(英国QMUL)提供的成纤维细胞,组织样本被精细切割,用FBS清洗,并在37°C的干燥环境中培养30–40分钟。添加少量DMEM加10%(vol/vol)FBS(~2 ml)覆盖组织,然后将细胞作为外植体在37°C下生长3天。成纤维细胞在常规培养基[DMEM加10%(vol/vol)FBS和2 mM中选择性培养我-谷氨酰胺],其中培养物含有角质形成细胞;通过添加0.02%(vol/vol)EDTA 30 s,然后添加等量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)去除这些物质(14)).
对于由R Coletta教授(巴西坎皮纳斯大学)提供的成纤维细胞,用PBS清洗组织样品三次,将其精细切割并放置在37°C、5%(vol/vol)CO湿化空气中的1ml DMEM加10%胎牛血清和抗生素中2每隔2-3天更换培养基,观察细胞生长直至汇合。将细胞胰酶化并低密度接种以分离单个肌成纤维细胞克隆(15).
转染
使用Opti-MEM(Life Technologies)中的寡核苷酸前体药物(前体R-143、前体R-145或阴性前体药物;50 nM)和siRNA(云芝siRNA和阴性siRNA;50 nM;all Life Technols),将合成的寡核苷酸预体药物转染到初级口腔成纤维细胞中。在TGF-β1治疗前后进行转染。条件培养基(无血清DMEM补充2 mM我-24小时后收集谷氨酰胺,用于随后的跨阱迁移分析。
免疫细胞化学
为了观察αSMA应力纤维,将25万成纤维细胞接种在六孔板的玻璃盖玻片上。处理/转染后,用甲醇固定10分钟,用4mM脱氧胆酸钠透化,并与FITC缀合的抗人αSMA小鼠抗体(克隆1A.4;1:100;Sigma-Aldrich Cat#F3777,RRID:AB_476977)在4°C下孵育12小时,随后以2.5%(wt/vol)阻断非特异性结合位点牛血清白蛋白在PBS中30分钟。用PBS洗涤两次盖玻片,使用含有4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI;Vectorshield)的安装介质安装,使用Ziess Axioplan 2荧光显微镜在×40下观察,并使用Proplus 7.0.1图像软件成像。
收缩性测定
如前所述制备成纤维细胞填充的胶原蛋白凝胶(16)使用暂时转染或未经修饰的正常人口腔原代成纤维细胞,如个别图形图例所述。
定量实时PCR
根据制造商的说明,使用RNeasy(Qiagen)试剂盒从颗粒成纤维细胞中提取总RNA。使用纳米滴1000分光光度计(Thermo)定量RNA。根据制造商的协议,使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)逆转录RNA(100 ng)。使用成熟miR-143、miR-145和小核RNA RNU48的特异Taqman逆转录microRNA探针/引物,从10 ng RNA逆转录特定成熟microRNA(应用生物系统)。随后使用总的或特异的miRNA-衍生cDNA作为SYBR green或Taqman实时定量PCR扩增的模板(7900HT快速实时PCR系统,Life Technologies)。用于SYBR分析(Sigma)的引物序列如下:U6正向(F)5′CTCGCTTCGGCACCAA3′,U6反向(R)5′AACGTTCACGAATTCGT3′,αSMA F 5′GAAGAGACAGCAGCACTG3′,αSM A R 5′TCCCCACCACCAC3′,带外结构域A的纤连蛋白-1(FN1-EDA)5′TGGAACCCTCCACATT3′,胶原蛋白1A(COL1A1)F 5′GTGGCCATCCAG CTGACC3′,COL1A1 R 5′AGTGGTAGGTGGTTCTGGGAG3′结缔组织生长因子(CTGF)F 5′GGGAAATGCTGCGAGGAGT 3′,CTGF R 5′AGGTCT TGGAACAGGCGCTC 3′,基质金属蛋白酶2(MMP2)F 5′AATAATTC CGCTTCCAGGGCACATCC 3′,MMP2 R 5′TTATTGCGGTCGTAGTCCTCCAGTGGT 3′。Versican异构体特异性Taqman探针(应用生物系统)用于评估V0和V1 Versican异构体转录物的表达。使用ΔΔCT方法计算相对表达(17)归一化为内源性对照U6(SYBR绿色)或RNU 48(Taqman)。所有qPCR均根据MiQE最佳实践指南进行(18).
