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.2021年7月；13(7):626-633.
doi:10.1038/s41557-021-00736-9。 Epub 2021年6月28日。

活细胞DNA G-四链相互作用蛋白的化学分析

张晓云 # 1, Jochen Spiegel公司 # 2, 塞尔吉奥·马丁内斯·库斯塔 1 2 三, 桑托什·阿迪卡里 1, Shankar Balasubramanian阶 4 5 6
附属公司

活细胞DNA G-四链相互作用蛋白的化学分析

张晓云等。 自然化学. 2021年7月.

摘要

DNA-蛋白质相互作用调节关键的生物过程。识别与特定功能基因组位点结合的蛋白质对于理解分子水平上的潜在调控机制至关重要。在这里，我们描述了一种共同结合介导的蛋白质分析（CMPP）策略，以研究天然染色质中DNA G-四链体（G4s）的相互作用体。CMPP涉及可通过细胞渗透的功能化G4配体探针，该探针结合内源性G4，随后在原位交联到共结合G4相互作用蛋白。我们首先通过G4结合蛋白的近贴标签在体外显示CMPP的稳健性。将这种方法应用于活细胞，然后我们从不同的功能类别中鉴定出数百种假定的G4相互作用蛋白。接下来，我们在体外确认了几个新发现的G4相互作用物的高G4结合亲和力和选择性，并使用独立的方法验证了细胞染色质中一个功能重要候选物的G4直接相互作用。我们的研究为绘制活细胞中特定核酸特征的蛋白质相互作用提供了一种化学策略。

