斑马鱼ENS的非神经细胞与哺乳动物EGC早期NC细胞和ENS祖细胞标记物共享

为了进一步探索斑马鱼非神经元ENS细胞室的基因表达谱，我们对从斑马鱼体内分离的荧光标记细胞核（nRNAseq）进行了批量RNA测序Tg（sox10:Cre；樱桃）成人肠外肌层。我们最近描述的这个策略(Obata等人，2020年)避免了组织分离和细胞分离的冗长程序，这些程序通常会导致相当大的细胞损伤。由于现有的转基因工具不允许我们明确标记非神经元ENS细胞室，因此对FACS（荧光激活细胞分选）纯化的细胞核进行了大量nRNAseq，FACS代表樱桃⁺（整个ENS）和Cherry^-（非ENS）外肌层细胞群Tg（sox10:Cre；樱桃）斑马鱼肠(图2A和图2——图补充1A; 另请参见材料和方法）。主成分分析（PCA）表明樱桃的分离很明显⁺和樱桃^-沿着PC1的核转录组(图2——补充图1B)，表明沿该轴的变异性主要由两个细胞群体的谱系起源（NC与非NC）决定。正如预期的那样，与非NC组织（如平滑肌细胞）相关的基因(我的11a,计算1a,srfa公司,gata6型)，Cajal间质细胞(阳极1,基塔,小工具)和免疫细胞(lcp1基因,lck公司,里兹)，在樱桃中上调^-核转录组(图2B)。相反，与NC-derived ENS谱系相关的基因（例如弹性体3,elavl4型,转塔,贵宾,茶太,sox10型)在樱桃园被上调⁺核人口(图2B)（GEO数据库{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE145885”，“term_id”：“145885”}}GSE145885;补充文件1; 可在以下位置找到用于浏览分析数据的交互式数据查看器：https://biological.crick.ac.uk/ENS)。此外，基因本体（GO）术语在Cherry中得到了丰富⁺核人口与神经系统发育和功能相关(图2——补充图1C-E)。最后，樱桃的直接比较⁺7只dpf幼虫肠道神经元转录谱数据集Tg（pho2b:EGFP）^周37转基因(Roy Carson等人，2017)，确定了一大批共享基因（包括phox2bb公司,转塔,弹性体3,elavl4型,贵宾,国家计量单位)这大概反映了混合樱桃的神经成分⁺核人口(图2C、黄色圆点、，图2——图补1F和补充文件2).

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图2。

成年斑马鱼ENS的转录组分析。

(A类)成人ENS核分离的实验策略Tg（sox10:Cre；樱桃）肠道和核RNAseq。每个条件下进行五次生物复制。(B类)火山图显示平均对数₂折叠变化（x轴）和重要性（-log₁₀樱桃差异表达基因的调整p值（y轴）⁺相对于Cherry^-核。ENS的基因特征以红色突出显示，在樱桃中更为丰富⁺核，而具有非神经外胚层谱系特征的基因，如平滑肌（紫色）、Cajal间质细胞（绿色）和免疫相关（蓝色），在樱桃中更为丰富^-核。(C类)火山图（如图B所示），其中基因先前在幼体ENS神经元的转录特征中确定(Roy Carson等人，2017)以黄色显示。这些包括已建立的神经元标记物，例如phox2bb公司,转塔,弹性体3,elavl4型,贵宾、和国家计量单位樱桃中富含基因⁺幼虫ENS神经元转录组中缺失的核种群以黑色显示。这些包括sox10型,狐狸d3,sox2,第1页，哺乳动物同源基因由小鼠EGC表达，tfap2a，早期NC发育所需的基因，col28a1b其哺乳动物直系亲属是外周神经胶质标记ptprz1a型、和ptprz1b型已在胶质母细胞瘤干细胞中鉴定。padj<0.05的基因（Log₁₀p值<1.3）和/或对数₂FC<0以灰色显示。(D、 E类)荧光共焦图像就地使用探针进行杂交（RNAscope）sox10型(D类)和狐狸d3(E类)关于成年人Tg（sox10:Cre；樱桃）对Cherry（ENS谱系）和HuC/D（ENS神经元）的肠外肌层制剂进行免疫染色。两者的信号sox10型和狐狸d3（白色箭头）对应于非神经元细胞（樱桃⁺户口C/D^-，箭头），但肠道神经元（樱桃⁺户口C/D⁺，箭头）。(F类)成人免疫染色Tg（sox10:Cre；樱桃）内脏为Sox2（蓝色）、Cherry（红色）和HuC/D（绿色）。Sox2由非神经元ENS细胞特异表达。生物复制品：D，n=4；E、 n=6；F、 n=5。所有共焦图像都是短共焦叠加的最大投影。合并面板中显示的10µm比例尺。

图2——图补充1。

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成年斑马鱼ENS细胞核的转录谱确定了神经元和胶质细胞的图谱。

(A类)显示成人外肌层细胞核的典型FACS图Tg（sox10:Cre；樱桃）斑马鱼内脏在单个完整的DAPI上⁺核。m樱桃色⁺收集到的细胞核不到初始种群的1%。等效数量的mCherry^-还收集了细胞核。(B类)成人肠道转录组的主成分分析揭示了Cherry对样本的分离⁺vs.樱桃^-表达（30%的变异性在PC1中解释，13%在PC2中解释）。每种条件的五个生物复制。(C–H型)樱桃成虫肠道分析⁺vs樱桃^-转录组数据与先前公布的数据和公开可用的参考数据进行比较。成年肠樱桃⁺vs樱桃^-转录组数据(补充文件1)过滤以选择对数倍数变化>0的基因（在Cherry中⁺vs樱桃^-)p值<0.05。结果集丰富了具有统计学意义的斑马鱼ENS相关基因。(C类)基因集富集分析表明，GO生物过程在樱桃中富集⁺人群包括神经系统相关术语。(D–E)代表性基因集的富集图(D类)突触信号和(E类)樱桃中神经元细胞间黏附丰富⁺样品。(F类)聚类热图显示了斑马鱼幼体ENS神经元中丰富的基因列表的表达（来自Roy Carson等人，2017)这在我们的成年斑马鱼肠道转录组数据中进行了分析。我们观察到，超过750个神经表达基因在樱桃中富集⁺与樱桃相关的样品^-样品(补充文件2)这些是候选的成年ENS神经元相关基因。这些包括phox2bb公司,phox2a型,转塔,弹性体3,elavl4型,贵宾、和国家计量单位(G公司)聚类热图显示哺乳动物Plp1中富集的前25个基因⁺胶质细胞(Rao等人，2015年)具有斑马鱼直系同源物，并且在Cherry中上调⁺vs樱桃^-样本，揭示了九个候选斑马鱼ENS胶质细胞相关基因。跨谱比较（斑马鱼到老鼠）利用公开可用的同源性分配资源（参见方法）。(H（H）)聚类热图显示去除与斑马鱼ENS神经元相关的基因后，成年斑马鱼的ENS转录组中的基因表达（见上文C部分）。鉴定出600多个独特基因(补充文件6)，是候选的成年ENS非神经元或ENS胶质细胞相关基因。这些包括sox10型,狐狸d3,tfap2a公司,sox2,col28a1b类,plp1b,ptprz1a型和ptprz1b型.