免疫印迹
总蛋白裂解物在放射免疫沉淀分析缓冲液中制备,该缓冲液补充有完整的微型蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche)和苯甲酸酶(Sigma)。蛋白质裂解物(20–30µg)在Tris-醋酸盐缓冲液(Life Technologies)中通过3–8%(vol/vol)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离。通过湿转移或iBlot干转移(Invitrogen)将蛋白质转移到硝化纤维素膜(Millipore)上,并在封闭溶液[5%(wt/vol)奶粉和3%(wt/vol)牛血清白蛋白在含有0.05%(vol/vol)吐温20(TBS-T)的Tris缓冲盐水(TBS)中培养1h。小鼠单克隆抗人αSMA(克隆1A4;Sigma–Aldrich Cat#A2547,RRID:AB_476701)、山羊多克隆抗人云芝(研发系统)或单克隆兔抗人GAPDH(Sigma-Aldrich Cat#G9295,RRID:AB_1078992)抗体在封闭溶液中稀释(1:1000),并在4°C下与膜孵育过夜。用TBS-T清洗膜3×5 min,然后用辣根过氧化物酶结合二级抗体(封闭溶液中1:3000)在室温下培养1 h。在TBS-T中清洗膜3×10 min,并使用增强化学发光(Pierce)进行显影。
迁移和侵入分析
从转染和TGF-β1(5 ng/ml)处理的成纤维细胞收集的条件培养基在2500℃下离心克将上清液置于24孔板的孔底部。将之前血清饥饿24小时的H357细胞重新悬浮在补充了DMEM的0.1%(wt/vol)牛血清白蛋白中我-谷氨酰胺(2 mM)并以10万个细胞/孔的密度接种到跨阱室(BD Biosciences)的顶部。Transwell涂上Matrigel(300μg/ml;Corning)以评估细胞侵袭。细胞在37°C和5%(vol/vol)CO下迁移36 h2在1 mg/ml丝裂霉素C的存在下,抑制细胞增殖。对Transwell腔室进行擦洗,以去除腔室顶部的非迁移细胞,并将其固定在甲醇中10分钟。迁移细胞用0.1%(wt/vol)结晶紫染色,并在每个Transwell的四个随机选择的视野下使用光学显微镜以40倍放大率成像。然后使用ImageJ对迁移的细胞进行计数。
统计分析
一对双尾学生的t吨-检验用于检验统计显著性。A Mann–惠特尼U型-该测试(在GraphPad Prism 6中进行)用于评估NOF和CAF中差异基因表达的重要性。提供的所有数据均为n个=3,除非另有说明。N个=3是指来自相同成纤维细胞菌株的生物复制;然而,每个实验都在至少两个菌株中重复进行,为了简洁起见,选择并显示了一个具有代表性的图形。
结果
TGF-β1刺激原癌性肌成纤维细胞转分化
利用肌成纤维细胞表型的几个已建立的标记物检测TGF-β1诱导原代人成纤维细胞转分化的能力(19–23). 用TGF-β1(5 ng/ml)治疗口腔成纤维细胞导致αSMA、云芝聚糖(VCAN,V0亚型)和FN1-EDA转录物的表达随时间增加(图1a-c)αSMA蛋白水平相应增加,富含αSMA的应力纤维出现(图1d和e(电子)). 这与I型胶原晶格收缩能力增加有关(图1f)与之前的报告保持一致(22). TGF-β1处理的口腔成纤维细胞中MMP-2的表达也显著升高(图1g). 转化生长因子β诱导的肌成纤维细胞条件培养基比未经处理的成纤维细胞培养基促进更多的癌细胞迁移和侵袭(图1h和我). 值得注意的是,并非所有来自不同患者的原代成纤维细胞的不同培养物对TGF-β1的反应都相同(补充图1,网址为致癌作用在线)。
图1。
