癌相关成纤维细胞钙内流途径的改变
，1,† ，2,† ，1 ，1 ，三 ，4,5,6 ，三 ，3中，7 ，1和1,2,*
帕特西·S·苏
4澳大利亚新南威尔士州利物浦市新南威尔斯大学西南悉尼临床学院，邮编：2170；ua.ude.wsnu@noos.p
5澳大利亚新南威尔士州班克斯敦市班克斯敦医院外科2200
6澳大利亚新南威尔士州2170利物浦英格姆应用医学研究所肿瘤医学组
伦道夫·埃尔布尔，学术编辑
5澳大利亚新南威尔士州班克斯敦市班克斯敦医院外科2200
6英格姆应用医学研究所肿瘤医学组，澳大利亚新南威尔士州利物浦2170
7澳大利亚昆士兰州赫斯顿皇家布里斯班女子医院病理科，邮编4029
†贡献均等。
2021年5月9日收到；2021年6月12日验收。
摘要
癌相关成纤维细胞（CAF）是肿瘤微环境的重要组成部分，与疾病进展有关。癌症生物学中两个悬而未决的问题是CAF是如何产生的，以及它们如何成为治疗靶点。钙信号在肿瘤发生中也有重要作用。迄今为止，钙信号通路在CAF表型诱导中的作用尚不清楚。通过外源性转化生长因子β1（TGFβ1）刺激正常人乳腺成纤维细胞系HMF3S（HMF3S-CAF）生成CAF模型，并研究钙信号的变化。使用荧光指示剂、基因表达、基因筛选和药理学方法评估HMF3S-CAF钙信号通路的功能变化。HMF3S-CAF细胞显示钙内流途径发生功能性改变，储存操作的钙内流减少。为了支持钙信号开关，两个电压门控钙通道（VGCC）家族成员CaV（V）1.2和CaV（V）3.2，在HMF3S-CAF和患者源性乳腺CAF的子集中上调。siRNA介导的Ca的沉默和药理学抑制V（V）1.2或CaV（V）3.2 HMF3S细胞中CAF活化显著受损。我们的研究结果表明，VGCCs有助于TGFβ1介导的HMF3S-CAF细胞诱导以及Ca的转录干扰和药理拮抗V（V）1.2和CaV（V）3.2抑制CAF诱导。这表明靶向乳腺CAF中钙信号的潜在治疗作用。
关键词：乳腺癌、癌症相关成纤维细胞、钙、钙信号传导、电压门控钙通道、储存操作的钙进入
1.简介
人们越来越认识到肿瘤微环境（TME）在致癌过程中起着积极的作用[1]. 成纤维细胞是乳腺TME的主要细胞类型，具有高度可塑性[2]. 正常成纤维细胞（NF）通常具有肿瘤抑制作用，但可以通过一系列表型改变转化为肿瘤相关成纤维细胞[三]. CAF是一个高度多样化的人群，也可以从脂肪细胞、免疫细胞和内皮细胞中获得。在所有这些情况下，都有显著的细胞和基因表达变化[4]. 多种CAF诱导物，如TGFβ1[5]和补码信号[6]已被发现；然而，CAF激活背后的分子机制尚不完全清楚，这使得靶向CAF成为一项艰巨的任务。钙是一种尚未探索的机制，可能与CAF激活有关2+发出信号。
钙2+信号传导是各种细胞表型转变的关键途径，这表明它也可能参与NFs向CAFs的转化。一种转化是Ca2+信号依赖性是上皮细胞向间充质细胞转化（EMT）。EMT是上皮癌细胞采用更具侵袭性和抗药性表型的现象[7，8]. 各种Ca2+在此过程中对泵进行了改造，突出了钙的作用2+恶性疾病进展和细胞重塑中的信号转导[9，10]. 胞浆游离钙（[Ca2+]中青旅)在包括细胞迁移和增殖在内的多种细胞功能中也发挥着关键作用[11]以及细胞表型变化[10，12].