图2——图补充2。

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斑马鱼ENS转录组与小鼠ENS神经元和ENS胶质细胞的单细胞转录组数据集的比较。

(A类)显示樱桃差异表达基因对数2倍变化的散点图⁺和樱桃^-本文中提出的成年斑马鱼体转录组研究中的样本（X轴），以及Zeisel及其同事发布的已发表单细胞数据集中小鼠ENS神经元和ENS胶质细胞差异表达基因的对数倍变化(Zeisel等人，2018年)（Y轴）。中的完整数据补充文件3（另请参见方法和图2——补充图3)。在右下象限中可以找到Cherry+中的基因和小鼠神经元中的基因，示例基因以红色突出显示。在右上象限中，可以找到Cherly+中和小鼠胶质细胞中的基因。示例基因以绿色突出显示。(B类)聚类热图显示了在本研究的成年斑马鱼肠道转录组数据中分析的小鼠ENS神经元中富集的366个基因列表（logFC>0.2小鼠神经元vs.胶质细胞），其斑马鱼同源基因在樱桃+种群中富集（logFC>0，p值≤0.05）。选择显示的基因（完整的基因列表和相应的数据显示在补充文件4)。(C类)聚类热图显示了在本研究的成年斑马鱼肠道转录组数据中分析的富含小鼠ENS胶质细胞的63个基因列表（logFC>0.2小鼠胶质细胞vs.神经元），其斑马鱼同源基因在樱桃+种群中富集（logFC>0，p值≤0.05）（完整的基因列表和相应数据显示在补充文件5).

图2——补充图3。

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查询小鼠单细胞转录组数据集，以确定小鼠ENS神经元和ENS胶质细胞的特征基因。

使用小鼠单细胞转录组数据Zeisel等人，2018年，从Linnarsson实验室网站下载(https://storage.googleapis.com/linnarson-lab-lom/l1_enteric.loom)，数据按照方法一节中的描述进行处理，以确定主要是神经元和胶质细胞簇之间的差异基因表达。UMAP中显示的集群(A类)被标记为神经或胶质(B类)基于已知神经表达基因Elavl3、Elavl4、Prph的表达(C类)或已知胶质细胞表达基因Sox10、S100b和Gfap(D类)。(E类)对增殖特征基因的检查（此处以Top2A和Ki67为例）表明簇5富含增殖性ENS胶质细胞。(F类)第五组包含约300个细胞，占数据集分析中约15000个胶质细胞的1.9%。这对应于原始基因中确定的增殖性ENS胶质簇ENTG1Zeisel等人，2018年出版物，占ENS胶质细胞的1.6%。

为了确定斑马鱼ENS非神经元室表达的基因，我们接下来比较了樱桃⁺最近报告的小鼠EGC转录组的数据集，其中列出了PLP1中25个最高表达的基因⁺肠胶质细胞(Rao等人，2015年)。此列表中几个基因的斑马鱼同源基因在樱桃中富集⁺转录组(图2——图补充1G)，表明它们由斑马鱼ENS的非神经元细胞表达sox10型,狐狸d3和第1页，在哺乳动物中由早期NC细胞和ENS祖细胞表达，并维持在肠神经胶质细胞中(Dyachuk等人，2014年;Hari等人，2012年;蒙代尔和拉博斯基，2011年;蒙代尔等人，2012年;Weider和Wegner，2017年)以及与胶质细胞建立联系的基因，如柱28a1(Grimal等人，2010年),ptprz1a型和ptprz1b型(Fujikawa等人，2017年)。在类似的策略中，我们还比较了Cherry⁺小鼠ENS神经元和胶质细胞的单细胞转录组数据集(Zeisel等人，2018年)。我们已经从这个小鼠数据集中鉴定了小鼠ENS胶质细胞和神经元之间差异表达的基因，并确定了它们的斑马鱼同源基因(补充文件3)。我们发现，366只小鼠ENS神经元富集基因在斑马鱼樱桃中存在同源序列⁺转录组数据集，包括弹性体3,elavl4型,prph值、和phox2bb公司，很可能反映了我们大量数据集的神经元成分(图2-图补充2A，B,补充文件4)。我们还发现63个小鼠ENS胶质细胞富集基因在斑马鱼樱桃中存在同源序列⁺数据集，表明这些胶质表达基因在斑马鱼ENS的非神经元成分中检测到(图2-图补充2A、C,补充文件5)，包括sox10型,狐狸d3,plp1b和额外的神经嵴标记斑马线2b(Delalande等人，2008年),sox2，由小鼠ENS祖细胞和成年EGC表达(Belkind-Gerson等人，2017年;Heanue和Pachnis，2011年)和CNS胶质细胞相关基因维姆(邓等人，2013)。值得注意的是，我们没有观察到典型的胶质标记物绿色食品添加剂,100亿英镑和工厂7a/b在这些基因中，与免疫染色分析未能检测到这些标记的表达一致(图1F、G和图1——补充图1Q、R)尽管我们不能排除通过对单个细胞进行深度测序来揭示此类标记的可能性。在确定与斑马鱼ENS非神经元成分相关的基因的最终策略中，我们采用了一种不依赖于跨物种比较的策略。描述了樱桃的神经成分⁺转录组(图2C、黄色圆点和图2——图补1F)，我们删除了这组基因，以丰富非神经元ENS细胞室的转录物(图2C，黑点，图2——图补充1H和补充文件6）。这一策略突出了我们先前分析确定的几个基因，包括sox10型和狐狸d3。还发现了许多其他基因，包括tfap2a公司，早期NC细胞所需的基因(Knight等人，2003年;Wang等人，2011年a)、和sox2.的表达式sox10型,狐狸d3和sox2在斑马鱼的非神经元隔室中，通过复合荧光验证了ENS就地HuC/D免疫染色杂交（RNAscope）和Cherry报告人对成人肠道外肌层的制备Tg（sox10:Cre；樱桃）斑马鱼(图2D-F)。总之，这些实验表明，尽管我们未能检测到常用EGC标记的表达，但斑马鱼ENS和哺乳动物肠神经胶质细胞的非神经元室转录本有相当大的重叠，包括与早期NC细胞和ENS祖细胞相关的基因。

成年斑马鱼ENS中的非神经细胞表达Notch活性报告Tg（her4.3:EGFP）

在哺乳动物中，Notch信号通过减弱ENS祖细胞的细胞自主神经原程序促进肠神经胶质生成(冈村和佐贺，2008年)，但Notch靶基因在成人EGC中的表达尚不清楚。此外，转基因Notch活性报告Tg（her4.3:EGFP）（参见该转基因命名的材料和方法）标记斑马鱼大脑中的神经干细胞和神经祖细胞(阿鲁尼和巴利·库伊夫，2016年;Yeo等人，2007年)。鉴于ENS的非神经元成分似乎富含祖细胞标记，以及我们希望找到合适的转基因工具以促进进一步研究，我们已经检查了Notch活性报告子Tg（her4.3:EGFP）在斑马鱼ENS的非神经元细胞中也观察到。我们检测了成年肠道中的Tg（her4.3:EGFP）表达细胞。该分析确定了GFP网络⁺肠外肌层中与肠神经元及其投射密切相关的细胞(图3A和图3——图补充1A)。提供直接证据Tg（her4.3:EGFP）表达细胞是ENS的组成部分，我们引入了her4.3:EGFP（EGFP）转基因进入Tg（sox10:Cre；樱桃）成人遗传背景和免疫染色肠道制剂Tg（her4.3:EGFP；sox10:Cre；樱桃）用于GFP、HuC/D和Cherry的动物。如预期，GFP⁺细胞对HuC/D呈阴性，但Cherry报告员表达(图3C)表明它们属于ENS的非神经元室⁺共表达细胞sox2和sox10型(图3D，E)，通过转录组学分析确定为斑马鱼ENS非神经元室表达的基因。我们观察到非神经元成分的异质性：而Sox2在GFP中广泛表达⁺户口C/D^-细胞数量Tg（her4.3:EGFP；sox10:Cre；樱桃）组织，狐狸d3仅以GFP的一部分表达⁺户口C/D^-/Sox2系统⁺单元格(图3F)。GFP⁺户口C/D^-细胞数量Tg（her4.3:EGFP；sox10:Cre；樱桃）约占所有樱桃的四分之一（24.20±5.18%）⁺ENS细胞，但樱桃为12.93±5.33%⁺细胞GFP和HuC/D均为阴性（樱桃⁺GFP公司^-户口C/D^-) (图3B)。因此，成年斑马鱼肠道中的大多数非神经元ENS细胞可以通过Notch活性报告基因的表达来鉴定Tg（her4.3:EGFP）.