TGF-β1诱导人原代成纤维细胞的肌纤维母细胞特征。原代成纤维细胞(一–c(c):NOF2,d日:NOF3,e(电子)–(f):NOF2,克–我如图所示,用TGF-β1(5 ng/ml)或无血清DMEM处理24–96 h。提取RNA,逆转录并进行qPCR,以确定αSMA(a)、VCAN V1(b)或FN1-EDA(c)的转录水平。制备总细胞裂解物并对αSMA(d)进行免疫印迹。在TGF-β1治疗48小时后,将细胞固定在甲醇中,并使用FITC-偶联的抗αSMA抗体(e)观察αSMA。与无血清DMEM处理的对照组(f)相比,用TGF-β1处理48小时的成纤维细胞收缩胶原蛋白1的能力进行了检测。从暴露于TGF-β1 48 h的细胞中收集的条件培养基用于跨阱分析,以评估H357癌细胞通过Matrigel(h)的迁移(g)或侵袭****P(P)<0.0001时***P(P)<0.001**P(P)使用配对的双尾学生的t吨-测试。n个=3,上述成纤维细胞株的生物复制。
MicroRNA-145在肌成纤维细胞转分化过程中上调
为了研究TGF-β诱导原代成纤维细胞获得促肿瘤、肌纤维母细胞表型的分子机制,我们进行了生物信息学使用包括DIANA在内的多种在线算法,对TGF-β1信号通路靶成分预测的miRNA进行分析(http://diana.cslab.ece.ntua.gr/). 使用该方法鉴定的候选miRNA之一miR-145在文献中被预测或功能性证明在TGF-β1途径中有许多靶点或假定靶点(图2a)在许多分析的NOF培养物中,TGF-β1治疗使其上调(图2b)但不同文化之间的反应具有异质性。在确定了miR-145在成纤维细胞对TGF-β1反应中的假定作用后,我们接下来分析了10个NOF和10个CAF(从口腔鳞状细胞癌患者中分离)中成熟miR-145的表达水平(12)). miR-145在CAF中的表达显著高于正常成纤维细胞(图2c).
图2。
miR-145在TGF-β信号通路中具有多个假定靶点,并受TGF-α1上调。使用DIANA分析miR-145的潜在靶点揭示了TGF-β1信号通路中的一些假定靶点以及与肌成纤维细胞分化相关的其他基因(一). NOF(NOF1-4)在暴露于TGF-β1(5 ng/ml)或载体24 h之前,血清饥饿24 h(b条). 用常规qPCR分析10种独立NOF培养物(NOF1-10)中miR-145的水平(c(c))和4种独立的CAF培养物(CAF1-10)(c(c)). ****P(P)< 0.0001, ***P(P)< 0.001, **P(P)< 0.01 (b条,c(c))使用成对的双尾学生t吨-测试和Mann–WhitneyU型-测试(c(c)).N个=3,生物复制(b条).
miR-145抑制肌成纤维细胞对TGF-β1的分化反应
为了检测miR-145对肌成纤维细胞分化的影响,将功能上模拟成熟miR-145的合成miRNA或对照的非靶向miRNA转染到原代口腔成纤维细胞中,并检测其对成肌纤维细胞表型标记物的影响。miR-145的过度表达(图3a)导致TGF-β1诱导αSMA转录水平的能力几乎完全丧失(图3b)免疫印迹法测定TGF-β诱导的αSMA蛋白水平的降低(图3c). 在没有TGF-β1的情况下,miR-145过度表达导致αSMA的基础水平没有变化。miR-143的过度表达,这是一种与miR-145共同表达的miRNA,是双顺反子簇的一部分(24),导致αSMA转录物的表达略有下降,但对αSMA蛋白水平没有影响(图3b和c(c)). 为了与这些发现保持一致,我们观察到与对照组相比,成纤维细胞在TGF-β1作用下收缩胶原凝胶的能力有适度但显著的降低(图3d). 使用皮肤成纤维细胞获得了关于αSMA表达的类似结果,表明miR-145的作用不是组织特异性的(图3e和(f)).