体内和体外癌症模型中重塑的两种钙信号通路是存储操作钙进入（SOCE）和钙2+通过电压门控钙通道（VGCC）流入[13，14]. 然而，这些还没有在CAF的背景下进行广泛评估。SOCE是非引用细胞中主要的钙内流途径[15，16]. 相反，VGCC主要在兴奋性细胞中表达[17]但它们的过度表达发生在包括癌症在内的多种病理学中[14，18]. 钙的破坏2+通过这两组钙通道的异常表达或活性发出的信号在各种癌症中都得到了很好的证实[11]例如Orai1在乳腺癌转移中的作用[13]和T型Ca2+乳腺癌细胞增殖中的通道[19]. 此外，VGCC介导的Ca的转换2+在气球损伤的大鼠和小鼠颈动脉细胞中发生SOCE依赖性通路的内流，表明这些通路可能是相互联系的[20，21，22]. 尽管鉴定出Ca2+细胞转化中的内流途径，如乳腺癌中的EMT[10]钙的作用2+通过特定Ca流入2+尚未评估乳腺癌CAF诱导中的通道。
在这里，我们报告在人类正常乳腺成纤维细胞系HMF3S中诱导CAF表型后，通过SOCE途径的钙内流显著减少[23]. 我们还显示了两个VGCC家族成员，CaV（V）1.2和CaV（V）3.2，在我们的体外CAF模型以及患者衍生乳腺CAF的子集中上调。任一Ca的静音V（V）1.2或CaV（V）3.2通过siRNA或药物抑制显著削弱CAF激活，通过α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）的诱导进行评估。这些研究强调了VGCC介导的钙信号在诱导乳腺CAF中的潜在作用。靶向VGCC和SOCE钙内流通路可能是维持成纤维细胞肿瘤抑制NF表型的新的药理学机会[24].
2.材料和方法
2.1. 细胞培养
如前所述，建立了患者来源的NFs和CAFs的原代培养物[25]. HMF3S人乳腺成纤维细胞系[23]是Michael O'Hare教授和Parmjit Jat教授（英国伦敦路德维希癌症研究所）实验室慷慨赠送的礼物。细胞常规培养在补充有10%胎牛血清（FBS；澳大利亚墨尔本试管技术公司）和4 mM L-谷氨酰胺（25030；澳大利亚斯科尔斯比生命技术公司）的高糖DMEM（D6546；美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）中。该介质含有1.8 mM Ca2+符合生理条件[11，26]和其他CAF分化研究[5，27]. 细胞保持在37°C和5%CO2在湿化培养箱中，当细胞融合率为70-90%时，每两到三天传代一次。使用第3代和第8代之间的细胞进行实验。每6个月使用MycoAlert™支原体检测试剂盒（瑞士巴塞尔Lonza）和使用GenePrint 10系统（美国威斯康星州麦迪逊Promega）通过Short Tandem Repeat（STR）分析鉴定的细胞系（澳大利亚布里斯班QIMR Berghofer医学研究所）对支原体污染进行常规检测。
为了激活TGFβ1，细胞被置于24孔组织培养处理板中，在1.5×1046×10时每孔或96个板中的细胞数三然后用无血清培养基（SRM，0.5%FBS）冲洗一次约60%汇合处的细胞单层，并在用0.1–10 ng/mL TGFβ1（10µg/mL储备液，在10 mM柠檬酸和0.1%BSA中制备；PHG9204；澳大利亚Scoresby Life Technologies）在SRM.含有TGFβ1的培养基中每天更新两天。
对于药物抑制剂研究，在用补充有ML218（3–10 nM；SML0385；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）或尼莫地平（3–10nM；N149；Sigma Aldrich）和TGFβ1（10 ng/mL）或适当对照物的新鲜培养基替换之前，用SRM培养细胞12–14小时。
2.2。siRNA转染
对于siRNA-介导的RNA干扰，如前所述，细胞在电镀24小时后转染100 nM Dharmacon-ONTARGETplus SMARTpool siRNAs（CACNA1C L-006123-00，CACNA1H L-006128-00，非靶向对照D-001810-10-05；Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）[28]siRNA处理细胞与SRM孵育过夜，然后如上所述用TGFβ1刺激。
2.3. 实时定量RT-PCR