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图3。

这个her4.3:EGFP（EGFP）转基因是成年斑马鱼ENS中非神经元细胞群的一种新标记。

(A类)成人共焦图像Tg（her4.3:EGFP）斑马鱼肠道GFP（绿色）和HuC/D（红色）免疫染色。插图是框状区域的高倍放大图，显示GFP⁺单元格（箭头）与HuC/D密切相关⁺神经元（箭头）（n=70）。(B类)神经元定量（樱桃⁺户口C/D⁺GFP公司^-，蓝色）和非神经元细胞群（Cherry⁺户口C/D^-GFP公司⁺和樱桃⁺户口C/D^-GFP公司^-，分别为绿色和红色）Tg（her4.3:EGFP；sox10:Cre；樱桃）斑马鱼（n=3）。数据以平均值±SD表示。(C类)成人ENS共焦图像Tg（her4.3:EGFP；sox10:Cre；樱桃）斑马鱼的樱桃（红色）、GFP（绿色）和HuC/D（青色）免疫染色。注意Cherry的存在⁺户口C/D^-GFP公司⁺（箭头）和樱桃⁺户口C/D^-GFP公司^-（灰色箭头）细胞以及樱桃的存在⁺户口C/D⁺GFP公司^-神经元（白色箭头）（n=3）。注意Cherry⁺Cherry的细胞核大小相等⁺户口C/D^-GFP公司⁺（箭头），樱桃⁺户口C/D^-GFP公司^-（灰色箭头）单元格和樱桃⁺户口C/D⁺GFP公司^-神经元（白色箭头）。(D类)成人免疫染色Tg（her4.3:EGFP；sox10:Cre；樱桃）带有樱桃（红色）、GFP（绿色）和Sox2（蓝色）抗体的肠道。箭头指向表达所有三种标记物的细胞（n=3）。(E类)RNAscope分析转塔（红色）和sox10型（白色）成人ENS制剂Tg（her4.3:EGFP）)斑马鱼肠道GFP免疫染色（绿色）。注意GFP⁺单元格（箭头）表示sox10型和发现于附近转塔⁺GFP公司^-肠神经元（灰色箭头）（n=4）。(F类)组合RNA范围狐狸3成人GFP、Cherry和Sox2免疫染色Tg（her4.3:EGFP；sox10:Cre；樱桃）直觉表明狐狸d3和Sox2在一些ENS细胞（白色箭头）和其他GFP中共同表达⁺单元格仅表示Sox2（灰色箭头）。所有共焦图像都是短共焦叠加的最大投影。合并面板中的比例尺：(A类)50微米(C–E类)10微米。

图3——图补充1。

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Her4.3GFP转基因细胞系鉴定出具有成人ENS中EGC不同亚型形态的细胞。

成人肠道的免疫组织化学Tg（her4.3:EGFP）允许表征GFP的细胞形态⁺细胞及其与哺乳动物EGC亚型的比较(Boesmans等人，2015年)。(A类)GFP表达细胞（绿色）与神经元密切相关，神经元在细胞体中表达HuC/D，在细胞过程中表达AcTu（红色）（n=70）。插图显示框状区域的高倍视图，标记神经元（星号）、GFP表达（箭头）和高度分支的GFP表达细胞过程（箭头）。(B–E类)在Tg（her4.3:EGFP）⁺单元格：(B类)GFP公司⁺肌层（箭头）中的细胞，其突起似乎包裹在HuC/D周围⁺细胞体（红色，星号），类似于I型哺乳动物EGCs（插图）(C类)GFP公司⁺肌间层（箭头）中的细胞具有沿着AcTu延伸的细长突起（箭头）⁺神经元突起（红色），类似于II型哺乳动物EGC（插图）(D类)GFP公司⁺靠近粘膜层（箭头）的细胞，如粘膜上皮（ep，DAPI突出显示的细胞核为灰色），类似于哺乳动物III型EGC（插图），以及(E类)双极GFP⁺肌肉层（箭头）内的细胞，与AcTu相关⁺神经元纤维（红色，箭头），类似于IV型哺乳动物EGC（插图）。插图改编自Boesmans等人，2015年所有共焦图像都是短共焦叠加的最大投影。合并面板中的比例尺：50µm(A类)和10µm(B–E类).

GFP公司⁺成人ENS中的细胞Tg（her4.3:EGFP）斑马鱼具有哺乳动物EGC的形态特征

提供证据证明Tg（her4.3:EGFP）斑马鱼ENS中的表达细胞相当于哺乳动物EGC，我们对GFP的形态进行了表征⁺肠道中的细胞Tg（her4.3:EGFP）转基因。在光学显微镜水平GFP⁺细胞高度分支，分为四个形态组，通常对应小鼠EGC的四种形态亚型（I-IV型）(图3——补充图1B-E;Boesmans等人，2015年;Gulbransen和Sharkey，2012年)。虽然斑马鱼ENS缺乏哺乳动物系统中发现的独特神经节，但GFP的存在⁺肌层细胞，与HuC/D密切相关⁺单元，HuC/D周围有多个进程⁺细胞体，令人想起I型哺乳动物EGC(图3——补充图1B;哈纳尼和赖森巴赫，1994年;Boesmans等人，2015年)。此外，细长的GFP⁺肌层中的细胞，以及沿着AcTu的细胞体和过程⁺神经元细胞过程与II型哺乳动物EGC表现出明显的相似性(图3——补充图1C;哈纳尼和赖森巴赫，1994年;Boesmans等人，2015年)。GFP公司⁺在靠近肠上皮的粘膜中也发现了细胞(图3-图补充1D)类似于位于哺乳动物肠道固有层内的III型粘膜EGC(Boesmans等人，2015年;Kabouridis等人，2015年)。最后，双极性GFP⁺平滑肌层内发现的与AcTu相关的细胞⁺神经元纤维让人想起IV型哺乳动物神经胶质(图3——图补充1E;Boesmans等人，2015年).

哺乳动物EGC具有独特的超微结构特征，并与肠道神经元及其投射物建立了特征性接触(Gabella，1972年;加贝拉，1981年)。确定GFP是否显示类似特征⁺ENS细胞群Tg（her4.3:EGFP）斑马鱼，我们分析了EGFP⁺中的单元格Tg（her4.3:EGFP；SAGFF217B；UAS:mmCherry）使用CLEM的转基因(缪勒·赖歇特（Müller-Reichert）和维卡德（Verkade），2012年)。在这些动物中，EGFP标记非神经元ENS细胞，而Cherry则由二进制报告器驱动Tg（SAGFF217B；UAS:mm樱桃色）(Kawakami等人，2010年)，标记肠神经元的子集(图4——图补充1A)。CLEM证实了EGFP的密切联系⁺肠神经元细胞及其投射(图4,图4——补充图1B、C和视频1)。EGFP产生的过程⁺细胞可延伸至18µm并直接接触肠神经元(图4B、D和图4——补充图1C)，但与哺乳动物EGC相似(加贝拉，1981年)它们并没有在神经元胞体周围形成完整的“胶囊”，使大部分肠神经元与邻近细胞直接接触(图4A、B,图4——补充图1C和视频1)。EGFP公司⁺细胞也延伸出复杂的片状延伸，通常将紧密排列的神经投射束包围和/或细分为扇区(图4D,图4——补充图1C和视频1)。细胞质和深核细胞缺乏，哺乳动物EGC和其他外周神经胶质细胞群的特征(加贝拉，1981年)也在EGFP的细胞核中发现⁺单元格(图4B、D和图4——补充图1C).