图3。
miR-145过表达抑制肌成纤维细胞分化。用50 nM合成前体R-143、前体R-145或对照、非靶向前体R(阴性前体R)转染增殖NOF(NOF1),孵育24 h,然后再暴露于TGF-β1(5 ng/ml)或无血清DMEM对照48 h。提取RNA,并对所得cDNA进行qPCR,以检测成熟miR-145(一)或αSMA(b条). 对所述转染细胞的总细胞裂解蛋白进行αSMA免疫印迹(c(c)); 将额外转染的细胞(NOF2-4;数据合并)接种到I型胶原凝胶中,并测定其在TGF-β1(5 ng/ml)或载体对照治疗48小时后收缩凝胶的能力(d日). 如上所述,用miR-145转染人真皮原代成纤维细胞(HDF)并用TGF-β1处理。通过qPCR评估αSMA转录水平(e(电子))免疫印迹法检测蛋白质((f)). ****P(P)< 0.0001, ***P(P)< 0.001, **P(P)<0.01使用成对双尾学生t吨-测试。全部n个=3,上述成纤维细胞株的生物复制。
接下来我们研究了miR-145影响ECM生成的能力,其改变与肌纤维母细胞CAF有关(19,22,23,25). 研究发现,miR-145的异源过表达显著降低了来自编码ECM成分的许多基因的转录物的表达,包括FN1-EDA、CTGF、COL1A1、MMP2以及口腔成纤维细胞中表达的VCAN的两种变体(VCAN V0和V1),并阻断这些基因对TGF-β1的上调反应(图4a-f). 通过免疫印迹法测定,在蛋白质水平上也观察到VCAN的下调(图4g)敲除水平接近VCAN特异性siRNA(图4g). miR-143的过度表达,以前报道调节VCAN的表达(26),对VCAN转录或蛋白质水平没有影响(图4g). miR-145的过度表达减弱了肌成纤维细胞以旁分泌方式刺激癌细胞迁移和侵袭的能力(图4h和我). 皮肤成纤维细胞也获得了miR-145对成纤维细胞表型的类似作用(图4j和k个).
图4。
miR-145通过成纤维细胞改变ECM沉积。增加NOF[(一–(f)):NOF1(克):NOF4(小时–我):用50 nM合成预混物R-145或对照、非靶向预混物(阴性预混物)转染NOF1],孵育24 h后再暴露于TGF-β1(5 ng/ml)或无血清DMEM对照中48 h。提取RNA,并对FN1-EDA(a)、CTGF(b)、COL1A1(c)、MMP2(d)进行qPCR检测以及VCAN转录物V0和V1(e,f)。在用miR-145或非靶向miRNA、靶向VCAN的siRNA或非靶点siRNA处理TGF-β1之前,根据所述转染或转染24小时的细胞中的总细胞裂解物蛋白被免疫印迹用于VCAN,并被重制用于GAPDH作为负荷对照(g)。将转染的NOF培养24小时后收集条件培养基,并用TGF-β1处理48小时。将条件培养基添加到跨孔分析的下室之前,将培养基更换为新鲜的低血清培养基,将还原性血清培养基中的H357细胞添加到插入物的顶部。计算穿过插入物的细胞数(h)。插入(i)中的Matrigel遵循相同的程序。如上所述,用miR-145转染人真皮原代成纤维细胞(HDF)并用TGF-β1处理。通过qPCR评估FN-EDA1转录水平(j个)免疫印迹法检测云芝蛋白(k个). αSMA和β-肌动蛋白印迹如(k个)与中的相同图3f,用于比较****P(P)< 0.0001, ***P(P)< 0.001, **P(P)<0.01使用成对双尾学生t吨-测试。全部n个=3,上述成纤维细胞株的生物复制。
miR-145调节CAF表型
在确定miR-145抑制NOF中CAF样肌纤维母细胞表型获得的能力后,我们接下来检查了其在CAF中的作用。CAF中miR-145的过度表达导致基础和TGFβ诱导的αSMA、COL1A1和FN1-EDA转录水平降低(图5a-c). 正如在正常成纤维细胞中观察到的那样,miR-145过度表达能够抑制所有分析的CAF培养物中TGF-β诱导的αSMA水平(图5a和补充图2a-c,网址为致癌作用在线),并降低基础和TGF-β诱导的VCAN蛋白表达(图5d). 在所测试的四种CAF培养物中,有两种CAF中miR-145的过度表达抑制了癌细胞迁移的旁分泌刺激(图5e). 与平均NOF miR-145水平相比,所用的四种CAF培养物中的每一种都有较高的内源性miR-145-表达(补充表S1,网址为致癌作用在线)。
图5。
