Enteric glia as a source of neural progenitors in adult zebrafish

doi:10.7554/eLife.56086

.2020年8月27日：9:e56086。

doi:10.7554/eLife.56086。

作为成年斑马鱼神经祖细胞来源的肠神经胶质

附属机构

¹英国伦敦弗朗西斯·克里克研究所神经系统实验室的开发和平衡。
²英国伦敦弗朗西斯·克里克研究所生物信息学和生物统计科学技术平台。
³电子显微镜科学技术平台，弗朗西斯·克里克研究所，英国伦敦。
⁴神经发育实验室，弗朗西斯·克里克研究所，英国伦敦。
⁵英国巴斯大学生物与生物化学系。
⁶临床药理学和定量药理学，临床药理学和安全科学，研发，阿斯利康，剑桥，英国。

PMID： 32851974
预防性维修识别码：项目管理委员会7521928
内政部： 10.7554/寿命56086

成年斑马鱼肠道神经胶质细胞作为神经祖细胞的来源

莎拉·麦卡勒姆等。埃利夫. 2020.

.2020年8月27日：9:e56086。

doi:10.7554/eLife.56086。

附属机构

¹英国伦敦弗朗西斯·克里克研究所神经系统实验室的开发与平衡。
²英国伦敦弗朗西斯·克里克研究所生物信息学和生物统计科学技术平台。
³电子显微镜科学技术平台，弗朗西斯·克里克研究所，英国伦敦。
⁴神经发育实验室，弗朗西斯·克里克研究所，英国伦敦。
⁵英国巴斯巴斯大学生物和生物化学系。
⁶临床药理学和定量药理学，临床药理学与安全科学，研发，阿斯利康，英国剑桥。

PMID： 32851974
预防性维修识别码：邮编7521928
内政部： 10.7554/寿命56086

摘要

脊椎动物肠道神经系统（ENS）中神经祖细胞的存在和身份是一个激烈争论的问题。在此，我们证明硬骨鱼类的非神经元ENS细胞室与哺乳动物肠神经胶质细胞具有相同的分子和形态学特征，但无法通过典型神经胶质标记的表达来识别。然而，与它们的哺乳动物对应物不同的是，它们通常处于静止状态，在体内平衡期间不进行神经元分化，我们发现斑马鱼肠道神经胶质细胞在生理条件下增殖，从而产生分化为肠道神经元的子代。我们还提供证据表明，与脑神经干细胞类似，肠神经胶质细胞的激活和神经元分化受Notch信号调节。我们的实验揭示了硬骨鱼类肠神经胶质细胞和脑神经干细胞之间的显著相似性，并为利用哺乳动物肠神经胶质作为神经元的潜在来源，恢复因损伤或疾病而受损的肠神经回路的活动开辟了新的可能性。

关键词：发育生物学；肠神经系统；胶质细胞；神经嵴；神经祖细胞；神经科学；干细胞；斑马鱼。

PubMed免责声明

利益冲突声明

SM、YO、EF、SB、CP、QX、SH、RK、LC、DW、VP、TH没有宣布竞争利益，CP Carmen Pin隶属于阿斯利康。作者没有经济利益需要申报。

数字

图1。 — **图1斑马鱼ENS的非神经元隔室相对较小，无法使用典型胶质标记物进行识别。**
(A类)7 dpf肠道的共焦图像*Tg（sox10:Cre；樱桃）*幼虫对樱桃（红色，顶部）和HuC/D（青色，中部）进行免疫染色（n=13）。底部面板是Cherry和HuC/D信号的合并。插图显示了方框区域的高放大率。箭头指向樱桃⁺户口C/D⁺单元格和箭头指向樱桃⁺户口C/D^-单元格。虚线描绘肠道。开放箭头表示樱桃⁺NC-衍生黑素细胞（M），存在于肠外。(B类)樱桃（红色，顶部）和HuC/D（青色，中部）成年斑马鱼肠道ENS免疫染色共聚焦图像（n=13）。底部面板是Cherry和HuC/D信号的合并。插图显示了方框区域的高放大率。箭头指向樱桃⁺户口C/D⁺单元格和箭头指向Cherry⁺户口C/D^-细胞。(C类)神经元定量（樱桃⁺HuC/D公司⁺)和非神经元（Cherry⁺户口C/D^-)内部的蜂窝隔间*索10*-7 dpf时的血统和成年斑马鱼，n=13个生物复制品，数据为平均值±SD。(D类)7 dpf斑马鱼幼虫肠道S100β（绿色）和HuC/D（红色）免疫染色的共焦图像。尽管肠内神经元丰富（n=30），但ENS中未检测到S100β信号。(E类)7 dpf肠道的共焦图像*Tg（gfap:GFP）*幼虫免疫染色GFP（绿色）和HuC/D（红色）。尽管HuC/D丰富，但肠道内未发现GFP信号⁺神经元（n=50）。GFP公司⁺观察到与脊神经相关的纤维向肠道下降，但从未进入肠道（开放箭头）。D和E中的虚线描绘了肠道。(F类)S100β（绿色）和HuC/D（红色）对成年斑马鱼ENS进行免疫染色（n=5）。(**G公司**)成人ENS的免疫染色*Tg（gfap:GFP）*带有GFP（绿色）和HuC/D（红色）的斑马鱼（n=13）。S100β(F类)和GFP(**G公司**)尽管存在HuC/D，但信号缺失⁺神经元。所有共焦图像都是短共焦叠加的最大投影。合并面板中显示50µm标尺。