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图4。

her4.3:EGFP（EGFP）成年斑马鱼ENS中的表达细胞具有哺乳动物肠神经胶质细胞的超微结构特征。

(A和C)电子显微照片（z-stack#903英寸A类和#1039英寸C类)来自成人中肠的3D感兴趣区域Tg（her4.3:EGFP；SAGFF217；UAS:mmCherry）斑马鱼。插图显示了EGFP的超分辨率光学显微镜图像⁺非神经元细胞与mmCherry⁺对应于电子显微照片中方框区域的神经元。EGFP⁺细胞体大小约为79.6µm^三(A类)和~79.1µm^三(C类)投影长度从4µm的片状工艺到18µm以下的较长延伸段不等。相比之下，mmCherry⁺神经元的胞体大小约为398.8µm^三(A类（左）和229.7µm^三(A类，右侧），投影长度范围为16µm至55µm。(B和D)方框区域的高分辨率图像，如A所示(B类)和C(D类)。EGFP⁺细胞为绿色，肠神经元为红色。黑色箭头表示EGFP之间的接触点⁺流程和mmCherry⁺神经元。黄色箭头表示GFP⁺分隔轴突束的片状延伸（白色星号）。EGFP细胞核中的核沟纹⁺单元格用黑色箭头表示。从两名成年人身上扫描的六个感兴趣区域的代表性图像。所有图像都是一个z平面。比例尺：10µm(A、 C类和插图A、 C类)和1µm(B、 D类).

图4——图补充1。

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相关光电子显微镜鉴别成人胶质样特征Tg（her4.3:EGFP）表达细胞。

(A类)在成年斑马鱼中，HuC/D的一个亚群⁺ENS神经元（绿色）突出显示为Tg（SAGFF217；无人机系统：mmCherry）樱桃表达（红色，箭头）充满了细胞体和丰富的表达细胞过程（红色）。HuC/D上的剩余比例⁺单元格（绿色）不表示樱桃（箭头）（n=12）。共焦图像是短共焦叠加的最大投影。(B类)成人切片的电子显微镜图像Tg（her4.3:EGFP；SAGFF217；UAS:mmCherry）显示有组织层的肠道，假彩色以描绘GFP的位置⁺如插图所示的超分辨率图像中显示的单元格。注意这部分的神经元和轴突不是樱桃⁺神经元。图像描述了单个z平面。(C类)框状区域的高倍视图，显示了分离轴突束的锯齿状核（箭头）和放射状延伸（黄色箭头，星号表示轴突束），以及许多与神经元细胞体接触的神经元细胞体（用N表示神经元细胞体）。EGFP⁺细胞体大小为79.1µm^三最长投影长度为9µm。从两名成年人身上扫描的六个感兴趣区域的代表性图像。比例尺：10µm(A、 B类)和1µm(C类).

综上所述，我们表明，与哺乳动物EGC一样her4.3:EGFP（EGFP）⁺该群体与ENS神经元有着共同的谱系，发现于与ENS神经元密切相关的肌间层内，具有令人想起四种类型哺乳动物EGC的独特形态，具有哺乳动物ENS神经胶质的超微结构特征，并表达多种公认的哺乳动物EGC标记物。证据的分量使我们得出结论her4.3:EGFP（EGFP）⁺细胞构成斑马鱼EGC种群，因此现在将其定义为EGC种群。从今往后，我们将提及Tg（her4.3:EGFP）将成年斑马鱼ENS中的细胞表达为EGC。

斑马鱼EGC的发育概况

为了检测斑马鱼EGC的发育情况，我们对其进行了免疫染色Tg（her4.3:EGFP；SAGFF234A；UAS:mmCherry）GFP和樱桃在不同发育阶段的转基因。受精后54小时（hpf），NC细胞衍生樱桃的阶段⁺细胞沿着肠道局限于两个不同的迁移柱(Heanue等人，2016a)，无双重阳性（樱桃色⁺GFP公司⁺)细胞被鉴定(图5——图补充1A)。然而，在60 hpf时，少量GFP⁺樱桃中的细胞是可以辨认的⁺NC单元流(图5——补充图1B)在4只dpf幼虫中变得更加丰富(图5——补充图1C)。进一步研究GFP的发育动力学⁺细胞谱系，我们对活细胞进行了延时共聚焦显微镜检查Tg（her4.3:EGFP；SAGFF234A；UAS:毫米樱桃）处于相似阶段的胚胎。影像开始于56 hpf，mmCherry的迁移锋⁺位于视野前端的NC单元格列(Heanue等人，2016a)并持续40小时（每10分钟1张图像）。与固定胚胎的分析一致，没有EGFP⁺在mmCherry内发现了细胞⁺成像头几个小时内的人口(图5A)。然而，EGFP⁺细胞出现在mmCherry柱内⁺约62 hpf的电池(图5B)，位于迁移mmCherry前端后90µm以上⁺NC细胞和EGFP的数量⁺细胞在剩余的成像期内增加(图5C、D;视频2)。有几次，我们发现了个人mmCherry⁺诱导EGFP从头表达的细胞(视频3)。EGFP公司⁺以吻-尾序列出现的细胞反映了ENS神经元成熟的波(Heanue等人，2016年b)但它们几乎总是位于迁移的肠道NC细胞的前面。相对于mmCherry的尖端⁺迁移柱以恒定的速度向尾部移动，直到到达FOV的尾端，EGFP⁺细胞平均表现出最小的口直肠移位(图5E; 132埃及镑⁺四条鱼的细胞分析），表明在ENS发育期间her4.3:EGFP（EGFP）转基因在迁移后的细胞中表达。

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图5。

实时成像Tg（her4.3:EGFP）⁺发育中的斑马鱼ENS的细胞个体发生。

(A–D)定时录制的静态图像Tg（her4.3:EGFP；SAGFF234A；UAS:mmCherry）胚胎成像从56 hpf（表示为00:00）到96 hpf（40:00），这是n=18个生物复制的典型例子。00:00时(A类)mmCherry⁺NC细胞的波前（红色，红色箭头）位于视野（FOV）的嘴侧，没有EGFP⁺存在单元格（灰色）。05:30(B类)，第一个EGFP⁺mmCherry中出现单元格（灰色，箭头）⁺迁移波前后面的NC细胞柱（红色）。明亮GFP⁺黑素细胞被指定（灰色箭头）。(C类)在19:50，NC细胞柱延伸到整个FOV和EGFP的数量⁺单元格（灰色，箭头）增加。白色箭头指向EGFP⁺细胞呈现圆形形态，可以在随后的延时图像中看到分裂。越来越多的亮绿色荧光蛋白⁺黑素细胞出现（灰色箭头），在时间推移记录中相对静止。(D类)录制结束时（40:00），EGFP⁺细胞（灰色）可以在整个肠道中找到（白色箭头）。丰富明亮的GFP⁺黑素细胞存在于肠道区域（灰色箭头），其特征形态明显。(E类)mmCherry细胞位移的量化（与参考点/时间的归一化距离）⁺波前（红色）和EGFP⁺细胞（绿色），数据描述了四条鱼的132个细胞。数据以平均值±SD表示。所有共焦图像都是短共焦叠加的最大投影。50µm标尺，单位为A。

图5——图补充1。

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血统分析表明Tg（her4.3:EGFP）表达细胞来源于引起ENS的胚胎NC细胞群。

(A–C)分析使用Tg（her4.3:EGFP；SAGFF234A；UAS:mmCherry）允许her4.3:EGFP（EGFP）⁺与樱桃相关的待检查细胞⁺在发育过程中定居于肠道的迁移性NC细胞群。 (A类)54 hpf时，无GFP⁺细胞（绿色）存在于肠道中，在迁移的NC细胞群中未检测到任何细胞（红色），尽管NC细胞衍生的HuC/D⁺此时出现ENS神经元（蓝色）。装箱区域（n=30）的高倍视图中显示的单通道。(B类)在60 hpf时，在肠道定植的NC细胞流中可以看到少量弱表达GFP的细胞（绿色，箭头）（红色）。GFP公司⁺细胞靠近HuC/D⁺单元格（蓝色）。注意，可以检测到强烈表达GFP的细胞，但这些细胞不构成NC细胞迁移流的一部分（红色），位于肠道外（灰色箭头），很可能是黑素细胞（n=30）。单通道显示在方框区域的高倍视图中。(C类)在4 dpf时，在迁移的NC细胞流（红色）中发现GFP强表达细胞和弱表达细胞（绿色，箭头）数量增加。装箱区域（n=20）的高倍视图中显示的单通道。(D类)7 dpf时Tg（her4.3:EGFP）幼虫表达GFP的细胞（绿色、箭头）与HuC/D密切相关，但不同于HuC/D⁺阳性神经元（红色）（n=45）。偶尔可见HuC/D与表达低水平GFP（开放箭头）的细胞重叠。所有共焦图像都是短共焦叠加的最大投影。合并面板中的比例尺：50µm。