miR-145调节CAF表型。用50 nM合成预混物R-145或对照、非靶向预混物(阴性预混物)转染增殖CAF(CAF1),孵育24 h,然后再暴露于TGF-β1(5 ng/ml)或无血清DMEM对照48 h。提取RNA,并对所得cDNA进行αSMA的qPCR(一),COL1A1(b条)和FN1-EDA(c(c)). TGF-β1处理48 h后,制备总细胞裂解物,并对αSMA和VCAN进行免疫印迹;β-肌动蛋白作为负荷控制(d日). 将四种CAF培养物转染miR-145模拟或非靶向对照物和条件培养基,然后收集条件培养基并将其添加到跨孔分析的下室,将还原性浆液培养基中的H357细胞添加到插入物的顶部(示意图,e(电子)). 对穿过插入物迁移的细胞进行计数****P(P)< 0.0001, ***P(P)< 0.001, **P(P)<0.01使用成对双尾学生t吨-测试。全部n个=3,在上述成纤维细胞株中进行生物复制,除了(f)对每个CAF进行两次迁移分析。
为了进一步研究miR-145对CAF表型的调节,我们研究了miR-145的表达水平与内源性和TGF-β诱导的αSMA基因表达之间的可能相关性。我们发现在NOF和CAF培养物中内源性miR-145和αSMA表达之间存在显著的正相关(R(右)2= 0.7387,P(P)< 0.001;补充图3a,网址为致癌作用在线)。然而,值得注意的是,如果在回归分析中忽略了αSMA水平最高的成纤维细胞培养物,则相关性不再显著(R(右)2= 0.06846,P(P)= 0.2278). 有趣的是,CAF内源性miR-145水平与TGF-β诱导的α-SMA的大小之间也存在正相关(未达到显著性)的趋势(补充图3b,网址为致癌作用在线)。
miR-145拯救CAF表型
为了检验这些发现是否具有治疗价值,我们测试了miR-145拯救CAF表型的能力。TGF-β1处理的NOF,随后用miR-145模拟物转染,显示CAF标记物αSMA、COL1A1和FN1-EDA的表达显著降低(图6a–d)并且versican V0和V1表达显著降低(图6e和(f)). 在皮肤成纤维细胞(HDF;图6g–l). 通过RT-qPCR评估NOF和HDF中miR-145过度表达的程度(补充图4a和b条,网址为致癌作用在线)。
图6。
miR-145拯救CAF表型。增殖NOF(NOF2;一–(f))和HDF(克–我)用TGF-β1(5 ng/ml)处理48 h,然后用50 nM合成预混物R-145或对照的非靶向预混物(阴性预混物)转染,再培养24 h。提取RNA,并对所得cDNA进行αSMA(a和g)、COL1A1(c和i)、FN1-EDA(d和j)、云芝V0(e和k)的qPCR和versican V1(f和l)。在处理和转染后,从NOF和HDF中制备总蛋白裂解物,并用β-肌动蛋白负载控制(b和h)对αSMA进行免疫印迹****P(P)< 0.0001, ***P(P)< 0.001, **P(P)<0.01使用成对双尾学生t吨-测试。n个=3,上述成纤维细胞株的生物复制。
讨论
从常驻基质成纤维细胞发展CAF的分子机制尚不清楚,阻碍了基质定向治疗的发展。在此,我们确定miR-145是肌纤维母细胞CAF与静止成纤维细胞分化的关键调节因子。我们提供证据表明,与正常静息状态的口腔成纤维细胞相比,从口腔鳞癌分离的大多数CAF中miR-145水平升高,并且肌纤维母细胞CAF样表型的诱导在体外诱导miR-145表达。此外,我们发现miR-145抑制了肌成纤维细胞激活的细胞骨架和基质细胞标记物以及癌细胞迁移和侵袭的旁分泌刺激,表明miR-145-上调可能有助于限制肿瘤微环境中促肿瘤发生、肌成纤维母细胞分化。
虽然miR-145在肿瘤细胞和成纤维细胞中都有抑瘤作用(27–30)最近的两项研究表明,miR-145仅限于间充质来源的细胞,或至少在间充质起源的细胞中显著富集(9,31). 与此相一致,miR-145在包括平滑肌细胞和成纤维细胞在内的多种间充质细胞中具有功能(32–36). 在这两种细胞类型中,miR-145最常见的描述是具有促进分化的能力,尽管最近的一项研究表明,miR-148对血管平滑肌细胞表型的影响是特定的,并且miR-145s能够抑制对TGF-β1的反应,限制血管平滑肌细胞的分化(36). 这与我们的发现一致,在我们的发现中,我们观察到miR-145水平在对TGF-β1的反应中增加,但下调TGF-β1诱导的许多靶基因,从而抑制肌成纤维细胞表型的发展。