使用Qiagen RNeasy Plus Mini试剂盒（Qiagen，Hilden，Germany）从细胞中分离RNA，并使用Omniscript RT试剂盒（Qiagen，Hilden，Germany）产生cDNA。使用TaqMan进行实时RT-PCR®Fast Universal Master Mix（Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆，美国）和TaqMan®在通用循环条件下，使用StepOnePlus™仪器（Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA）进行基因表达分析。有关分析详细信息，请参阅补充资料：表S1mRNA水平正常化为18S rRNA（患者样本）或GAPDH（HMF3S细胞），并使用比较CT型如前所述的方法[29]. 平均值CT型大于34被视为超出仪器检测极限，并归类为“未检测”。对于患者样本，如果在两对中的一对中未检测到目标mRNA，则指定100倍变化。
2.4. 免疫染色
HMF3S细胞在4%多聚甲醛中固定15 min，用PBS洗涤3×，然后在室温下在封闭缓冲液（含有10%山羊血清、0.3M甘氨酸、1%牛血清白蛋白和0.1%Triton-X-100的PBS）中渗透和封闭1 h。αSMA Alexa 488-结合抗体（ab184675；Abcam，Cambridge，UK）在封闭缓冲液中稀释1:200，并在4°C下培养过夜。然后用PBS清洗细胞，并在室温下用1µg/mL的DAPI在PBS中培养10分钟。然后用PBS清洗细胞，并使用ImageXpress Micro成像系统和10倍物镜（Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA）成像。通过省略初级或次级抗体添加来制备对照品（数据未显示）。
2.5. 免疫印迹
使用添加了蛋白酶和磷酸酶抑制剂的蛋白裂解缓冲液（Tris碱50 mM，NaCl 100 mM，IGEPAL NP-40 1%，脱氧胆酸钠0.5%）进行细胞裂解（德国彭茨堡罗氏应用科学公司）。使用Mini-PROTEAN进行凝胶电泳®TGX无染色™预制凝胶（BioRad，Hercules，CA，USA）并转移至PVDF膜（BioRad，Hercures，CA和USA）。αSMA抗体（ab7817；英国剑桥Abcam，1:200–1:1500，置于5%脱脂奶粉（SMP）或5%BSA中），并在4°C下培养16–40小时，根据抗体批次摇晃。在室温下，将膜清洗并在羊抗鼠HRP结合二级抗体（170-6516；BioRad，Hercules，CA，USA，1:10000，5%SMP）中孵育1小时。β-肌动蛋白（A5441；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA，1:10000，5%SMP）用作平行凝胶的负载控制。PVDF膜在SuperSignal West Dura Extended Dura化学发光基板（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）中培养，并使用BioRad ChemiDoc成像系统成像。根据用户指南，使用Image Lab软件（5.2.1版；BioRad，Hercules，CA，USA）对蛋白质带进行量化[30].
2.6. 细胞内游离钙的测定
HMF3S细胞在2.5×10三在黑色96-well微孔板（Corning Costar，Corning，NY，USA）中每孔的细胞数，并如上所述用0.1–10 ng/mL TGFβ1处理。通过向细胞内装载细胞渗透性钙来进行存储操作钙进入（SOCE）分析2+SRM中的指示剂Fluo-4 AM（4μM；Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）。然后在37°C下培养细胞30分钟，然后用生理盐水（PSS；5.9 mM KCl，1.4 mM MgCl）替换培养基2，10 mM HEPES，1.2 mM NaH2人事军官4，5 mM NaHCO三，140 mM氯化钠，11.5 mM葡萄糖，1.8 mM氯化钙2)在室温下孵育15分钟，避光。如前所述，对SOCE进行了评估[31]，稍作修改。简单地说，用含有0.3%牛血清白蛋白的PSS（BSA；A3803，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）清洗细胞两次，用CaCl清洗一次2-游离PSS（PSS标称Ca2+). PSS标称Ca2+然后添加到每个井中。通过依次用BAPTA（100μM，Invitrogen，Waltham，MA，USA）、肌/内质钙2+ATP酶抑制剂与钙2+存储消耗剂环丙二酸（CPA；10μM，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）和CaCl2（0.6毫米）。胞浆钙2+使用荧光成像板阅读器（FLIPR）评估流入TETRA公司; 分子器件，加利福尼亚州圣何塞，美国）[32]. 在26到600 s之间计算“峰值1”（代表仓库清空）和“峰值2”（代表Ca）的曲线下面积（AUC）2+流入）用于比较SOCE，与之前的研究类似[31].
