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。2021年1月1日；320（1）：F87-F96。
doi:10.1152/ajprenal.00401.2020。 Epub 2020年12月7日。

肾保护作用状态1小鼠马兜铃酸肾病的缺失

文光峰 1, 魏忠英 1, 李兴生 2, 丽莎·M·柯蒂斯 2, 保罗·W·桑德斯 1 2 三
附属公司

肾保护作用状态1小鼠马兜铃酸肾病的缺失

文光峰等。 美国生理学杂志肾脏生理学。 。

摘要

受损的肾小管上皮刺激纤维化前环境，加速慢性肾脏病（CKD）患者的功能丧失。本研究检测信号转导子和转录激活子1（STAT1）在CKD模型马兜铃酸（AA）肾病肾功能进行性丧失中的作用。AA治疗的野生型（WT）同卵双胞胎的平均血清肌酐浓度增加，而状态1-/-小鼠受到保护。经AA治疗的WT小鼠近端小管中观察到肾损伤分子（KIM）-1顶端表达的局部增加，但在状态1-/-治疗组和两个对照组的小鼠。复合损伤评分是近端小管损伤的指标，在状态1-/-AA治疗小鼠整合素β表达增加6AA处理后，WT小鼠近端小管中的磷酸化Smad2/3以及间质胶原和纤维连接蛋白被观察到，但在AA处理后的WT小鼠中均被降低状态1-/-老鼠。数据表明，STAT1激活促进了AA肾病进展性肾损伤和间质纤维化的发展。