接下来，我们描述了79个EGFP的细胞分裂模式⁺在实时成像期间迁移到视野或重新出现的细胞。其中，37个细胞产生了至少一代GFP⁺后代。26个细胞（约33%）经历了单细胞分裂，产生了两个子细胞，其中许多在成像过程中失去了EGFP的表达。在这些情况下，表达EGFP的细胞没有迁移，EGFP表达减少，然后消失。在一定比例的细胞（8个细胞；~10%）中，在第一次分裂事件后，一个或两个子细胞进一步分裂，产生EGFP⁺孙女们，其中一些失去了记者的表情。对于3个细胞（约4%），在两次分裂事件后，一个孙女细胞进一步分裂以产生第三代EGFP⁺后代。总计53 EGFP⁺在成像期间，细胞经历了细胞分裂事件。因此，在开发过程中Tg（her4.3:EGFP）表达细胞能够进入细胞周期，但这样做的细胞仅经历有限数量的细胞分裂，其许多后代最终失去EGFP的表达。EGFP信号的丢失可能与神经元分化有关，因为我们偶尔在7 dpf的肠道中发现her4.3:EGFP（EGFP）HuC/D和GFP弱免疫染色的转基因幼虫细胞(图5-补充图1D)。综上所述，我们对Tg（her4.3:EGFP）斑马鱼发育过程中的表达表明，新生的EGC是迁移后的NC衍生细胞，具有增殖和神经生成潜能。

稳态过程中成年斑马鱼EGC的增殖和神经元分化

成年哺乳动物的肠神经胶质细胞通常处于静止状态，在任何给定的时间只有一小部分细胞进行细胞分裂(Joseph等人，2011年)。为了检测成年斑马鱼EGC的增殖潜力，我们对成年斑马鱼类的全套肠道制剂进行了免疫染色Tg（her4.3:EGFP）增殖标记物微染色体维持5（MCM5）的转基因(Ryu等人，2005年)。GFP的10.8±4.2%⁺MCM5阳性细胞(图6——图补充1)这表明，与哺乳动物相比，相当大比例的斑马鱼EGC在体内平衡期间循环。

我们早期观察到，EGFP表达细胞在ENS中的表达Tg（her4.3:EGFP）斑马鱼胚胎仅经历有限数量的细胞分裂，表明成年动物EGC的EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）标记可用于追踪增殖细胞的后代并确定其命运。与MCM5免疫染色一致，我们发现在3天EdU标记脉冲（t0）结束时，GFP的8.0±4.3%⁺3个月大婴儿肠道中的细胞her4.3:EGFP（EGFP）转基因斑马鱼与EdU共同标记(图6A、B和D)。MCM5的相似百分比⁺和EdU⁺细胞表明Tg（her4.3:EGFP）细胞代表一个基本静止的细胞群，分裂的细胞有较长的细胞周期。

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图6。

成人her4.3:EGFP的增殖和神经原性分化⁺ENS细胞在稳态过程中。

(A类)实验设计示意图。成人Tg（her4.3:EGFP）将斑马鱼浸入1mM EdU中三天，并在EdU脉冲后0（t0）、4（t4）或11（t11）天进行分析。(B–C类)在t0收获的EdU（红色）脉冲动物肠道的GFP（绿色）和HuC/D（蓝色）免疫染色(B类)和t4(C类)。箭头（B和C中）指向GFP⁺户口C/D^-教育部⁺细胞。箭头（C）表示GFP^-户口C/D⁺教育部⁺神经元。B-C合并面板中的10µm标尺。所有共焦图像都是短共焦叠加的最大投影。(D类)GFP百分比的量化⁺在t0、t4和t11用EdU标记的细胞（平均值±SD）。(E类)用生物复制品t0 n=6，t4 n=5，t11 n=5（平均值±标准差）量化t0，t4和t11处EdU标记的肠神经元百分比(F类)EdU标记HuC/D密度的计算分析策略⁺和EGFP⁺细胞。教育部⁺GFP公司⁺细胞位于半径和EdU密度增加的同心圆的中心⁺GFP公司⁺和EdU⁺户口C/D⁺计算每个圆内的细胞数。半径为40μm的圆（黄色）的示例以较高的放大倍数显示。(G公司)EdU的记录密度（红色图）和模拟密度（蓝色图）⁺户口C/D⁺和EdU⁺GFP公司⁺EdU周围半径（x轴）增大的同心圆中的单元格（y轴）⁺GFP公司⁺细胞。EdU随机分布的蒙特卡罗模拟⁺户口C/D⁺或EdU⁺GFP公司⁺每个数据集的细胞数执行了2000次以上，以确定随机混合人群中出现的基线密度。误差条表示平均±90%的置信区间。在所有分析的时间点，记录EdU的密度⁺户口C/D⁺和EdU⁺GFP公司⁺细胞位于20-60μm圆圈（用星号表示）中模拟密度的置信区间（bars）以上。(H、 我)EdU标记樱桃百分比的量化⁺户口C/D⁺神经元(H（H）)和樱桃⁺GFP公司^-户口C/D^-单元格(我)肠中t0、t4和t11her4.3:gfp；sox10:Cre；樱桃根据图A所示方案用EdU脉冲标记的转基因，具有生物重复：t0 n＝6；t4，n=5；t11 n=6（平均值±标准偏差）*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图6——图补充1。

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这个Tg（her4.3:EGFP）细胞在成人体内平衡状态下积极增殖。

(A类)成人Tg（her4.3:EGFP）斑马鱼扁平肠道免疫染色GFP（绿色）和细胞周期标记物MCM5（红色）。活跃增殖的GFP⁺MCM5型⁺在整个肠道内观察到细胞（箭头所示）。大多数GFP⁺人口保持静止（箭头）。共焦图像是短共焦叠加的最大投影。比例尺：合并面板中的10µm。(B类)GFP百分比的量化⁺MCM5型⁺细胞超过总GFP⁺种群（n=3）。数据以平均值±SD表示。

图6——图补充2。

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成人Tg（her4.3:EGFP）细胞吸收EdU并出现在双峰中。

(A类)实验设计示意图：浸泡3个月大的成人Tg（her4.3:EGFP）斑马鱼在1 mM EdU脉冲中生活三天，然后恢复正常的斑马鱼水。然后在0天（t0）、4天（t4）或11天（t11）的追逐期后将动物剔除，并分析EdU掺入情况（t0 n=6，t4 n=5，t11 n=5）。(B–D类)在0天追踪中，大多数EdU标记为GFP⁺（黄色）细胞位于双倍体中（两个贴有标签的细胞靠近）。这些单元格是：(B类)两者都表达高水平的GFP（绿色，箭头）(C类)出现一个高表达GFP的细胞（箭头）和一个低表达GFP的细胞（箭头）(D类)在较大的分组中，EdU标记与GFP表达水平较低的细胞相关（箭头），而在GFP高表达细胞中未观察到（箭头）。共焦图像是短共焦叠加的最大投影。合并面板中的比例尺：10µm(B–D类).