2.7. 统计分析
使用GraphPad Prism（版本3.8.1）进行所有统计分析。GraphPad Software Inc.，美国加利福尼亚州拉荷亚）。统计分析的详细信息见图表图例。
3.结果
3.1. TGFβ1刺激诱导HMF3S细胞CAF样表型
鉴于TGFβ1是一个关键的TME信号分子[33]和特征良好的CAF诱导剂[5，34]，我们探索了其转化正常（非激活）HMF3S成纤维细胞的能力[23]转化为CAF样表型（HMF3S-CAF）。我们通过测量四个报告的CAF标记的转录水平来评估CAF的激活[35]：成纤维细胞活化蛋白-α（FAPα）、血小板衍生生长因子受体-β（PDGFRβ）、纤维连接蛋白和tenascin-C(a） 以及广泛使用的CAF标记α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）的蛋白表达(b、 c）[36]. 如Costa等人所述[33]免疫荧光法未观察到αSMA的均匀表达，表明CAF存在异质性。然而，考虑到所有评估的CAF标记物的浓度依赖性增加，TGFβ1在1和10 ng/mL时显著上调，我们将这些浓度下的TGFβl定义为适合在该模型中诱导CAF样表型。
转化生长因子β1（TGFβ1）处理的HMF3S细胞中癌相关成纤维细胞（CAF）标记物的表达。在评估标记物之前，用TGFβ1（0.01、0.1、1或10 ng/mL）或溶媒对照（0 ng/mL）刺激血清饥饿的HMF3S细胞48小时。(一)与所示浓度的载体相比，TGFβ1治疗增加了CAF相关基因成纤维细胞活化蛋白-α（FAPα）、血小板衍生生长因子受体-β（PDGFRβ）、纤维连接蛋白和tenascin-C的mRNA水平。(b条)代表性免疫印迹和密度测定显示，与1和10 ng/mL TGFβ1的载体相比，α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）蛋白的诱导显著。(c（c）)与溶媒对照组相比，具有代表性的免疫荧光图像显示αSMA蛋白（红色）上调。细胞核（DAPI）染色也显示为蓝色。(一，b条)数据表示为三个独立实验的平均值±SD；*第页<单因素方差分析后的事后Dunnett多重比较试验显示，治疗效果显著。
3.2. TGFβ1介导的CAF诱导HMF3S细胞SOCE损伤
由于SOCE是主要的Ca2+非引用细胞内流途径[37，38]并在多种癌症类型和细胞转化中重塑[10，11，36]，我们试图确定诱导CAF样表型后HMF3S细胞中SOCE是否发生改变。为了评估这一点，我们首先通过耗尽内质网Ca来启动SOCE2+使用环己酸（CPA）抑制肌/内质网钙2+细胞外钙条件下的ATP酶（SERCA）2+1,2-双（邻氨基苯氧基）乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸（BAPTA）的螯合作用。ER Ca初始耗尽后2+通过添加细胞外钙来评估SOCE2+.最初CPA介导的[Ca增加2+]中青旅HMF3S-CAF和HMF3S细胞之间没有差异，根据峰值1曲线下面积（AUC）评估(a、 b）表明CAF激活不会导致ER存储容量的变化。然而，根据[Ca2+]中青旅随Ca增加2+再加（峰2的AUC）(c） 和Ca的比例2+流入Ca2+存储消耗（AUC峰值2到峰值1）(d） ●●●●。这些结果表明，TGFβ1介导的HMF3S细胞CAF样表型诱导后SOCE的重塑。
胞浆钙的评估2+TGFβ1处理的HMF3S细胞中存储操作钙进入（SOCE）反应期间的水平。(一)在成像之前，用TGFβ1（0.01、0.1、1或10 ng/mL）或溶媒对照（0 ng/mL）处理血清饥饿的HMF3S细胞48小时。为了评估SOCE的潜在重塑，用1,2-双（邻氨基苯氧基）乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸（BAPTA，100μM）依次处理细胞，以螯合细胞外钙2+，环己酸（CPA，10μM）耗尽细胞内钙2+门店和Ca2+（0.6 mM），以评估存储操作的钙内流。钙示踪代表相对胞浆钙水平（[Ca2+]中青旅)作为相对于基线的平均荧光。定量(b条)曲线下面积（AUC；峰值1）(c（c）)AUC（峰值2），以及(d日)AUC比率（峰值2/峰值1）。在(b条–d日)数据表示为三个独立实验的平均值±SD。*第页<单因素方差分析后的事后Dunnett多重比较检验显示0.05显示治疗效果显著。