图1——图补充1。 — **图1补充图1。ENS谱系追踪显示，存在一个小的非神经元谱系，使用典型胶质标记物BFABP、GFAP抗体或转基因报告物都无法检测到。**
(A类)使用*Tg（SAGFF234A；UAS:GFP）*用GFP（绿色）标记ENS谱系，我们观察到这些细胞中的大多数是HuC/D⁺神经元（青色）（n=9）。(B类)A中方框的高倍视图，箭头表示GFP⁺户口C/D⁺ENS神经元和箭头指示GFP⁺户口C/D^-非神经元ENS细胞。(C类)本研究中使用的各种转基因报告系标记HuC/D能力的效率比较⁺7 dpf幼虫内的ENS神经元。*Tg（SAGFF234A；无人机系统：GFP）*标记HuC/D的87.8%±2.8⁺ENS神经元，Tg（sox10Cre；Cherry）标记HuC/D的47.1%±19.9⁺ENS神经元和Tg（sox10:Cre；ef1a:loxP-GFP-loxP-DsRed2）标记HuC/D的80.8%±7.8⁺ENS神经元。数据以平均值±SD表示，n=9个生物重复。(D类)HuC/D比例比较⁺ENS神经元（蓝色）与HuC/D^-非神经元ENS细胞（红色）由7dpf ENS谱系内的各种转基因报告细胞系标记。大多数由Tg（sox10Cre；Cherry）或Tg（sox10:Cre；ef1a:loxP-GFP-loxP-DsRed2）谱系报告系标记的细胞是神经元，每个标记约85%HuC/D⁺细胞和15%HuC/D^-细胞（分别为84.8%±7.7%和15.2%±7.7%vs.86.8%±6.4和13.2±6.4%），无显著差异（p=0.78）。*Tg（SAGFF234A；UAS:GFP）*HuC/D标签93.7%±3.0⁺神经元和HuC/D的6.2%±3.0^-细胞，与sox10预驱动谱系报告者相比，比例细胞类型标记效率存在显著差异（分别为p=0.0078和p=0.09）。数据以平均值±SD表示，n=9个生物重复。(**E–J公司**). 斑马鱼幼体ENS未标记BFABP和GFAP抗体。(E类)BFABP（绿色）无法标记7dpf肠道中的EGC，尽管HuC/D神经元（红色）很容易检测到（n=20）。(F类)哺乳动物GFAP抗体（mGFAP，绿色）不能检测到7dpf肠道中的细胞，尽管可以检测到HuC/D阳性神经元（红色）（n=26）。相反，mGFAP纤维向肠道下降，但没有进入肠道（箭头）。(**G–H（G–H）**)一种针对斑马鱼GFAP（zGFAP）的抗体可以检测到位于HuC/D附近的7 dpf肠道（红色，箭头）中丰富的环形纤维⁺ENS神经元（蓝色）。然而，在含有ENS神经元（G，n=6）和*ret（雷特）^{hu2846/hu2846}*由于Ret受体酪氨酸激酶突变和ENS祖细胞未能在肠道定植（H，n=6）（HuC/D⁺神经元仅出现在G，蓝色）。(**I–J型**)7 dpf的免疫染色*Tg（SAGFF234A；UAS:GFP）*带有另一种针对斑马鱼GFAP（zrf-1）的GFAP抗体的幼虫也显示出丰富的环状纤维（红色，箭头），在含有ENS神经元（绿色）（I，n=10）和*ret（雷特）^{hu2846/hu2846}*缺乏ENS神经元的幼虫（绿色，J，n=10），表明这些纤维与ENS谱系无关。(**K–O型**)在上述实验中检测ENS神经胶质细胞的抗体能够成功标记7dpf脊髓中的CNS神经胶质细胞：S100b（K，n＝30）、BFABP（L，n＝20）、mGFAP（M n＝26）、zrf-1（n，n＝20，）zGFAP（O，n＝12）。(**P（P）**)GFP的预期模式⁺在7dpf的脊髓内检测到细胞*Tg（gfap:GFP）*幼虫（n=50）。(**问-答**)使用各种抗体和转基因工具对成人肠道组织进行分析，以识别CNS胶质细胞。(问)尽管HuC/D（红色）识别HuC/D，但在成人肠道中未检测到BFABP⁺肠神经元（n=9）。(**R（右）**)虽然使用zGFAP抗体（绿色）在成人肠道中检测到信号，但在细胞体中未发现条纹信号，也未与HuC/D神经元（红色）明确相关，染色模式令人想起7dpf（n=12）时看到的非ENS相关染色。(**S公司**)GFP公司⁺成人未观察到细胞*Tg（−3.6nestin:GFP）*肠道组织，尽管已检测到HuC/D⁺神经元（红色）（n=4）。所有共焦图像都是短共焦叠加的最大投影。合并面板中的50µm标尺(**A、 E–J、Q–S**)或单色图像(**K–P（K–P）**).