图6——图补充3。

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稳态条件下成年斑马鱼肠道神经胶质细胞作为神经祖细胞来源的工作模型。

鉴于两者之间的相似性Tg（her4.3:EGFP）⁺EGC和Tg（her4.3:EGFP）⁺RGC，我们建议，与RGC一样，EGC可能以两种形式存在：Tg（her4.3:EGFP）⁺静态电描记器（qEGCs）和Tg（her4.3:EGFP）⁺激活的EGC（aEGC），后者具有增殖性，在我们的实验中可以吸收EdU（用蓝色表示）。我们认为aEGC是一个自我更新的群体，也可能恢复到静止状态。增殖的aEGC群体可以产生肠神经前体细胞（eNP；致力于神经原谱系的细胞），这些细胞可以保留EdU，但Tg（her4.3:EGFP）^-并且还不能表达HuC/D。这些细胞与樱桃细胞相对应⁺GFP公司^-户口C/D^-教育部⁺细胞定量图6I在我们的实验的EdU标记期间增加。最后，神经祖细胞经历了完全的神经元分化（eN），可以用HuC/D检测，也可以用EdU检测⁺在我们的实验中。这些细胞与樱桃细胞相对应⁺GFP公司^-户口C/D⁺教育部⁺在中量化图6H在我们的EdU标记实验过程中，该值也会增加。

在这些实验中，大多数（GFP⁺教育部⁺)细胞形成由形态和GFP信号强度相似的细胞组成的双重结构(图6B和图6——补充图2B)。偶尔，双倍体中的一个或两个细胞表现出GFP信号减少(图6-图补充2C、D)这表明，与幼虫期相似，在成体中分裂EGC的子代her4.3:EGFP（EGFP）转基因斑马鱼分化为GFP^-肠神经元。EdU标记后4天（t4追逐）的鉴定支持了这一想法⁺包含GFP的双拷贝⁺户口C/D^-和GFP^-户口C/D⁺单元格(图6A，C)。细胞群分析也支持增殖的EGCs子代GFP信号的丢失，这表明EdU的百分比降低⁺GFP公司⁺细胞（t4:3.6±3.4%，p=6.01×10⁻⁷; t11:3.9±3.8%，p=7.61×10⁻⁶) (图6D)。有趣的是，教育程度的降低⁺GFP公司⁺EdU追逐期的细胞与EdU表征的伴随增加有关⁺t4时肠神经元（0.71±0.80%，p=6.0×10⁻⁷)和t11（0.70±0.82%，p=1.5×10⁻⁶)相对于t0（0.068±0.13%）(图6E)。总之，这些实验表明斑马鱼ENS中增殖EGC的后代在生理条件下可以分化为神经元。

为支持GFP之间的血统关系提供进一步证据⁺教育部⁺细胞和新生肠神经元（HuC/D⁺教育部⁺)，我们使用共焦显微镜和数学模型来估计这些细胞类型在以EdU为中心的半径增加的圆圈内的密度⁺单元格(图6F;Tay等人，2017年)。我们推断HuC/D更接近⁺教育部⁺和GFP⁺教育部⁺与线性无关细胞随机分布中预期的细胞相比，这些细胞可能是来自进行细胞分裂的共同祖细胞。将在t0、t4和t11观察到的密度与蒙特卡罗模拟随机生成的均匀分布细胞类型的值进行比较（>2×10^三每个采样时间）。该分析表明GFP的实际密度⁺教育部⁺和HuC/D⁺教育部⁺与偶然预期的细胞相比，较小半径圆圈内的细胞（距感兴趣细胞<60µm）明显更高，表明观察到的同型（GFP⁺教育部⁺/GFP公司⁺教育部⁺)和异型（GFP⁺教育部⁺/户口C/D⁺教育部⁺)EdU集群⁺ENS细胞是一种常见的增殖祖细胞的后代(图6G)。教育部^-细胞密度与随机混合群体的预期密度相似（数据未显示）。该分析进一步支持了增殖后代的观点Tg（her4.3:EGFP）表达ENS的细胞能够在成年斑马鱼的肠道中经历神经元分化。

接下来，我们考虑了GFP^-非神经元ENS细胞群(图3B)也源自GFP⁺前体细胞，代表神经源性承诺的中间阶段，其过程类似于GFP的分化⁺大脑皮层中的RGCsher4.3:EGFP（EGFP）转基因斑马鱼。为了检验这一点，我们将其标记为3个月大Tg（her4.3:EGFP；sox10:Cre；樱桃）EdU转基因(图6A)并在整个ENS谱系的背景下跟踪增殖EGC的后代。与我们之前的分析一致(图6E)EdU（Cherry）标记的肠神经元百分比⁺户口C/D⁺教育部⁺)在t4和t11时，t0相对较高（t0:0.021±0.15%；t4:0.28±1.2%，p=0.06；t11:0.37±0.95%，p=0.0014）(图6H)。有趣的是，这种增加与EdU标记的GFP百分比的增加相平行^-非神经元ENS细胞（樱桃⁺GFP公司^-户口C/D^-教育部⁺)在t4和t11，相对于t0（t0:0.12±0.5%；t4:3.7±12.5%，p=1.84×10⁻⁶; t11:4.1±15.5%，p=0.0024）(图6I)。这些研究表明Tg（her4.3:EGFP）增殖的EGC的子代中的表达可能反映了在显性神经元分化之前的神经原性承诺。

动物

所有动物实验均按照1986年《动物（科学程序）法案》（英国）和英国内政部的监管标准（项目许可证PCBBB9ABB）进行。实验方案由当地的弗朗西斯·克里克研究所动物福利和伦理审查机构（AWERB）批准。斑马鱼种群按照描述进行维护(Heanue等人，2016a;韦斯特菲尔德，2000年)。胚胎和幼虫按所述进行维护和分期(Heanue等人，2016a)如前所述，用于延时的胚胎在24 hpf的0.2 mM PTU中饲养，以抑制黑化(韦斯特菲尔德，2000年)。使用的转基因和突变系如下：玻璃钢（SAGFF234A）(Asakawa等人，2008年;Kawakami等人，2010年);Tg（UAS:GFP）(Kawakami等人，2010年),Tg（−4.7sox10:Cre）(罗德里格斯等人，2012年),Tg（β肌动蛋白-LoxP-STOP-LoxP-hmgb1-m樱桃）(Wang等人，2011年b),转塔^胡2846(Knight等人，2011年),Tg（gfap:GFP）(Bernardos和Raymond，2006年),Tg（千克）(−3.9嵌套：GFP) (Lam等人，2009年),Tg（her4.3:EGFP）(Yeo等人，2007年),Tg（SAGFF217B）(Kawakami等人，2010年)。请注意Tg（her4.3:EGFP）该名称是该转基因的当前ZFIN参考，但也有不同的名称Tg（her4:EGFP）(Yeo等人，2007年)或Tg（her4.1GFP）(克孜尔等人，2012年).her4.3（her4.3）是哺乳动物的6个（共9个）哺乳动物直系亲属之一赫斯5斑马鱼基因组23号染色体的串联重复(周等，2012)。马厩Tg（UAS:mmCherry）该系是由Tol2转基因产生的：如前所述，Tol2转座酶与含有Gal4识别序列UAS两个拷贝下游的膜mCherry（mmCherry）的构建体共同显微注射，具有双顺反子α晶体nP:RFP盒，可实现载体的红眼选择(Gerety等人，2013年)。基因分型是基于这些品系先前描述的不同荧光模式进行的，或者在出现Tg（ret^胡2846/+)，如上所述(Knight等人，2011年).