与其他研究相比(33–35)然而,我们没有发现miR-145在缺乏TGF-β1的情况下具有诱导肌成纤维细胞标记物的能力;事实上,在肿瘤衍生的CAF中,miR-145可重复降低细胞骨架和基质细胞肌成纤维细胞标记物的基础水平。这些相互矛盾的结果可能是物种差异或胚胎与成人成纤维细胞使用的结果,但也表明调节TGF-β1作用的机制具有一定程度的复杂性,可能反映出需要调整对动态组织微环境的反应。值得注意的是,我们的生物信息学分析和未发表的数据(de Oliveira等(数据未显示)表明miR-145可能以其他TGF-β1相关分子的受体和信号成分为靶点,包括激活素A和骨形态发生蛋白,表明除了TGF-;我们推测,这种多效性可能与miR-145在成纤维细胞和平滑肌细胞中复杂而矛盾的功能有关。
基质成纤维细胞内的TGF-β1信号在决定成纤维细胞对局部线索(如ECM重塑)的反应中起着关键作用,因此受到多层调控(综述于(37)). TGF-β1通路的失调,如成纤维细胞中TGF-α1的过度表达和TGF-γ受体II(TGF-δRII)功能的丧失,促进邻近上皮细胞的肿瘤发生和恶性进展(38–40). 存在多种机制来调节TGF-β1信号传导,包括负反馈,以SMAD7的作用为例,SMAD7由TGF-α1诱导,但通过SMAD3/4负调控典型信号传导途径限制其下游效应(41). 我们的数据表明,miR-145通过负向调节基质成纤维细胞对TGF-β1的反应,以类似的方式发挥作用。
肌纤维母细胞分化是一个复杂的过程,受到内在和外在信号的调节。在外部线索中,ECM通过细胞与单个组件的相互作用以及ECM施加的机械力发挥着重要作用。在本研究中,我们提供了证据表明,在存在和不存在TGF-β1的情况下,miR-145减少了多种ECM成分的合成。然而,尚待确定的是这些是miR-145的直接还是间接靶点。在这些研究的靶点中,据报道只有CTGF被miR-145直接靶向(42); 我们目前正试图在原代成纤维细胞中验证这一点。miR-145在TGF-β途径中有几个已知的靶点,包括SMAD3(43)和TGF-βRII(36),其下调可能会影响ECM部件的生产。我们认为miR-145通过靶向通路的多个成分来调节对TGF-β1的反应,可能是对尚未确定的其他上下文特定线索的不同反应。在肿瘤微环境中,这赋予miR-145降低肌纤维母细胞、促肿瘤CAF表型的能力。
在此,我们概述了间充质miR-145在基质成纤维细胞TGF-β1反馈回路中的关键作用。miR-145受TGF-β1上调,能够抑制TGF-α1介导的肌成纤维细胞转分化和相应的促肿瘤效应。这增加了miR-145可以外源性靶向肿瘤微环境以减弱CAF的促肿瘤性肌纤维母细胞表型的可能性。在肌成纤维细胞发挥作用的其他情况下,如纤维化疾病,它也可能有希望。miRNA-介导的治疗目前正在临床试验中(在(44))miRNA传递技术的最新发展已经实现了将miRNA特异性传递到特定组织微环境的可能性(45).
补充材料
补充数据可在致癌作用在线。
基金
我们感谢英国谢菲尔德大学的财政支持。E.E.H.、H.C.和G.E.M.是谢菲尔德大学奖学金的获得者。E.E.H.和G.E.M.是桑坦德研究流动奖的获得者,D.W.L.是牛顿基金/FAPESP旅行奖的获得人。I.C.P.由马来亚大学边境研究基金(FG001-17AFR)资助。
缩写
CAF公司
细胞生长因子
DMEM公司
发动机控制模块
FBS公司
FN1-EDA公司
基质金属蛋白酶2
净营运资金
OSCC公司
美国公共广播电视公司
α形状记忆合金
待定
确认
G.E.M.、S.A.F.、S.A.、P.P.、E.E.H.、H.C.和S.H.进行了实验。G.E.M.和D.W.L.制定了实验方法,由J.W.F.C.、D.J.B.、I.P.、G.J.T.、S.S.P.、E.K.P.、M.M.和R.D.C.M.M.、R.D.C.、G.J.T、I.P.和R.D.C提供细胞或其他试剂。D.W.L.写了手稿。所有作者都阅读了手稿,并有机会对其进行评论。我们还感谢Helen Colley博士和Robert Bolt博士提供了正常口腔成纤维细胞,并感谢Brenka McCabe博士提供了技术支持。
利益冲突声明:未申报。
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