图2。 — **图2成年斑马鱼ENS的转录组分析。**
(A类)成人ENS核分离的实验策略*Tg（sox10:Cre；樱桃）*肠道和核RNAseq。每个条件进行五次生物复制。(B类)火山图显示平均对数₂折叠变化（x轴）和重要性（-log₁₀樱桃差异表达基因的调整p值（y轴）⁺相对于Cherry^-核。ENS的基因特征以红色突出显示，在樱桃中更为丰富⁺核，而具有非神经外胚层谱系特征的基因，如平滑肌（紫色）、Cajal间质细胞（绿色）和免疫相关（蓝色），在樱桃中更为丰富^-核。(C类)火山图（如图B所示）中，先前在幼体ENS神经元转录特征中确定的基因（Roy-Carson等人，2017年）以黄色显示。这些包括已建立的神经元标记物，例如*phox2bb型*,*ret（雷特）*,*弹性3*,*弹性4*,贵宾、和*纳米单位*樱桃中富含的基因⁺幼虫ENS神经元转录组中缺失的核种群以黑色显示。这些包括*索10*,*狐狸d3*,*sox2*,*plp1*，哺乳动物同源基因由小鼠EGC表达，*tfap2a，*早期NC发育所需的基因*，col28a1b*其哺乳动物直系亲属是外周神经胶质标记*ptprz1a型*、和*ptprz1b型*已在胶质母细胞瘤干细胞中鉴定。padj<0.05的基因（Log₁₀p值<1.3）和/或对数₂FC<0以灰色显示。(**D、 E类**)荧光共焦图像就地使用探针进行杂交（RNAscope）*索10*(D类)和*狐狸d3*(E类)关于成年人*Tg（sox10:Cre；樱桃）*对Cherry（ENS谱系）和HuC/D（ENS神经元）的肠外肌层制剂进行免疫染色。两者的信号*索10*和*狐狸d3*（白色箭头）对应于非神经元细胞（樱桃⁺户口C/D^-，箭头），但肠道神经元（樱桃⁺户口C/D⁺，箭头）。(F类)成人免疫染色*Tg（sox10:Cre；樱桃）*内脏为Sox2（蓝色）、Cherry（红色）和HuC/D（绿色）。Sox2由非神经元ENS细胞特异表达。生物复制品：D，n=4；E、 n=6；F、 n＝5。所有共焦图像都是短共焦叠加的最大投影。合并面板中显示的10µm比例尺。