3.3. HMF3S激活重塑钙通道和通道调节因子的表达
对HMF3S-CAF中观察到的SOCE下降的一个潜在解释是SOCE成分的表达改变。为了确定这是否是一个促成因素，我们评估了SOCE-Ca的mRNA水平2+通道亚型、Orai1及其典型激活物基质相互作用分子1和2（STIM1和STIM2）[37]. TGFβ1以1和10 ng/mL的剂量处理后，Orai1 mRNA水平略有增加，STIM2 mRNA水平下降，但显著增加(a） 而在0.01 ng/mL时，STIM1水平显著升高。这表明SOCE的功能性降低不太可能与典型SOCE成分Orai1和STIM1的mRNA水平降低有关。
钙通道和通道调节因子在CAF中有差异表达。(一，b条)在分离RNA之前，用TGFβ1（0.01、0.1、1或10 ng/mL）或载体对照物（0 ng/mL）刺激血清饥饿的HMF3S细胞48小时。SOCE通道和通道调节因子的mRNA水平；(一)Orai1、基质相互作用分子1和2（STIM1和STIM2）以及(b条)电压门控钙通道（VGCC）；钙V（V）1.2，钙V（V）2.1，钙V（V）3.2，使用定量RT-PCR进行评估。数值表示为相对于车辆控制的折叠变化。数据表示为三个独立实验的平均值±标准差；*第页<单因素方差分析后的事后Dunnett多重比较试验显示，治疗效果显著。(c（c）)配对患者CAF和正常乳腺成纤维细胞（NFs）中选定钙通道和通道调节器的mRNA比率。值±2表示在CAF或NF样本中均未检测到mRNA。
已知SOCE和VGCC-Ca之间表型转换的报告2+某些病理模型中的内流途径[21]，我们比较了TGFβ1刺激的HMF3S-CAF中所有10个VGCC的mRNA水平。钙V（V）1.1，钙V（V）1.3，钙V（V）1.4，钙V（V）2.2，钙V（V）2.3和CaV（V）3.3 HMF3S或HMF3S-CAF细胞中未检测到转录水平（数据未显示）。然而，L型钙的mRNA水平V（V）1.2和T型CaV（V）3.2 VGCC在用1和10 ng/mL TGFβ1治疗后显著上调(b） ●●●●。在评估的P/Q、N和R型VGCC中，只有CaV（V）表达2.1；然而，TGFβ1刺激后转录水平没有明显变化(b） ●●●●。这些数据表明HMF3S-CAF中存在潜在的SOCE到VGCC钙内流表型转换，这与L型和T型钙通道表达增加有关。
为了评估这一观察结果是否反映在临床环境中，我们评估了来自人类乳腺癌患者的17个配对CAF样本。与体外模型一致，配对乳腺癌患者样本中CAF和NF的Orai1、STIM1或STIM2转录水平没有一致的变化(c） ●●●●。然而，VGCC转录水平的变异性要高得多，Ca有上调的趋势V（V）1.2和CaV（V）与配对NF相比，在CAF中为3.2(c） ●●●●。
3.4. 电压门控钙通道是HMF3S细胞CAF激活的调节器
考虑到观察到的T型和L型Ca的重塑2+我们利用siRNA介导的沉默和药物抑制评估了这些钙通道在HMF3S-CAF激活中的潜在作用。钙V（V）1.2和CaV（V）3.2 siRNA沉默(图S1)显著降低TGFβ1刺激的αSMA增加约50%(a） ●●●●。我们还评估了siCa的影响V（V）1.2和siCaV（V）3.2转化生长因子β1显著增加的四个CAF标记的mRNA转录水平(b） ●●●●。两种siRNA治疗均能消除TGFβ1诱导的FAPα、纤维连接蛋白和tenascin-C mRNA的显著增加。然而，这种效应只有在siCa中才能看到V（V）1.2用于标记PDGFRβ(b） ●●●●。综合起来，这些数据表明V（V）1.2和CaV（V）3.2在该模型中诱导HMF3S-CAF表型中发挥作用。
钙的作用V（V）1.2和CaV（V）3.2沉默TGFβ1诱导的HMF3S细胞CAF标记表达。(一)具有代表性的免疫印迹和密度测定数据显示，在siCa存在下αSMA蛋白表达显著下调V（V）1.2和siCaV（V）3.2. (b条)与载体相比，TGFβ1治疗增加了CAF相关基因FAPα、PDGFRβ、纤维连接蛋白和tenascin-C的mRNA水平。硅钙石V（V）1.2和siCaV（V）3.2减少FAPα、纤维连接蛋白和tenascin-C的诱导，而siCa抑制PDGFR-β的诱导V（V）1.2但不是siCaV（V）3.2. 数据表示为三个独立实验的平均值±SD；*第页<单因素方差分析后的事后Dunnett多重比较试验显示，治疗效果显著。