免疫组织化学

如前所述，对完整胚胎/幼虫或完整成人肠道和大脑进行免疫组织化学(Heanue等人，2016年b)。使用的主要抗体如下：HuC/D（小鼠，ThermoFisher A21272，1:200）、Cherry（山羊，在线抗体ABIN1440057，1:500）、GFP（小鸡，Abcam ab13970，1:1500）、S100β（兔子，Dako Z0311，1:500使用AcTu（小鼠，Sigma T6793，1:1000）、MCM5抗体（1:500，由德国海德堡马普医学研究所Soojin Ryu善意提供）和与AlexaFluor 405、488、568和647结合的适当二级抗体进行可视化（分子探针）。EdU是按照制造商的说明使用EdU Click-it工具包开发的，并与荧光灯Alexa555或Alexa647相结合({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“C10337”，“term_id”：“1535408”，“term_text”：“C10337”}}10337元和{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“C10339”，“term_id”：“1535410”，“term_text”：“C10339”}}10339元)。对于MCM5标记，需要进行抗原检索以暴露表位。简单地说，GFP免疫染色后，用柠檬酸缓冲液（pH 6.0）进行抗原回收。所有组织均用带有/不带有DAPI（分别为H1200/H1000）的Vectashide安装介质安装在Superfrost Plus载玻片上。在所有实验中，中枢神经系统区域（幼虫大脑和脊髓或成人大脑）提供阳性对照（即图1—补充图1J–O)阴性对照通过免疫染色提供，无一抗。免疫组织化学图像在Leica CM6000共焦显微镜或Olympus FV3000共焦显微镜上捕获，使用标准的激发和发射过滤器显示DAPI、Alexa Flour 405、Alexa-Flour 488、Alexa-Flour 568和Alexa Four 647。正交视图用于清楚地识别表示感兴趣标记的单元格。使用Adobe Photoshop 8处理的图像。

成人肠外肌层ENS细胞核的纯化

成人Tg（sox10:Cre；樱桃）首先解剖斑马鱼肠道，然后沿其长度切开，在37°C下浸泡在含有20 mM EDTA和1%青霉素/链霉素（ThermoFisher，15140122）的HBSS（无钙，无镁，（Thermo Fisher 14170088））中20–25分钟，直到观察到上皮细胞层开始与上覆的外肌层分离，HBSS溶液混浊明显。在PBS（ThermoFisher 14190094）中洗涤几次后，将组织置于解剖显微镜下，用镊子夹住外肌层并短暂搅拌以分离任何剩余的相关上皮细胞。将外肌移植到新鲜试管中，基本上按照所述进行细胞核纯化(Obata等人，2020年)。简单地说，在裂解缓冲液（250 mM蔗糖、25 mM KCl、5 mM MgCl₂，10 mM Tris缓冲液，pH8.0，0.1 mM DTT），含有0.1%Triton-X，cOmplete EDTA游离蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich）和DAPI。对匀浆进行过滤以去除碎屑，然后离心以获得含有外肌层细胞核的颗粒。在流式细胞术分析中，应用双分辨门控技术排除聚集的细胞核，并通过后续门控DAPI强度的面积和高度确定完整的细胞核。都是mCherry⁺和mCherry^-核种群（称为Cherry⁺和樱桃^-使用Aria Fusion细胞分选仪（BD Biosciences）直接收集到含有Trizol LS试剂（Invitrogen）的1.5 mL试管中。使用FlowJo软件10.6.1版对获得的FCS数据进行了进一步分析。对于每个复制，将来自平均30个成年肠道的分选细胞合并，其中含有约30000mCherry⁺或mCherry^-核人口。

RNA测序和生物信息分析

根据制造商的说明，使用PureLink RNA Micro Kit（Invitrogen#12183016）从细胞核群中分离RNA。使用Ovation RNA-Seq System V2（NuGen Technologies，Inc）生成双链全长cDNA。cDNA在Qubit 3.0荧光仪（Thermo Fisher Scientific，Inc）上定量，然后使用Covaris E220仪器（Covaris，Inc。然后将片段cDNA标准化为100 ng，并使用Ovation Ultralow System V2 1-96协议（NuGen Technologies，Inc）对文库进行测序。共使用8个PCR周期进行文库扩增。最终库的质量和数量通过TapeStation D1000 Assay（安捷伦科技公司）进行评估。然后将这些库标准化为4 nM，合并并加载到HiSeq4000（Illumina，Inc）上，以生成100 bp的配对读取。

生物信息学方法综述RNA-序列分析

在Illumina HiSeq 4000机器上进行测序。“修剪Galore！”实用程序版本0.4.2用于移除测序适配器，并在q参数设置为20时对单个读数进行质量微调(https://www.bioinformatics.abraham.ac.uk/projects/trim_galore网址/)。然后使用RSEM版本1.3.0将测序读数与斑马鱼基因组和转录组（Ensemble GRCz10 release-89）对齐(李和杜威，2011年)与2.5.2版STAR对准器结合使用(Dobin等人，2013年)。使用FASTQC 0.11.5版评估单个样本的测序质量(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)和RNA-SeQC版本1.1.8(DeLuca等人，2012年)。使用R-bioconductor软件包DESeq2版本1.14.1测定差异基因表达(Love等人，2014年; R开发核心团队，2008年)。R： 用于统计计算的语言和环境。R统计计算基金会，奥地利维也纳。ISBN 3-900051-07-0，URL(网址：http://www.R-project.org)。存放在NCBI Geo的数据({“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE145885”，“term_id”：“145885”}}GSE145885)。对于差异基因表达分析，在DESeq2 R包的背景下使用Wald检验和对数折叠收缩（DESeq2-function的参数“test”设置为“Wald”，参数“betaPrior”设置为‘TRUE’）(Love等人，2014年)。基因集富集分析（GSEA）按照Subramanian等人，2005年。为了将小鼠基因名转换为斑马鱼基因名，我们使用了Ensembl biomart工具(http://www.ensembl.org/biomart/martview).

RNA-Seq文献数据基因列表整合

为了将我们的转录组数据与公布的斑马鱼数据进行比较(Roy Carson等人，2017)，我们使用了本文中提供的基因列表（来自补充文件1)代表斑马鱼幼体ENS神经元转录组。将我们的数据与之前描述的哺乳动物ENS胶质细胞特征基因进行比较(Rao等人，2015年)，我们使用了Rao等人，2015年表1（表1富含PLP1的前25个基因⁺肠神经胶质细胞’），并手动处理斑马鱼的同源基因（参见补充文件7)。为了鉴定小鼠ENS神经元和ENS胶质细胞特征基因，我们从Zeisel等人，2018年具体来说，我们从以下位置下载了上述项目中肠道细胞的单细胞读取计数数据文件https://storage.googleapis.com/linnarson-lab-lom/l1_enteric.loom2019年11月12日。使用标准工作流使用Seurat包处理数据(Stuart等人，2019年)。FindClusters函数中的分辨率参数设置为0.3。根据特征基因Elavl3、Elavl4、Prph（神经元）、Sox10、S100b和Gfap（胶质细胞）鉴定神经和胶质细胞簇（参见图2——补充图3)。使用FindMarkers Seurat函数和MAST算法对总结的神经元和胶质细胞簇进行差异基因表达分析。

荧光就地杂交

成年斑马鱼肠道Tg（sox10:Cre；樱桃)或Tg（her4.3:EGFP）首先进行解剖，然后沿其长度进行切割，固定在护壁板上，在室温下浸泡在含有20 mM EDTA和1%青霉素/链霉素（ThermoFisher，15140122）的HBSS（Thermo Fisher 14170088）中20–25分钟，以分离上皮层。在PBS（ThermoFisher 14190094）中洗涤几次后，用镊子手动将上皮细胞梳理掉。在PBS中洗涤后，将4%PFA添加到带有钉住的纸巾的板中，在4°C下固定过夜。荧光就地然后根据制造商的规范，使用高级细胞诊断RNAscope荧光多路复用试剂盒（ACD#320850）进行杂交(Obata等人，2020年)。简单地说，组织在PBS中清洗，通过乙醇系列脱水，然后用RNAscope蛋白酶III孵育25分钟。组织在40°C的HybeOven中用定制探针孵育过夜(sox10型,狐狸d3,转塔)。第二天，按照制造商的说明，在40°C下用Wash Buffer冲洗组织两次，然后将其与前置放大器、适当的放大器DNA（Amp 1-FL、Amp 2-FL和Amp 3-FL）和适当的荧光团（Amp4 Alt A-FL/AltC-FL）杂交15–30分钟。然后对组织进行免疫组织化学处理，并直接安装在Superfrost Plus载玻片上（ThermoFisher Scientific#10149870），不使用DAPI（VectorLabs H1000）。图像在Leica CM6000共焦显微镜或Olympus FV3000共焦显微镜上捕获，具有用于可视化DAPI、Alexa Flour 405、Alexa Flour 488、Alexa Flour 568和Alexa Flour 647的标准激发和发射滤波器，以及用Adobe Photoshop 8处理的图像。