**图2-图补充1。成年斑马鱼ENS细胞核的转录图谱确定了神经元和胶质细胞的图谱。**
(A类)显示成人外肌层细胞核的典型FACS图*Tg（sox10:Cre；樱桃）*斑马鱼内脏在单个完整的DAPI上⁺核。m樱桃色⁺收集到的细胞核不到初始种群的1%。等效数量的mCherry^-同时收集细胞核。(B类)成人肠道转录组的主成分分析揭示了Cherry对样本的分离⁺vs.樱桃^-表达（30%的变异性在PC1中解释，13%在PC2中解释）。每种条件的五个生物复制。(**C–H型**)樱桃成虫肠道分析⁺vs樱桃^-转录组数据与先前公布的数据和公开可用的参考数据进行比较。成年肠道樱桃⁺vs樱桃^-筛选转录组数据（补充文件1），以选择对数折叠变化>0的基因（在樱桃中⁺vs樱桃^-)p值<0.05。结果集丰富了具有统计学意义的斑马鱼ENS相关基因。(C类)基因集富集分析表明，GO生物过程在樱桃中富集⁺人群包括神经系统相关术语。(**D–E型**)代表性基因集的富集图(D类)突触信号和(E类)樱桃中神经元细胞间黏附丰富⁺样品。(F类)聚类热图显示了斑马鱼幼体ENS神经元中丰富的基因列表的表达（来自Roy-Carson等人，2017），该热图在我们的成年斑马鱼肠道转录组数据中进行了分析。我们观察到，超过750个神经表达基因在樱桃中富集⁺与樱桃相关的样品^-样本（补充文件2），并且这些是候选成年ENS神经元相关基因。这些包括*phox2bb公司*,*phox2a型*,*ret（雷特）*,*elavl3型*,*elavl4型*,贵宾、和*国家计量单位*. (**G公司**)聚类热图显示哺乳动物Plp1中富集的前25个基因⁺具有斑马鱼同源基因且在樱桃中上调的胶质细胞（Rao等人，2015）⁺vs樱桃^-样本，揭示了九个候选斑马鱼ENS胶质细胞相关基因。跨谱比较（斑马鱼到老鼠）利用公开可用的同源性分配资源（参见方法）。(**H（H）**)聚类热图显示去除与斑马鱼ENS神经元相关的基因后，成年斑马鱼的ENS转录组中的基因表达（见上文C部分）。鉴定出600多个独特的基因（补充文件6），这些基因是候选的成年ENS非神经元或ENS胶质细胞相关基因。这些包括*索10*,*狐狸d3*,*tfap2a公司*,*sox2*,*col28a1b类*,*plp1b*,*ptprz1a型*和*ptprz1b型*.

图2——图补充2。 — **图2补充图2。斑马鱼ENS转录组与小鼠ENS神经元和ENS胶质细胞的单细胞转录组数据集的比较。**
(A类)显示樱桃差异表达基因对数2倍变化的散点图⁺和樱桃^-本文中展示的成年斑马鱼体转录组研究样本（X轴），以及Zeisel及其同事发布的已发布单细胞数据集中小鼠ENS神经元和ENS胶质细胞差异表达基因的对数倍变化（Zeisel等人，2018）（Y轴）。补充文件3中的完整数据（另请参见方法和图2-图补充3）。在右下象限中可以找到Cherry+中的基因和小鼠神经元中的基因，示例基因以红色突出显示。在右上象限中，可以找到Cherly+中和小鼠胶质细胞中的基因。示例基因以绿色突出显示。(B类)聚类热图显示了在本研究的成年斑马鱼肠道转录组数据中分析的小鼠ENS神经元中富集的366个基因列表（logFC>0.2小鼠神经元vs.胶质细胞），其斑马鱼同源基因在樱桃+种群中富集（logFC>0，p值≤0.05）。选择显示的基因（完整的基因列表和补充文件4中显示的相应数据）。(C类)聚类热图显示了在本研究的成年斑马鱼肠道转录组数据中分析的富含小鼠ENS胶质细胞的63个基因列表（logFC>0.2小鼠胶质细胞vs.神经元），其斑马鱼同源基因富含樱桃+种群（logFC>0，p值≤0.05）（完整的基因列表和相应数据显示在补充文件5中）。

图2——图补充3。 — **图2补充图3。询问小鼠单细胞转录组数据集，以确定小鼠ENS神经元和ENS胶质细胞的特征基因。**
使用Zeisel等人2018年的小鼠单细胞转录组数据，该数据从Linnarsson实验室网站下载(https://storage.googleapis.com/linnarsson-lab-loom/l1_enterinc.lowen)，数据按照方法一节中的描述进行处理，以确定主要是神经元和胶质细胞簇之间的差异基因表达。UMAP中显示的集群(A类)被标记为神经或胶质(B类)基于已知神经表达基因Elavl3、Elavl4、Prph的表达(C类)，或已知的胶质细胞表达基因，Sox10、S100b和Gfap(D类). (E类)对具有增殖特征的基因的检查（Top2A和Ki67在此显示为实例）表明簇5富含增殖性ENS神经胶质。(F类)第五组包含约300个细胞，占数据集分析中约15000个胶质细胞的1.9%。这与Zeisel等人在2018年的原始出版物中确定的增殖型ENS胶质簇ENTG1相对应，该簇占ENS胶质的1.6%。