为了评估市售治疗药物抑制CAF诱导的潜力，我们用TGFβ1和尼莫地平联合处理HMF3S细胞[39]L型VGCC抑制剂（CaV（V）1.2系列），或ML218[40]T型VGCC抑制剂（CaV（V）3.2家族）。与我们使用siRNA靶向Ca的发现类似V（V）1.2和CaV（V）3.2，用尼莫地平或ML218治疗TGFβ1刺激的HMF3S可将αSMA水平降低约50%(a、 b）。
药物抑制TGFβ1诱导HMF3S细胞中αSMA表达。使用(一)尼莫地平，以及(b条)ML218。典型的免疫印迹和密度测定数据显示，3 nM和10 nM尼莫地平以及10 nM ML218显著下调αSMA蛋白。数据表示为四个独立实验的平均值±SD*第页单因素方差分析后的事后Dunnett多重比较试验显示，治疗效果显著。
4.讨论
细胞可塑性在发育生理和病理过程中很常见，包括神经元发育[41]，T细胞分化[42]和EMT[10]. 在所有这些情况下，钙信号起着重要作用[10，36，39]. 肿瘤细胞和TME细胞的可塑性已经得到了很好的证实，在这种情况下可能发生的无数潜在变化越来越引起人们的兴趣[43]. 尽管Ca与2+癌细胞的信号传导和表型变化，我们对Ca的理解2+CAF转换期间的信令仍然有限。然而，与钙相关的研究2+信令和CAF正在出现。最近，Vancauwenberghe等人[44]表明Ca突变体亚型的过度表达2+CAF中的渗透性离子通道瞬时受体电位阳离子通道亚家族A成员1（TRPA1）促进前列腺癌细胞对白藜芦醇介导的凋亡的抵抗，并且这是以钙依赖的方式发生的。Leung等人[45]提供证据表明，卵巢CAF通过MFAP5/FAK/ERK信号以钙依赖的方式上调微血管内皮细胞中脂肪瘤相关伙伴基因，从而促进化疗耐药性。这导致血管渗漏增加，从而降低紫杉醇的生物利用度。这两个例子清楚地表明了钙的作用2+CAF介导的化疗耐药信号，TME在肿瘤发生中的公认特征[46，47，48].
CAF和Ca之间的进一步联系2+信号包括结直肠癌细胞分泌12（S）-HETE，促进CAF迁移[49]. 细胞内钙螯合减少了12（S）-HETE诱导的CAF迁移，证明了CAF中这种迁移表型对钙的需求。钙在CAF激活中作用的其他支持来自高通量筛选，该筛选鉴定出27种化合物，它们基于纤维连接蛋白表达显著抑制CAF激活[50]. 在这27种化合物中，近三分之一是典型地抑制钠的糖苷+/K（K）+ATP酶，因此也可能改变细胞内钙储存[51]. 尽管Ca与2+信号转导和CAF，目前缺乏对乳腺癌CAF中钙信号转导的研究。此外，还没有对Ca的潜在重塑进行详细评估2+CAF激活期间的内流或Ca的作用2+NF转化为CAF的内流途径。为了解决这些差距，我们的研究重点是确定乳腺CAF是否在体外SOCE中显示改变，以及是否抑制特异性Ca2+内流途径可以改变CAF表型的诱导。
我们在人类乳腺成纤维细胞系（HMF3S）中使用TGFβ1优化了CAF诱导。在文献中，TGFβ1介导的分化可能需要24小时[5，27，52]至三周[34]. 与之前的研究一致，我们发现48小时足以强烈诱导广泛的CAF标记。
SOCE是最常见的Ca2+非引用细胞中的信号通路，并在癌细胞（如EMT）的表型变化中发生改变[9，49，50]. 我们假设在CAF激活期间SOCE也可能发生类似的改变，并且确实发现在TGFβ1诱导的HMF3S-CAF中SOCE容量显著降低。有趣的是，这并没有伴随着主要SOCE成分Orai1和STIM1的表达明显下降；相反，Orai1 mRNA水平略有升高。然而，STIM2水平略有但显著下降。SOCE的重塑可能是由于Orai1质膜蛋白水平的差异或转运[53，54]. SOCE重塑与气球损伤大鼠主动脉细胞中VGCC活性降低相关[20，21，22]. 因此，我们评估了这种互惠是否会在我们的模型中发生。尽管SOCE组分基因表达没有明显变化，但我们确实看到，由于CAF诱导，T型和L型VGCC显著上调。这些通道通常与神经元等可兴奋细胞有关，但也与某些CAF表型有关。例如，L型VGCCs促进PDGF诱导的小鼠胚胎成纤维细胞迁移[55]. 这种与迁徙的联系可能部分解释了CAF较高的迁徙能力[56]. 此外，CAF显示出更强的收缩力[57]和L型VGCC与成纤维细胞收缩有关[55]. CAF也比NF更具增殖性，已知T型钙电流增加与成纤维细胞样大鼠心肌细胞的增殖有关[58].