关键词：马兜铃酸；慢性肾脏病；整合素；肾纤维化；转化生长因子-β。

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利益冲突声明

提交人未声明任何利益冲突，无论是财务还是其他方面。

数字

无
图形摘要
图1。
图1。
实验方案的时间表和马兜铃酸（AA）治疗对血清肌酐浓度的影响。A类：在首次采集尾静脉血液后，状态1−/−和同窝野生型小鼠每天腹腔注射2 mg/kg AA或载体，持续5天。血又被吸上来了第5天研究结束时第40天，当对动物实施安乐死并采集组织进行分析时。B类：每天注射AA后第5天研究表明，与车辆处理的小鼠相比，血清肌酐更高[F类(1, 22) = 10.92,P（P）=0.0032]在AA处理组中；STAT1和AA的存在之间的相互作用的测试并不显著。由第40天，AA处理野生型小鼠组的平均血清肌酐浓度更高(*P（P）<0.0001）高于其他三组的平均肌酐水平；STAT1和AA之间的相互作用也很显著[F类(1, 35) = 28.67,P（P）< 0.0001].n个 = 每组8-12只动物。Bld，静脉切开术；STAT1、信号转导子和转录激活子1；WT，野生型。采用双向方差分析和Tukey多重比较检验。
图2。
图2。
在AA处理的野生型小鼠的近端小管中，KIM-1的顶端表达局部增加。KIM-1在正常肾脏中的表达较低，但在再生的近端上皮细胞中表达增加（17）。在CKD模型中，KIM-1（红色荧光）增加，通常与四棱莲花凝集素（LTL，绿色荧光），特别是在AA处理的野生型同卵双胞胎中。细胞核用DAPI（蓝色荧光）进行复染。偶尔，在LTL染色低或无LTL染色的小管中发现KIM-1，可能是因为LTL与分化的近端小管的刷状边界结合（25）。其他组（包括AA-处理组）的组织切片中没有KIM-1表达状态1−/−老鼠(右下角)和车辆处理状态1−/−和室友控制小鼠(顶部). 白色条=50 微米。AA，马兜铃酸；慢性肾病；肾损伤分子-1；信号转导子和转录激活子1。
图3。
图3。
在研究组小鼠中观察到的组织学变化。A类：接受AA的同窝对照小鼠也表现出局部损伤区域，伴有肾小管扩张、管腔碎片和刷状缘缺失(左下角). 这些变化在溶媒治疗组中并不显著(顶部)和经AA-处理的状态1−/−老鼠(右下角). 黄色条=100 微米。B类：H&E染色肾组织的盲法分析(n个 = 每组6-8只动物）产生复合损伤评分，反映损伤标记物增加所显示的近端肾小管细胞损伤：凋亡小体或固缩核、刷状缘断裂或上皮屏障断裂，或肾小管腔内存在细胞铸型。肾脏状态1+/+AA治疗的小鼠表现出比相应对照组的肾脏更高的平均复合损伤分数状态1+/+和状态1−/−老鼠。综合伤害分数状态1+/+AA-治疗组的小鼠的复合损伤评分也高于相应AA-处理组的复合损伤分数状态1−/−老鼠。STAT1和AA之间的相互作用也很显著[F类(1, 24) = 6.662,P（P）= 0.0164]. *P（P）= 0.0139; ***P（P）<0.0003（Tukey多重比较检验的双向方差分析）。AA，马兜铃酸；H&E、苏木精和曙红；信号转导子和转录激活子1。
图4。
图4。
在AA处理的野生型小鼠肾皮质中STAT1被激活。A类：肾皮质裂解物的Western blot分析证实了STAT1在状态1−/−老鼠。实验性治疗在野生型小鼠中促进了p-STAT1（Y701）的增加。STAT1的存在与实验治疗之间的相互作用也很显著[F类(1, 12) = 46.30,P（P）< 0.0001). *P（P）<0.0001，与其他三组相比#P（P）<0.001，与以下两组相比统计1−/−每个实验中的小鼠(n个 = 每组4只；双向方差分析（使用Tukey的多重比较测试）。B类：与Western blot分析一致，免疫荧光图像（右图）明确检测到近端小管细胞质和细胞核（黄色箭头）中存在p-STAT1（Y701；红色荧光），并用LTL（绿色荧光）标记，以及用AA处理的野生型小鼠间质细胞(左下角). 在包括载体治疗组的组织切片中未观察到近端小管中存在p-STAT1（Y701）状态1−/−小鼠和AA-处理状态1−/−老鼠(正确的)在车辆处理的同窝对照小鼠中稀疏存在(左上角). 细胞核用DAPI（蓝色荧光）进行复染。白色条代表20 微米。AA，马兜铃酸；长期贷款，四棱莲花凝集素；信号转导子和转录激活子1。
图5。
图5。
整合素β6在AA处理的野生型小鼠的肾皮质中增加。A类：肾皮质裂解物的西方分析显示，AA治疗后野生型小鼠的整合素β6表达增加。STAT1的存在与实验治疗之间的相互作用也很显著[F类(1, 12) = 16.51,P（P）= 0.0016]. *P（P）<0.0001，与其他三组相比(n个 = 每组4只；双向方差分析（使用Tukey的多重比较测试）。B类：使用抗整合素β6（红色荧光）的免疫荧光实验检测到用AA治疗的野生型小鼠LTL标记（绿色荧光）近端小管基底外侧表面的线性染色（箭头）(左下角). 研究中其他组的组织切片中没有整合素β6染色。细胞核用DAPI（蓝色荧光）进行复染。白色条代表50 微米。AA，马兜铃酸；长期贷款，四棱莲花凝集素；STAT1、信号转导子和转录激活子1。
图6。
图6。
治疗组野生型小鼠肾皮质中p-Smad2/3（S465/7）的表达增加。A类：因为总Smad2/3的表达在状态1−/−之前观察到的一项发现（14），小鼠p-Smad2/3的表达受每个样本中总Smad2/3水平的影响。肾皮质裂解物的Western blot分析显示，AA治疗后野生型小鼠中p-Smad2/3的表达增加。与相应对照组比较状态1−/−小鼠、车辆治疗和假治疗野生型小鼠也表现出增加(P（P）<0.007）p-Smad2/3水平。STAT1的存在与实验治疗之间的相互作用也很显著[F类(1, 12) = 38.49,P（P）< 0.0001]. *P（P）<0.0001，与其他三组相比#P（P）<0.007，与以下两组相比状态1−/−实验中的小鼠(n个 = 每组4只；Tukey多重比较检验的双向方差分析）。B类：使用抗p-Smad2抗体的免疫荧光显微镜检测到AA治疗后野生型小鼠近端小管中存在p-Smad1（红色荧光），这些小管用LTL（绿色荧光）标记，以及其他未识别的细胞(左下角). 在细胞核（黄色箭头）和细胞质中检测到p-Smad2。在组织切片中未检测到p-Smad2（S465/467）相关荧光状态1−/−老鼠(正确的)在车辆处理的同窝对照小鼠中很少检测到(左上角). 细胞核用DAPI（蓝色）复染。黄色条=20 微米。AA，马兜铃酸；LTL，四棱莲花凝集素；信号转导子和转录激活子1。
图7。
图7。
AA处理野生型小鼠肾皮质中Stat1、Tgfb1、Col1a1、Col3a1和Fn1 mRNA的稳定水平增加。在研究中，四组小鼠的肾皮质中测定了稳态信使核糖核酸水平(n个 = 5-9只小鼠/组）。AA治疗组野生型小鼠的皮层组织显示I型胶原α稳态mRNA增加1（Col1a1），III型胶原-α1（Col3a1）、纤维连接蛋白（Fn1）、转化生长因子-β1（Tgfb1）和Stat1，但不包括I型胶原-α5（Col4a5），与状态1−/−在每个实验中，AA治疗组小鼠和车辆治疗组小鼠。数据采用双向方差分析和Tukey多重比较检验进行分析。AA，马兜铃酸；Stat1，信号转导子和转录激活子1。
图8。
图8。
删除状态1阻止AA治疗后间质胶原沉积的发展。A类：苦味酸染色检测到四组（6-7只小鼠/组）肾脏切片间质中存在胶原蛋白（红色、绿色和黄色荧光）。每组的代表性图像如图G肾小球所示。用苏木精对细胞核进行复染。白色条=100 微米。B类：使用图像处理程序（ImageJ，v.1.51，NIH）对染色切片进行量化，并在×40放大倍数下检查偏振显微镜图像。STAT1的存在与实验治疗之间的相互作用是显著的[F类(1, 23) = 14.21,P（P）= 0.0010]. AA-处理过的幼崽中观察到的胶原蛋白沉积增加在AA-处理的幼仔中没有观察到状态1−/−老鼠*P（P）<0.0002，与其他三组相比（双向方差分析和Tukey多重比较试验）。AA，马兜铃酸；STAT1、信号转导子和转录激活子1。
图9。
图9。
治疗组野生型小鼠肾皮质中的纤维结合蛋白增加。A类：肾皮质裂解物的Western blot分析显示，AA治疗后野生型小鼠的纤维连接蛋白增加(n个 = 每组4只小鼠）。B类：STAT1的存在与实验治疗之间的相互作用是显著的[F类（1，12） = 8.103,P（P）= 0.0147]. 与对照组和状态1−/−治疗组小鼠、野生型小鼠在治疗组中表现出增加(*P（P）<0.05）纤维连接蛋白水平（Tukey多重比较试验的双向方差分析）。AA，马兜铃酸；信号转导子和转录激活子1。
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参考文献

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