图3。 — **图3her4.3:EGFP（EGFP）转基因是成年斑马鱼ENS非神经元细胞群的一个新标记。**
(A类)成人共焦图像*Tg（her4.3:EGFP）*斑马鱼肠道GFP（绿色）和HuC/D（红色）免疫染色。插图是框状区域的高倍放大图，显示GFP⁺单元格（箭头）与HuC/D密切相关⁺神经元（箭头）（n=70）。(B类)神经元定量（樱桃⁺户口C/D⁺GFP公司^-，蓝色）和非神经元细胞群（樱桃⁺户口C/D^-GFP公司⁺和樱桃⁺户口C/D^-GFP公司^-（分别为绿色和红色）*Tg（her4.3:EGFP；sox10:Cre；樱桃）*斑马鱼（n=3）。数据以平均值±SD表示。(C类)成人ENS共焦图像*Tg（her4.3:EGFP；sox10:Cre；樱桃）*斑马鱼的樱桃（红色）、GFP（绿色）和HuC/D（青色）免疫染色。注意Cherry的存在⁺户口C/D^-GFP公司⁺（箭头）和樱桃⁺HuC/D公司^-GFP公司^-（灰色箭头）细胞以及樱桃的存在⁺户口C/D⁺GFP公司^-神经元（白色箭头）（n=3）。注意Cherry⁺樱桃的细胞核大小相等⁺户口C/D^-GFP公司⁺（箭头），樱桃⁺户口C/D^-GFP公司^-（灰色箭头）单元格和樱桃⁺户口C/D⁺GFP公司^-神经元（白色箭头）。(D类)成人免疫染色*Tg（her4.3:EGFP；sox10:Cre；樱桃）*带有樱桃（红色）、GFP（绿色）和Sox2（蓝色）抗体的肠道。箭头指向表示所有三个标记的单元格（n=3）。(E类)RNAscope分析*ret（雷特）*（红色）和*索10*（白色）成人ENS制剂*Tg（her4.3:EGFP）*)斑马鱼肠道GFP免疫染色（绿色）。注意GFP⁺单元格（箭头）表示*索10*和发现于附近*ret（雷特）*⁺GFP公司^-肠神经元（灰色箭头）（n=4）。(F类)组合RNA范围*狐狸d3*成人GFP、Cherry和Sox2免疫染色*Tg（her4.3:EGFP；sox10:Cre；樱桃）*直觉表明*狐狸d3*和Sox2在一些ENS细胞（白色箭头）和其他GFP中共同表达⁺单元格仅表示Sox2（灰色箭头）。所有共焦图像都是短共焦叠加的最大投影。合并面板中的比例尺：(A类)50微米(**C–E类**)10微米。

图3——图补充1。 — **图3：图补充1。Her4.3GFP转基因细胞系识别出具有表明成年ENS中EGC不同亚型的形态的细胞。**
来自的成人肠道的免疫组织化学*Tg（her4.3:EGFP）*允许表征GFP的细胞形态⁺细胞和与哺乳动物EGC亚型的比较（Boesmans等人，2015）。(A类)GFP表达细胞（绿色）与神经元密切相关，神经元在细胞体中表达HuC/D，在细胞过程中表达AcTu（红色）（n=70）。插图显示框状区域的高倍视图，标记神经元（星号）、GFP表达（箭头）和高度分支的GFP表达细胞过程（箭头）。(**B–E类**)在*Tg（her4.3:EGFP）*⁺单元格：(B类)GFP公司⁺肌层（箭头）中的细胞，其突起似乎包裹在HuC/D周围⁺细胞体（红色，星号），类似于I型哺乳动物EGC（插图）(C类)GFP公司⁺肌间层（箭头）中的细胞具有沿着AcTu延伸的细长突起（箭头）⁺神经元突起（红色），类似于II型哺乳动物EGC（插图）(D类)GFP公司⁺靠近粘膜层（箭头）的细胞，如粘膜上皮（ep，DAPI突出显示的细胞核为灰色），类似于哺乳动物III型EGC（插图），以及(E类)双极GFP⁺肌肉层（箭头）内的细胞，与AcTu相关⁺神经元纤维（红色，箭头），类似于IV型哺乳动物EGC（插图）。插图改编自Boesmans等人，2015年。所有共焦图像都是短共焦叠加的最大投影。合并面板中的比例尺：50µm(A类)和10µm(**B–E类**).