为了确定VGCC是否参与TGFβ1介导的HMF3S乳腺成纤维细胞CAF样状态的诱导，我们用siRNA靶向L型和T型VGCC，发现这降低了TGFβL上调CAF标记物的能力。在TGFβ1存在的情况下，沉默两个通道也会降低αSMA蛋白的表达。类似地，L型和T型VGCCs的药物抑制可损害TGFβ1诱导的HMF3S细胞中αSMA的增加。这些研究表明，L型和T型VGCC是一些CAF标记物诱导的调节器。
5.结论
利用人类CAF模型，我们的发现为研究CAF诱导后钙信号的重塑提供了新的见解。通过我们的体外模型和匹配的乳腺癌患者NF和CAF样本观察到，这种重塑似乎与特定VGCC的增加有关。在我们的体外模型中，CAF诱导也与SOCE功能降低相关。药理学和siRNA-介导的选择性T型和L型VGCC信号的干扰降低了TGFβ1诱导的体外CAF激活。抑制VGCC干扰CAF激活的能力表明，某些VGCC的选择性治疗靶向性可能通过减少NF诱导为致瘤CAF来减缓疾病进展。
未来的研究应评估VGCC调制调节其他CAF标记物和表型的能力，如该模型和其他模型中的增殖、凋亡抵抗和细胞因子释放，包括患者衍生的CAF。
致谢
我们感谢Michael O'Hare和Parmjit Jat慷慨捐赠HMF3S人类乳腺成纤维细胞系。
作者贡献
概念化、T.A.S.、F.S.、J.M.S.、S.R.L.、P.S.、S.J.R.-T.和G.R.M。；调查、F.S.、T.A.S.、M.R.、S.R.L.和G.R.M。；书面原稿编制、F.S.、T.A.S.和G.R.M。；书面审查和编辑，F.S.、T.A.S.、M.R.、A.A.P.、P.K.-d.C.、J.M.S.、S.R.L.、S.J.R.-T和G.R.M。；资金收购，J.M.S.，S.R.L.，S.J.R.-T和G.R.M.所有作者都已阅读并同意手稿的出版版本。
基金
这项工作得到了负责卫生事务的国防部助理部长办公室的支持，通过乳腺癌研究计划，授予编号为W81XWH-17-1-0064的奖项。意见、解释、结论和建议都是作者的，不一定得到国防部的认可。
机构审查委员会声明
这项研究是根据赫尔辛基宣言的指导方针进行的，并得到以下委员会和办公室的批准：悉尼北部和澳大利亚悉尼中央海岸地区卫生服务人类研究伦理委员会。昆士兰大学人类研究伦理委员会，澳大利亚布里斯班（批准日期：2016年11月25日，批准号：2016001699）。美国陆军医学研究与装备司令部，美国德特里克堡（批准日期：2017年2月23日，A-19946）。美国德特里克堡研究保护办公室（批准日期：2017年2月23日，A-19946）。美国德特里克堡人类研究保护办公室（批准日期：2017年2月23日，A-19946）。
脚注
出版商备注：MDPI对公布的地图和机构关联中的管辖权主张保持中立。
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