相关光和电子显微镜

从Tg（her4.3:EGFP；SAGFF217B；UAS:mmCherry）成年动物，并在4°C下在磷酸盐缓冲液（PB）中的4%甲醛0.1%戊二醛中固定过夜。随后，将肠道在徕卡振动棒上切至150µm，并将其储存在PB中2%的甲醛中。中段切片安装在SuperFrost Plus载玻片上的PB中，并使用带有AiryScan的倒置蔡司880共焦显微镜进行成像，使用EGFP和mmCherry的标准发射和激发滤波器。在每个包含至少一个EGFP的部分确定2-3个感兴趣区域（ROI）之前，使用20倍物镜获取低倍概览图像⁺感兴趣的单元格。使用ROI外的一个区域对Airyscan进行EGFP和mmCherry比对，在该区域识别出两个荧光团。Airyscan对准后，使用x63甘油物镜捕获ROI，根据奈奎斯特定理定义像素大小、z深度和缩放（>1.8 x）。对于超分辨率图像，在低倍镜下扫描两个成人中肠，以识别包含EGFP的六个感兴趣区域（ROI）⁺或者樱桃⁺细胞和拍摄的六张超分辨率图像。荧光显微镜完成后，将振动体切片进一步固定在2.5%戊二醛和4%甲醛的0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，并按照国家显微镜和成像研究中心的方法进行处理(Deerinck等人，2010年)三维EM的NCMIR方法：一种用于制备连续块扫描电子显微镜生物标本的新方案(https://ncmir.ucsd.edu/sbem协议)在Aclar塑料板之间平嵌之前。本文包含的CLEM分析来自于一个肠道切片，来自于该切片的两个原始ROI之一。该ROI包含六个GFP⁺细胞体和两个樱桃⁺细胞体。

SBF SEM数据采集和图像处理

使用连接到Sigma VP SEM（剑桥蔡司）的3View2XP（加利福尼亚州普莱森顿市加坦）收集连续块面扫描电子显微镜（SBF SEM）数据。使用导电环氧树脂（Circuitworks CW2400）切割扁平嵌入振动片并将其安装在引脚上。用玻璃刀将每块切片切至X和Y方向的最小尺寸，并抛光表面，露出组织，然后涂上一层2纳米的铂。使用3VBSED探测器在8192*8192像素处获得后向散射电子图像，驻留时间为6µs（报告的像素尺寸为10 nm，水平帧宽度为81.685µm），切片厚度为50 nm。SEM在5帕斯卡的腔室压力下运行，大电流模式无效。使用30µm孔径，加速电压为2.5 kV。共收集了1296张图像，深度为64.8µm，体积为432374µm^三.使用斐济进行下游图像处理(Schindelin等人，2012年)。首先将图像批量转换为8位tiff格式，然后使用高斯模糊（0.75像素半径）进行去噪，并使用两次反锐化掩模（10像素半径0.2强度，2像素半径0.4强度）进行重新锐化，以适应数据集的分辨率和图像特征。图像配准是使用“对齐虚拟堆栈切片”插件进行的，使用翻译模型进行特征提取和配准。校准对齐的图像堆栈的像素尺寸，并根据需要裁剪到感兴趣的单个区域。要生成两个卷的组合，请执行以下操作：Bigwarp(Bogovic JA等人，2015年;Russell等人，2017年)用于将荧光显微镜体积映射到电子显微镜体积中，电子显微镜体积在分辨率上降低到各向同性的50nm体素以减少计算负载。与之前的荧光显微镜相比，在电子显微镜样品处理过程中，发现组织的多层细胞成分导致了显著的非线性变形。从Bigwarp导出转换后的光学显微镜体积后，应用两像素高斯模糊，合并数据集，并调整亮度/对比度以用于屏幕显示。假彩色图像由Adobe Photoshop CC 2015.5中的单独半透明层注释组成，参考之前的荧光显微镜和图像堆栈中的三维上下文。只有能够通过明确标记的细胞体的体积清晰跟踪的过程才被着色。通过滚动CLEM体积时找到细胞体的最大X和Y范围，确定Z中细胞体的整个范围，并假设为椭球形状计算体积，从而确定细胞体的尺寸。通过CLEM卷尽可能跟踪细胞进程。如果在这个最远的距离上仍然可以看到与细胞体的直接连接，则在图像上可以追溯到细胞体的中部。如果没有明显的连接，特别是长距离延伸的情况，则以XYZ计算直线到细胞体的距离。

斑马鱼幼虫的延时成像

胚胎在0.2 mM PTU中培养，用0.15 mg/ml Tricaine轻度麻醉，然后安装到胚胎阵列中，并在胚胎培养基中覆盖0.6%的低熔点琼脂糖，基本如所述(Heanue等人，2016a;Megason，2009年)。设置好后，用含有0.15 mg/ml Tricane和0.15 M PTU的胚胎培养基覆盖模具，并至少每24小时更换一次。使用Leica CM6000共焦显微镜和20倍水浸物镜对幼虫进行成像。使用标准激发和发射滤波器来可视化EGFP和mmCherry的表达。对于每个胚胎，以602秒的帧速率收集33个z堆栈（z厚度2.014µm），持续40.333小时。使用斐济的MTrack2插件手动跟踪延时记录中的细胞。为了纠正成像过程中的生长或运动，为每只动物取一个参考点，作为视野中最前面的脊神经接触肠道的点。所有计算的距离都是相对于该参考点给出的。

EdU标签

为了标记增殖细胞，将成年斑马鱼以4斑马鱼/升的密度在含有1mM EdU（0.05%二甲基亚砜）的系统水中保持72小时。在追逐期间，成年斑马鱼被保存在系统水中，每2-3天更换一次。

数学建模

由于斑马鱼的ENS主要局限于肌间神经丛，因此斑马鱼ENS位于二维平面内，因此，后续分析仅使用X和Y坐标。每个图像覆盖450μm-450μm的区域，单个细胞的XY坐标被视为细胞核的中心，并从斐济的CellCounter插件获得。我们首先使用面积为450μm x 450μm的共焦图像，在每种感兴趣的细胞类型周围的几个距离处估计了特定标记细胞的密度。通过将圆内的细胞数除以图像中包含的圆的表面积，以半径增大的圆r∈（20，30，40，..，100，150，..，500μm）来估计细胞密度。当半径大于细胞到图像边缘的距离时，用蒙特卡罗模拟方法对与图像重叠的圆截面面积进行了数值估计。我们对每个共聚焦图像进行了50次蒙特卡罗模拟，观察到在450μm x 450μm平方面积上按照均匀分布重新排列位置的每个表型的细胞数。如上所述，对每个模拟的细胞密度进行了估算。为了比较记录的密度和模拟的密度，我们通过将伽马分布函数拟合到模拟值，在细胞同质性的假设下估计了模拟细胞密度的90%置信区间。当测量细胞密度的平均值超出90%置信区间时，观察到的空间位置被视为均质细胞混合物中的非偶然事件。

缺口抑制

用10µM浸液抑制缺口信号{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“LY411575”，“term_id”：“1257853995”，”term_text“：”LY411515“}}LY411575号（剑桥生物科学，16162）（0.04%二甲基亚砜），每2–3天更换一次，将对照斑马鱼与同等浓度的二甲基亚磺酸盐（0.04%）孵育。

我们感谢Laure Bally-Cuif、Alessandro Alluni和Emmanuel Than Trong提供Tg（her4.3:EGFP）转基因鱼类和专业知识，Donald Bell在延时成像实验中提供专家建议，Aquatics BRF工作人员从事鱼类养殖，流式细胞仪STP用于FACS细胞分类，高级测序设施STP用于文库准备和测序，Joe Brock用于科学插图。