**图4。。*her4.3:EGFP（EGFP）*成年斑马鱼ENS中的表达细胞具有哺乳动物肠神经胶质细胞的超微结构特征。**
(**A和C**)电子显微照片（z-stack#903英寸A类和#1039英寸C类)来自成人中肠的3D感兴趣区域*Tg（her4.3:EGFP；SAGFF217；UAS:mmCherry）*斑马鱼。插图显示了EGFP的超分辨率光学显微镜图像⁺非神经元细胞和mmCherry⁺与电子显微照片的方框区域相对应的神经元。EGFP⁺细胞体大小约为79.6µm³(A类)和~79.1µm³(C类)投影长度从4µm的片状工艺到18µm以下的较长延伸段不等。相比之下，mmCherry⁺神经元的细胞体大小约为398.8µm³(A类（左）和229.7µm³(A类，右侧），投影长度范围为16µm至55µm。(**B和D**)方框区域的高分辨率图像，如A所示(B类)和C(D类). EGFP⁺细胞为绿色，肠神经元为红色。黑色箭头表示EGFP之间的接触点⁺流程和mmCherry⁺神经元。黄色箭头表示GFP⁺分隔轴突束的片状延伸（白色星号）。EGFP细胞核中的核沟纹⁺单元格用黑色箭头表示。两名成年人扫描的六个感兴趣区域的代表性图像。所有图像都是一个z平面。比例尺：10µm(**A、 C类**和插图**A、 C类**)和1µm(**B、 D类**).

图4——图补充1。 — **图4补充图1。相关光电子显微镜确定成人的胶质样特征*Tg（her4.3:EGFP）*表达细胞。**
(A类)在成年斑马鱼中，HuC/D的一个亚群⁺ENS神经元（绿色）突出显示为*Tg（SAGFF217；UAS:mm樱桃色）*，和Cherry表达（红色，箭头）填充了细胞体和丰富的表达细胞的过程（红色）。HuC/D上的剩余比例⁺单元格（绿色）不表示樱桃（箭头）（n=12）。共焦图像是短共焦叠加的最大投影。(B类)成人切片的电子显微镜图像*Tg（her4.3:EGFP；SAGFF217；UAS:mmCherry）*显示有组织层的肠道，假彩色以描绘GFP的位置⁺如插图所示的超分辨率图像中显示的单元格。注意这部分的神经元和轴突不是樱桃⁺神经元。图像描述了单个z平面。(C类)框状区域的高倍视图，显示了分离轴突束的锯齿状核（箭头）和放射状延伸（黄色箭头，星号表示轴突束），以及许多与神经元细胞体接触的神经元细胞体（用N表示神经元细胞体）。EGFP⁺细胞体大小为79.1µm³最长投影长度为9µm。两名成年人扫描的六个感兴趣区域的代表性图像。比例尺：10µm(**A、 B类**)和1µm(C类).

图5。 — **图5.的实时图像*Tg（her4.3:EGFP）⁺*斑马鱼ENS发育过程中的细胞个体发生。**
(**A–D**)定时录制的静态图像*Tg（her4.3:EGFP；SAGFF234A；UAS:mmCherry）*胚胎成像从56 hpf（表示为00:00）到96 hpf（40:00），这是n=18个生物复制的典型例子。00:00时(A类)mm樱桃⁺NC细胞的波前（红色，红色箭头）位于视野（FOV）的嘴侧，没有EGFP⁺存在单元格（灰色）。05:30(B类)，第一个EGFP⁺mmCherry中出现单元格（灰色，箭头）⁺迁移波前后面的NC细胞柱（红色）。亮绿色荧光蛋白⁺黑色素细胞被指定（灰色箭头）。(C类)19:50时，NC单元格列延伸至整个FOV和EGFP数量⁺单元格（灰色，箭头）增加。白色箭头指向EGFP⁺细胞呈现圆形形态，可以在随后的延时图像中看到分裂。越来越多的明亮GFP⁺黑素细胞出现（灰色箭头），在时间推移记录中相对静止。(D类)录制结束时（40:00），EGFP⁺细胞（灰色）遍布肠道（白色箭头）。丰富明亮的GFP⁺黑素细胞存在于肠道区域（灰色箭头），其特征形态明显。(E类)mmCherry细胞位移的量化（与参考点/时间的归一化距离）⁺波前（红色）和EGFP⁺细胞（绿色），数据描述了四条鱼的132个细胞。数据以平均值±SD表示。所有共焦图像都是短共焦叠加的最大投影。50µm标尺，单位为A。