PubMed免责声明

利益冲突声明

S.B.是剑桥Epigenetix Ltd.S.M.C.的创始人和股东，S.a.现在是阿斯利康的员工。所有其他作者都没有相互竞争的兴趣。

数字

图1
图1。CMPP示意图。
一，通过Hoogsteen碱基配对和单价阳离子稳定的G-四分体（顶部），以及通过G-四分体的堆叠形成的分子内G4结构（底部）。b条，CMPP概念的示意图。用G4-配体探针处理细胞，该探针具有光敏二氮杂啶基团和咔哒炔手柄。探针被募集到内源性G4结合位点，在那里紫外线照射触发共结合G4相互作用蛋白的接近捕获。
图2
图2。体外G4结合蛋白的共结合介导的邻近捕获。
一，G4-配体探针photoPDS-1（1）、photoPD S-2（2）和控制探针3的化学结构。b条，增加1、2和3的浓度导致G4 Kit1（左）和dsDNA（右）的热熔解位移。熔化温度的增加（ΔT型米)通过荧光共振能量转移熔融测定法测量。平均值来自两个独立的实验(n个=2).c（c），通过增加与不同G4结构（G4-Myc、G4-Kit1和G4-Telo）和dsDNA结合的探针1、2和3的浓度诱导荧光猝灭。明显的K（K）d日显示值。平均值和误差（±标准偏差（s.d.））来自四个独立的实验(n个=4).d日，体外共结合介导的BG4邻近捕获示意图。e（电子），凝胶扫描（探针，10 μM）显示共结合介导的BG4邻近标记的荧光图像（分子质量~31 kDa）乘以1、2和3。显示了三个独立实验的代表性图像，结果相似。源数据
图3
图3。人类细胞中G4相互作用体的轮廓。
一，HEK293T细胞中G4-相互作用蛋白原位绘图的工作流程示意图。b条，使用探针对G4相互作用蛋白进行基于凝胶的全局剖析（20 μM）1和2与3。TAMRA和考马斯染色分别代表探针特异性标记和总负载蛋白。给出了三个独立实验的代表性图像，结果相似。c（c），火山图显示探针1与探针3的富集蛋白质（分别以绿色和橙色突出显示）(n个=248).d日，火山图显示探针2和探针3的富集蛋白质（分别以绿色和橙色突出显示）(n个=209). 蛋白质被认为比对照组丰富了2倍以上的信号，FDR<0.05。e（电子），浓缩蛋白质之间的重叠c（c）和d日与G4IPDB中已知的G4-相关蛋白进行比较。橙色圆点c（c）和d日代表富集的已知G4相关蛋白。（f）,克、生物过程的UniprotKB顶级关键字分布(（f）)和分子功能(克)所有浓缩蛋白中（256个）。二甲基亚砜。源数据
图4
图4。新型核G4-选择性结合蛋白的验证。
一，亲和力富集，结合对G4结构和对照寡核苷酸的不同拓扑的选定候选物进行western blot分析（G-runs以粗体突出显示）。显示了来自具有相似结果的两个独立实验的代表性印迹。b条–e（电子）绑定曲线（所示K（K）d日人类重组全长SMARCA4蛋白到G4 Kit1、单链突变体（ss-mutKit1）和双链Kit1（ds-Kt1）的值通过ELISA产生(b条)、UHRF1蛋白到G4 Kit1、ss mutKit1，Kit1半甲基化dsDNA和ds Kit1(c（c）)、DDX1蛋白转化为G4-Myc、ss-mutMyc和ds-Myc(d日)、DDX24蛋白到G4 Kit1、ss mutKit1和ds Kit1(e（电子）)和RBM22蛋白转化为G4 NRAS及其突变体（mutNRAS）(（f）). 平均值和误差（±s.d.）来自三个独立的实验(n个=3). a.u.，任意单位。源数据
图5
图5。SMARCA4在内源性G4中富集。
一，基因组浏览器视图示例XYLB公司,TMCC6型和LARP1号机组SMARCA4（黑色）和G4（蓝色）显示来自ChIP-seq和控制输入的信号轨迹以及一致峰值。具有形成G4的生物物理潜力的序列显示为正负链（潜在G4，灰色）。b条SMARCA4和内源性G4高置信度峰值的重叠。c（c），SMARCA4内源性G4位点（左）和潜在G4位点的占用情况（右）。d日SMARCA4和G4 ChIP-seq在不同基因组特征中的比例达到峰值。TSS，转录起始位点；UTR，非翻译区；TES，转录末端位点；代表，复制。源数据
扩展数据图1
扩展数据图1。用于体外共结合介导的BG4接近标记的探针。
一，G4-配体探针（1-3）诱导热稳定（ΔT型米)使用FRET熔融分析对G4 Telo和G4 Myc进行检测。ΔT型米第1页，第2页，第1页 G4 Telo上的μM为25 °C和27 分别为°C。ΔT型米第1页，第2页，第1页 G4 Myc上的μM为14 °C和13 分别为°C。而ΔT型米第页，共3页，第1页 μM为0。平均值由两个独立的实验（n=2).b条，使用荧光滴定结合分析法通过测量表观浓度评估PDS和3的G4-结合亲和力K（K）d日值。平均值和误差（±S.D.）由四个独立实验（n=4).c（c），用圆二色性验证G4-Myc、单链mutMyc和双链Myc的结构（G-runs以粗体突出显示）。三个独立实验的平均值（n=3） 表示。d日BG4的CMPP的剂量依赖性为1和2。TAMRA和考马斯染色的信号分别代表探针特异性标记和负载输入。显示了三个独立实验的代表性图像，结果相似。源数据
扩展数据图2
扩展数据图2。人类细胞中DNA G4相互作用蛋白的凝胶定位。
一，探头1和b条，探针2显示HEK293T细胞核蛋白组的剂量依赖性蛋白标记。显示了三个具有类似结果的独立实验的典型凝胶图像。c（c），CellTiter-Glo发光细胞活性测定，探针处理75 在本研究中使用的所有条件下，HEK293T细胞的最小值。平均值和误差（±S.D.）由四个独立实验（n=4). 源数据
扩展数据图3
扩展数据图3。寡核苷酸的结构验证。
这里获得的CD光谱与先前报道的特征良好的DNA G4序列的光谱相匹配（G序列以粗体突出显示，见补充表3），不同的拓扑显示不同的谱带,，包括并联一、G4 Mycb条、G4套件1和c（c），G4套件2在~260时呈阳性 240 nm处为负 纳米；反平行G4 TBA在~290处呈阳性 nm和~240 nm，在~260处为负 纳米；d日，杂交G4 BCL2在~290处呈阳性 nm和~260 nm，在~240处为负 纳米。所有G4结构也在~210处共享正带 纳米。而相应的单链突变体和双链对照则失去了这些特征。三个独立实验的平均值（n=3） 表示。源数据
扩展数据图4
扩展数据图4。通过亲和富集结合western blot分析和ELISA进行蛋白质验证。
一、亲和力富集结合HMGB2的western blot分析，用于不同拓扑的G4结构和对照寡核苷酸。显示了两个具有类似结果的独立实验的代表性印迹。G4-Myc的结构验证(b条)和G4套件1(c（c）)和CD光谱显示的对照寡核苷酸。曲线由三个独立实验（n）的平均值绘制=3).d日，具有指示离解常数的结合曲线(K（K）d日)用ELISA法将人重组全长RBM22蛋白转化为DNA G4-Myc、单链突变体和Myc双链DNA。平均值和误差（±S.D.）由三个独立实验（n=3). G-runs以粗体突出显示。源数据
扩展数据图5
扩展数据图5。SMARCA4结合位点的属性。
一SMARCA4 ChIP-seq在K562染色质中识别的结合位点在三个生物复制品中重叠。在至少两个重复中确定的结合位点被视为高置信结合位点。b条，SMARCA4结合位点中识别的以或缺乏内源性G4标记的结合基序。EM为Motif Elicitation（MEME）分析确定的前3个基序如下所示。
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中的注释

  • 破译核酸结。
    Fleming AM，Burrows CJ。 Fleming AM等人。 自然化学。2021年7月；13(7):618-619. doi:10.1038/s41557-021-00739-6。 自然化学。2021 PMID：34183816 没有可用的摘要。

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