**图5——图补充1。世系分析表明*Tg（her4.3:EGFP）*表达细胞来源于引起ENS的胚胎NC细胞群。**
(**A–C**)分析使用*Tg（her4.3:EGFP；SAGFF234A；UAS:mmCherry）*允许*her4.3:EGFP（EGFP）⁺*与樱桃相关的待检查细胞⁺在发育过程中定居于肠道的迁移性NC细胞群。 (A类)54 hpf时，无GFP⁺细胞（绿色）存在于肠道中，在迁移的NC细胞群中未检测到任何细胞（红色），尽管NC细胞衍生的HuC/D⁺此时出现ENS神经元（蓝色）。装箱区域（n=30）的高倍视图中显示的单通道。(B类)在60 hpf时，在肠道定植的NC细胞流中可以看到少量弱表达GFP的细胞（绿色，箭头）（红色）。GFP公司⁺细胞靠近HuC/D⁺单元格（蓝色）。注意，可以检测到强烈表达GFP的细胞，但这些细胞不构成NC细胞迁移流的一部分（红色），并且在肠道外（灰色箭头），很可能是黑色素细胞（n=30）。方框区域的高放大视图中显示的单个通道。(C类)在4 dpf时，在迁移的NC细胞流（红色）中发现GFP强表达细胞和弱表达细胞（绿色，箭头）数量增加。装箱区域（n=20）的高倍视图中显示的单通道。(D类)7 dpf时*Tg（her4.3:EGFP）*幼虫表达GFP的细胞（绿色、箭头）与HuC/D密切相关，但有别于HuC/D⁺阳性神经元（红色）（n=45）。偶尔可见HuC/D与表达低水平GFP（开放箭头）的细胞重叠。所有共焦图像都是短共焦叠加的最大投影。合并面板中的比例尺：50µm。

图6。 — **图6成年her4.3:EGFP的增殖和神经原性分化⁺内稳态期间的ENS细胞。**
(A类)实验设计示意图。成人*Tg（her4.3:EGFP）*斑马鱼在1mM EdU中浸泡三天，并在EdU脉冲后0（t0）、4（t4）或11（t11）天进行分析。(**B–C类**)在t0收获的EdU（红色）脉冲动物肠道的GFP（绿色）和HuC/D（蓝色）免疫染色(B类)和t4(C类). 箭头（B和C中）指向GFP⁺户口C/D^-教育部⁺细胞。箭头（C）表示GFP^-户口C/D⁺教育部⁺神经元。B-C合并面板中的10µm标尺。所有共焦图像都是短共焦叠加的最大投影。(D类)GFP百分比的量化⁺在t0、t4和t11用EdU标记的细胞（平均值±SD）。(E类)用生物复制品t0 n=6，t4 n=5，t11 n=5（平均值±标准差）量化t0，t4和t11处EdU标记的肠神经元百分比(F类)EdU标记HuC/D密度的计算分析策略⁺和EGFP⁺细胞。教育部⁺GFP公司⁺细胞位于半径和EdU密度增加的同心圆的中心⁺GFP公司⁺和教育部⁺户口C/D⁺计算每个圆内的细胞数。半径为40μm的圆形（黄色）的示例以更高的放大倍数显示。(**G公司**)EdU的记录密度（红色图）和模拟密度（蓝色图）⁺户口C/D⁺和EdU⁺GFP公司⁺EdU周围半径（x轴）增大的同心圆中的单元格（y轴）⁺GFP公司⁺细胞。EdU随机分布的蒙特卡罗模拟⁺户口C/D⁺或EdU⁺GFP公司⁺每个数据集的细胞数执行了2000次以上，以确定随机混合人群中出现的基线密度。误差条表示平均±90%置信区间。在所有分析的时间点，记录EdU的密度⁺户口C/D⁺和EdU⁺GFP公司⁺细胞位于20-60μm圆圈（用星号表示）中模拟密度的置信区间（bars）以上。(**H、我**)EdU标记樱桃百分比的量化⁺户口C/D⁺神经元(**H（H）**)和樱桃⁺GFP公司^-户口C/D^-单元格(我)肠中t0、t4和t11her4.3:gfp；sox10:Cre；樱桃根据面板A所示的方案，用EdU脉冲标记转基因，生物复制品：t0 n=6；t4，n=5；t11 n=6（平均值±标准偏差）*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图6——图补充1。 — **图6——图补遗1Tg（her4.3:EGFP）细胞在成体体内平衡中积极增殖。**
(A类)成人*Tg（her4.3:EGFP）*斑马鱼扁平肠的GFP（绿色）和细胞周期标记物MCM5（红色）免疫染色。积极增殖的GFP⁺MCM5型⁺在整个肠道内观察到细胞（箭头所示）。大多数GFP⁺人口保持静止（箭头）。共焦图像是短共焦叠加的最大投影。比例尺：合并面板中的10µm。(B类)GFP百分比的量化⁺MCM5型⁺细胞超过总GFP⁺种群（n=3）。数据以平均值±SD表示。

图6——图补充2。 — **图6——图补充2..成人*Tg（her4.3:EGFP）*细胞吸收EdU并出现在双倍体中。**
(A类)实验设计示意图：浸泡3个月大的成人*Tg（her4.3:EGFP）*斑马鱼在1 mM EdU脉冲中生活三天，然后恢复正常的斑马鱼水。然后在0天（t0）、4天（t4）或11天（t11）的追逐期后将动物剔除，并分析EdU掺入情况（t0 n=6，t4 n=5，t11 n=5）。(**B–D类**)在0天追踪中，大多数EdU标记为GFP⁺（黄色）细胞位于双倍体中（两个贴有标签的细胞靠近）。这些单元格是：(B类)两者都表达高水平的GFP（绿色，箭头）(C类)出现一个高GFP表达细胞（箭头所示）和一个低GFP表达的细胞（箭头）(D类)在较大的分组中，EdU标记与GFP表达水平较低的细胞相关（箭头），而在GFP高表达细胞中未观察到（箭头）。共焦图像是短共焦叠加的最大投影。合并面板中的比例尺：10µm(**B–D类**).

图6——图补充3。 — **图6补充图3。稳态条件下成年斑马鱼肠道神经胶质细胞作为神经祖细胞来源的工作模型。**
鉴于两者之间的相似性*Tg（her4.3:EGFP）*⁺EGC和*Tg（her4.3:EGFP）*⁺RGC，我们建议，与RGC一样，EGC可能以两种形式存在：*Tg（her4.3:EGFP）*⁺静态EGC（qEGC）和*Tg（her4.3:EGFP）*⁺激活的EGC（aEGC），后者具有增殖性，在我们的实验中可以吸收EdU（用蓝色表示）。我们认为aEGC是一个自我更新的群体，也可能恢复到静止状态。增殖的aEGC群体可以产生肠神经前体细胞（eNP；致力于神经原谱系的细胞），这些细胞可以保留EdU，但*Tg（her4.3:EGFP）*^-并且还不能表达HuC/D。这些细胞与樱桃细胞相对应⁺GFP公司^-户口C/D^-教育部⁺图6I中量化的细胞，在我们的实验的EdU标记期间增加。最后，神经祖细胞经历了完全的神经元分化（eN），可以用HuC/D检测，也可以用EdU检测⁺在我们的实验中。这些细胞与樱桃细胞相对应⁺GFP公司^-户口C/D⁺教育部⁺在图6H中量化，在我们的EdU标记实验过程中也增加了。

图7。 — **图7 Notch信号调节成年斑马鱼EGC的激活和分化。**
(A类)成年斑马鱼LY/EdU治疗实验方案示意图。(**B–E类**)Notch抑制对增殖影响的量化(**B和D**)和神经元分化(**C和E**)3-4个月大的EGC(**B和C**)和6-7个月大(**D和E**)动物。N=每种条件下4次生物复制。数据以平均值±SD表示***p<0.001。

图7——图补充1。 — **图7图补充1.成年人的Notch抑制导致GFP表达的损失*Tg（her4.3:EGFP）*转基因。**
(A类)DMSO处理7天后*Tg（her4.3:EGFP）*转基因（绿色）和HuC/D在成年ENS中清晰可见⁺神经元（红色）（另见高倍插图）。(B类)使用γ-分泌酶抑制剂LY411575治疗7天后*Tg（her4.3:EGFP）*观察到表达（另见高倍放大插图）。图像是短共焦叠加的最大投影。B合并面板中的左侧插图显示了B中图像的单个z平面，并表明GFP染色突出了多个相互连接的GFP⁺细胞，具有几个不同的Dapi⁺GFP公司⁺显示了原子核（箭头）。n=4个生物复制/条件。合并面板中的比例尺：50µm。

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1. Alunni A、Krecsmarik M、Bosco A、Galant S、Pan L、Moens CB、Bally-Cuif L.Notch3信号通路阻断细胞周期进入并限制成年大脑皮层中神经干细胞的扩增。发展。2013;140:3335–3347. doi:10.1242/dev.095018。-内政部-项目管理委员会-公共医学
1. Alunni A，Bally-Cuif L.脊椎动物再生神经发生的比较观点。发展。2016;143:741–753. doi:10.1242/dev.122796。-内政部-项目管理委员会-公共医学
1. Asakawa K、Suster ML、Mizusawa K，Nagayoshi S、Kotani T、Urasaki A、Kishimoto Y、Hibi M、Kawakami K。通过Tol2转座子介导的Gal4基因和增强子捕获斑马鱼的神经回路的遗传解剖。美国国家科学院。2008;105:1255–1260. doi:10.1073/pnas.0704963105。-内政部-项目管理委员会-公共医学
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